CN103947614A - 一种抑制家蚕体内BmNPV病毒增殖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抑制家蚕体内BmNPV病毒增殖的方法，首先将纳米二氧化钛配置成浓度为4.5～5.5mg/L的添加剂溶液，再将溶液按照100kg桑叶添加1.0L溶液的使用剂量喷洒桑叶，晾干后添食家蚕，可以显著抑制家蚕体内BmNPV的扩增。本发明根据提过对家蚕添食纳米二氧化钛，抑制的BmNPV的扩增，可以为防治家蚕的BmNPV病提供理论支撑，所公开的方法食用性强、操作方便、效果显著，适合在我国蚕区推广应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种抑制家蚕体内病毒增殖的方法，具体涉及一种通过纳米粒子作用抑制家蚕体内BmNPV病毒增殖的方法。
背景技术
家蚕(Bombyx mori)是重要的经济昆虫，已经被驯化饲养5700余年，其产丝的性能得到了大幅度的提高，但其对病原的抗性较弱。近年来，由于养蚕的蚕期重叠，消毒不彻底，蚕病的发生率有所上升。
家蚕核型多角体病毒（BmNPV）是蚕病中发病率最高的一种，由于病毒在体外有多角体外壳保护，存在时间长，消毒难；另外由于该病的潜伏期长，一旦暴发就会造成蚕农重大损失。BmNPV病毒通常通过消化道进入蚕体，病毒粒子不断的增殖，造成蚕体的营养不足和组织损伤，直至蚕体死亡。
另一方面，纳米氧化物由于其独特的小尺寸效应、表面效应、量子尺寸效应及宏观量子隧道效应而具有优于常规粒子的热、磁、光敏感特性以及表面稳定性，从而应用于各个方面，如工业中的涂料和颜料领域，日常生活中的陶瓷、防晒化妆品及食品领域，环境治理中用于空气净化、污水处理和抗菌除毒领域。在纳米抗菌材料中抗菌剂以纳米尺寸分散，具有高比表面积和高反应活性，抗菌材料整体的抗菌效果较传统抗菌剂有显著提高，更能显著的抑制细菌、真菌等微生物的生长和繁殖，同时纳米氧化物高效的催化性能又可以促使化学毒剂降解。
但是现有技术中，未见关于纳米氧化物与家蚕体内病毒关系的报道；因此结合纳米材料的特性开发出一种低成本、见效快的抑制家蚕体内BmNPV病毒增殖的方法很有必要。
发明内容
本发明的目的是提供一种抑制家蚕体内BmNPV病毒增殖的方法，以促进蚕丝业的健康发展。
为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是：一种抑制家蚕体内BmNPV病毒增殖的方法，包括以下步骤：
(1) 添加剂溶液的配制：将纳米二氧化钛与水进行混合后配制成浓度为4.5～5.5mg/L的添加剂溶液；
(2) 添食家蚕：将步骤（1）中制备的添加剂溶液按照100kg桑叶添加1L溶液剂量喷洒适熟叶，待适熟叶晾干后连续添食家蚕3天即可抑制家蚕体内BmNPV的增殖。
上述技术方案中，所述纳米二氧化钛的粒径为1～100 nm。
优选的技术方案中，添加剂溶液的浓度为5.0mg/L 。
上述技术方案中，步骤（2）中的晾干为自然晾干；添食家蚕时的给桑量和平常使用量一样。
本发明结合家蚕的生理特征，开发了蚕用纳米添加剂；步骤（1）中制备的添加剂溶液在使用前充分混匀，按照100kg桑叶添加1.0L剂量均匀喷洒适熟叶，量少会影响使用效果，量高会增加使用成本；待适熟叶自然晾干后添食家蚕，避免食下水份过多，影响饲料的消化和吸收，给桑量和平常使用量一样；纳米添加剂可以和其他蚕药及添加剂混合使用，不用影响使用效果。
本发明通过给正常家蚕添食带有BmNPV病毒的适熟叶，一段时间后，通过测试家蚕对BmNPV病毒的抑制率来判断纳米二氧化钛的效果。具体为：先喂食家蚕带有纳米二氧化钛的适熟叶，再添食带有BmNPV病毒的适熟叶，采用血球计数板统计的每毫升添食溶液中含有的多角体数量来确定添加BmNPV病毒的浓度。每隔一段时间后，解剖家蚕取去除食物残渣的中肠，提取基因组DNA，以家蚕的Actin3基因组序列为内参，采用定量PCR方法检测BmNPV的相对拷贝数，计算出家蚕对BmNPV病毒的抑制率。
由于上述技术方案运用，本发明具有下列优点:
1．本发明首次利用纳米二氧化钛作为添加剂喂食家蚕以抑制家蚕体内家蚕核型多角体病毒BmNPV的增殖，效果显著，能够提高家蚕对BmNPV病毒的抗性，病毒抑制率达99.6450%；
2．本发明公开的方法中使用的添加剂用量少、来源广泛、成本低；无需改变生产规律，操作方便，易于推广应用。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述：
实施例一：一种抑制家蚕体内BmNPV增殖的方法
⑴材料及药品：
家蚕品种：苏秀×春丰，取得了江苏省蚕品种审定委员会颁发的蚕品种证书（苏审蚕201001），具有家蚕的基本共性。
药品：纳米二氧化钛（TiO2）为杭州万景新材料有限公司公司产品。
其他分子生物学试剂为生工生物工程（上海）股份有限公司产品。
⑵纳米二氧化钛的使用
取纳米二氧化钛与水混合配制成浓度为5.0 mg/L的添加剂溶液；使用前充分混匀添加剂，按照100 kg桑叶添加1.0L剂量进行喷洒各龄期的适熟叶，桑树品种为育711，待适熟叶晾干后连续添食家蚕3天，给桑量和平常使用量一样。
家蚕BmNPV病毒抑制率研究
⑶BmNPV病毒添食
将试验区（添食纳米二氧化钛）和对照区（添食水）各取400头家蚕备用，分别添食涂有浓度为1×107个/mL BmNPV溶液的桑叶1000克，采用血球计数板统计的每毫升添食溶液中含有的多角体数量来确定添加BmNPV病毒的浓度。待家蚕连续取食1小时后，清除剩余叶片，换正常桑叶进行常规饲养。
⑷样本提取
每隔24小时分别取试验区和对照区家蚕10头，解剖后取去除食物残渣的中肠置－80℃保存备用。
⑸基因组DNA的提取
将各样本分别存有液氮的研砵中充分磨碎，采用酚－氯仿方法提取基因组DNA。
⑹定量PCR引物的设定
根据定量PCR反应的要求，结合家蚕和BmNPV基因组信息，设定内参基因组引物Bmactin3-1（SEQ ID No.1:GTTATCTGACGAATGACTTTGT），Bm-actin3-2（SEQ ID No.2:CGGAGTCCAGCACGATA），目标基因引物BmNPV-gp64-1（SEQ ID No.3:TTCTTGACTCGGTGCTCG），BmNPV- gp64-2（SEQ ID No.4:GCTGCGTGTCTGCTCATT）。
⑺定量PCR反应
Real-time PCR 反应采用荧光染料SYBR Green Ⅰ在ABI Prism 7300 荧光定量PCR 仪上进行。PCR 反应体系( 总体积20 μL) : 2 × SYBR Premix Ex Taq 10 μL，10 μmol /L 上下游引物各0. 4 μL，50 × ROX Reference Dye 0. 4 μL，模板DNA 2. 0 μL，dH2O 6. 8 μL。PCR 程序: 50℃ 2 min; 95 ℃ 预变性1 min; 95 ℃ 15 s，60 ℃ 31 s，45 个循环；采集荧光信号，分析熔解曲线，每个样品重复3次。
⑺数据统计与分析
分别把含有BmNPV的家蚕中肠基因组DNA进行稀释10倍、100倍、1000倍和10000倍，按照J.H. Schefe公开的方法（参见：J.H. Schefe, K.E. Lehmann, I.R. Buschmann, T. Unger, H. Funke-Kaiser, Quantitative real-time RT-PCR data analysis: current concepts and the novel ‘‘gene expression’s CT difference’’ formula, Journal of Molecular Medicine 2006 (84)： 901–910）测定不同浓度的家蚕中肠基因组DNA溶液的Ct值，根据测定得的Ct值分别制定Bm-actin3和BmNPV-gp64的Y值和log值对应的标准曲线。根据各对照区和实验区家蚕样本测定的Ct值，经三组平均后，分别求出对应的log值，再根据2 －△△CT法求出对应的基因拷贝数，把gp64的基因组拷贝数和actin3基因组拷贝数的比值表示为BmNPV的相对拷贝数，相对拷贝数统计如表1。
表1 BmNPV相对拷贝数统计
| 时间（小时） | 对照处理 | 二氧化钛处理 | 抑制百分率（%） |
| 0 | 0.000186 | 0.000171 | 8.0645 |
| 24 | 0.001450 | 0.001291 | 10.9655 |
| 48 | 0.002540 | 0.002250 | 11.4173 |
| 72 | 0.223090 | 0.031970 | 85.6695 |
| 96 | 0.581840 | 0.075000 | 87.1099 |
| 120 | 0.550160 | 0.014180 | 97.4226 |
| 144 | 0.518340 | 0.001840 | 99.6450 |
注：以上数据均为3区的平均数据。
由表1可知，家蚕添食BmNPV后，96小时的病毒拷贝数最高，96小时后二氧化钛处理组的病毒抑制效果明显，病毒拷贝数下降明显，144小时的抑制率为99.6450%。
SEQUENCE LISTING
<110> 苏州大学
<120>一种抑制家蚕体内BmNPV病毒增殖的方法
<160> 4
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
GTTATCTGACGAATGACTTTGT 22
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
CGGAGTCCAGCACGATA 17
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
TTCTTGACTCGGTGCTCG 18
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
GCTGCGTGTCTGCTCATT 18
Claims (5)
1. 一种抑制家蚕体内BmNPV病毒增殖的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1) 添加剂溶液的配制：将纳米二氧化钛与水进行混合后配制成浓度为4.5～5.5mg/L的添加剂溶液；
(2) 添食家蚕：将步骤（1）中制备的添加剂溶液按照100kg桑叶添加1L溶液剂量喷洒适熟叶，待适熟叶晾干后连续添食家蚕3天，即可抑制家蚕体内BmNPV病毒的增殖。
2.根据权利要求1所述抑制家蚕体内BmNPV病毒增殖的方法，其特征在于：纳米二氧化钛的粒径为1～100 nm。
3.根据权利要求1所述抑制家蚕体内BmNPV病毒增殖的方法，其特征在于：添加剂溶液的浓度为5.0mg/L。
4.根据权利要求1所述抑制家蚕体内BmNPV病毒增殖的方法，其特征在于：步骤（2）中的晾干为室温下自然晾干。
5.根据权利要求1所述抑制家蚕体内BmNPV病毒增殖的方法，其特征在于：步骤（2）中添食家蚕时的给桑量和平常使用量一样。
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