CN103937852A - 一种基于分子印迹膜分离发酵耦合制备埃博霉素b的方法 - Google Patents

Abstract

一种基于分子印迹膜分离发酵耦合制备埃博霉素B的方法，经过前期发酵得到种子培养液，将种子培养液在发酵罐中进行发酵培养，在发酵过程中利用分子印迹膜对发酵液进行过滤，对过滤得到的物质进行洗脱，收集洗脱液，最后进行浓缩得到埃博霉素B。本发明利用发酵罐进行发酵生产埃博霉素B，并将分子印迹膜特异性吸附分离和发酵过程耦合，即在发酵生产埃博霉素B的同时，及时将代谢产物埃博霉素B分离出，使发酵罐中埃博霉素B的浓度维持在较低水平，从而减少反馈抑制和产物毒性，提高发酵产量；同时利用分子印迹膜专一性分离埃博霉素B，而不分离其它成分来降低下游分离纯化成本，有利于发酵液的后处理与产物的精制，在工业界有广阔的应用前景。

Description

一种基于分子印迹膜分离发酵耦合制备埃博霉素B的方法

技术领域

本发明属于发酵工程技术领域，具体涉及一种基于分子印迹膜分离发酵耦合制备埃博霉素B的方法。

背景技术

埃博霉素(epothilones)是微生物粘细菌纤维堆囊菌(Sorangiumcellulosum)产生的一类16元大环内酯次级代谢产物，具有微管蛋白聚合和微管稳定的作用，具体作用机制为促进GTP依赖性微管蛋白聚合形成微管和稳定微管；通过稳定微管组装过程抑制微管解聚，导致微管束排列异常，形成星状体，从而抑制细胞形成正常的纺缍体，干扰肿瘤细胞的生长，甚至诱导其死亡。最近研究表明，天然埃博霉素的活性比紫杉醇强10到1000多倍,对紫杉醇及其它抗癌药物有耐药性的癌细胞也具有非常高的活性；水溶性比紫杉醇更好，注射口服均可，结构简单，且具有较强的耐药性便于配制和使用,因此埃博霉素作为极具潜力的抗癌新药，引起了全世界的化学家，生物学家及药学家的极大兴趣和研究热情。目前已有一个埃博霉素药物(BMS-247550，Ixabepilone，用于卵巢癌的治疗)投放市场，另外至少还有六个埃博霉素药物(ABJ-879，Patupilone,BMS-310705,KOS-862，KOS-1584和ZK-EPO)在进行临床研究。埃博霉素有望成为取代紫杉醇的更为有效的抗肿瘤药物。现在发酵埃博霉素大都依靠在发酵液中添加大孔吸附树脂来进行提取分离，然而树脂对营养物质的非特异性吸附，给发酵过程中的优化和控制带来新的难题。

分子印迹膜(MIM)的研究最早开始于20世纪90年代，有报道通过光聚合的方法在溶剂中将3’,5’-环腺苷酸分子印迹膜接枝到聚偏氟乙烯超滤膜表面，制备出了对3’,5’-环腺苷酸分子具有识别特性的分子印迹复合膜。这种将MIPs对特定印迹分子的专一识别性与膜分离的操作简单、易于连续化、条件温和等特点结合起来，制备对特定印迹分子具有高选择性、大通量的分子印迹复合膜。分子印迹膜兼具有分子印迹和膜的特点，不需要研磨等制备过程，克服了膜技术中无法实现特定物质选择性分离的特点，实现了特异地将目标分子从混合物中分离纯化的目的。它将膜分离的可连续化操作特点与分子印迹技术进行了结合，是最有应用前景的一种膜分离技术。

目前还没有分子印迹膜应用于埃博霉素B的原位分离的研究报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于分子印迹膜分离发酵耦合制备埃博霉素B的方法，所制备的埃博霉素B提高发酵产量；同时利用分子印迹膜专一分离埃博霉素，而不分离其它成分来降低下游分离纯化成本。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

(1)前期发酵

菌种活化：将一支纤维堆囊菌接种到CNST培养基上活化，在培养基上放置灭菌的滤纸片，然后将放置有滤纸片的CNST培养基置于恒温培养箱中于28～32℃下培养5～7d；

种子培养：用接种环从CNST培养基上刮取降解了滤纸片的黄色菌落，接种到含有种子培养基的种子瓶中，置于巡回式摇床上，于28～32℃下培养2～3d，得到种子培养液；

(2)发酵培养：按每100mL接种5～10mL的比例将种子培养液接种于发酵罐中进行发酵培养，发酵培养温度为28～32℃，搅拌转速为100～150r/min，通气量为2.5～4.5L/min；

(3)分子印迹膜过滤除去埃博霉素B：待纤维堆囊菌在发酵罐中发酵72～120h后，将发酵罐中的发酵液持续通入到装有分子印迹膜的第一过滤装置中，进行过滤以分离出埃博霉素B，除去埃博霉素B的发酵液返回到发酵罐中继续发酵；

(4)补料：在发酵过程中，将灭菌的新鲜培养基加入到发酵罐中；

(5)埃博霉素B洗脱分离：发酵96～144h之后，对第一分离装置中分离出的埃博霉素B进行洗脱，并收集洗脱液，同时将发酵罐中的发酵液通入到装有分子印迹膜的第二过滤装置中，进行过滤以分离出埃博霉素B，除去埃博霉素B的发酵液返回到发酵罐中继续发酵；发酵120～168h后对第二分离装置中分离出的埃博霉素B进行洗脱，并收集洗脱液；整个发酵过程将发酵罐中的发酵液交替通入到第一分离装置和第二分离装置中，待发酵罐中的发酵液发酵15d后，停止发酵，最后合并收集的洗脱液，浓缩得到埃博霉素B。

所述CNST培养基的pH值为7.2～7.5，并于121℃下灭菌30min；CNST培养基中KNO₃为0.3～0.5g/L，Na₂HPO₄为0.25～0.30g/L，MgSO₄·7H₂O为1.0～1.5g/L，EDTA-Fe³⁺溶液为1～1.5mL/L，微量元素液浓度为1～1.5mL/L，琼脂为20～25g/L。

所述种子培养基的pH值为7.2～7.5，并于115℃下灭菌30min；种子培养基中土豆淀粉为7～9g/L、豆蛋白胨为2～3g/L、葡萄糖为2～3g/L、酵母粉为2～3g/L、MgSO₄为2～5g/L、CaCl₂为2～5g/L、EDTA-Fe³⁺溶液浓度为1～1.5mL/L。

所述分子印迹膜的制备方法如下：

以聚砜中空纤维超滤膜为基膜，埃博霉素为模板分子，甲基丙烯酸甲酯为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂，甲醇为溶剂，偶氮二异丁腈为引发剂，采用表面热聚合方法制备分子印迹膜。

分子印迹膜具体的制备过程为：

将10mmol的埃博霉素溶解于50mL甲醇-水的混合溶液中静置30min，加入40mmolα-甲基丙烯酰胺、200mmol季戊四醇三丙烯酸酯，振荡溶解10min，再加入60mg偶氮二异丁腈，超声脱气，反复冲入高纯氮气脱氧，保持惰性环境，以聚砜中空纤维超滤膜为基膜，在65℃下表面聚合48h，得到含模板分子的印迹膜；利用乙酸-甲醇-水的混合溶液做洗脱液，抽提24h，然后用体积比为4：1的甲醇、水的混合溶液反复洗脱掉模板分子，60℃恒温真空干燥24h，得到埃博霉素B的分子印迹膜；其中，甲醇与水的混合溶液中，甲醇与水的体积比为1:4；乙酸-甲醇-水的混合溶液中乙酸、甲醇、水的体积比为1：20：10。

所述发酵液与灭菌的新鲜培养基的pH值均为7.2～7.5，并于115℃下灭菌30min；发酵液中含有酵母粉20～50g/L、玉米淀粉5～10g/L、磷酸二氢钠1～2g/L、磷酸氢二钠1～2g/L、MgSO₄·7H₂O2～5g/L、FeSO₄·7H₂O0.1～0.5g/L、CaCl₂2～5g/L、MnCl₂0.1～0.5g/L和葡萄糖10～15g/L。

所述步骤(1)中的纤维堆囊菌为ATCC25532或ATCC25569；巡回式摇床的转速为180～200r/min。

所述步骤(2)发酵罐的装液量为60-75％。

所述步骤(3)中除去埃博霉素B的发酵液返回到发酵罐中的流速为1～5mL/min；在发酵过程中新鲜的灭菌培养基以1.0～5.0mL/min的速度泵入发酵罐内。

所述步骤(4)中洗脱均是先采用体积比为7:3～9:1甲醇与乙酸的混合物进行洗脱，再采用蒸馏水进行洗脱。

与现有技术相比，本发明具有的有益效果：本发明利用发酵罐进行发酵生产埃博霉素B，并将分子印迹膜特异性吸附分离和发酵过程耦合，即在发酵生产埃博霉素B的同时，及时将代谢产物埃博霉素B分离出，使发酵罐中埃博霉素B的浓度维持在较低水平，从而减少反馈抑制和产物毒性，提高发酵产量；同时利用分子印迹膜专一性分离埃博霉素B，而不分离其它成分来降低下游分离纯化成本，有利于发酵液的后处理与产物的精制，在工业界有广阔的应用前景。

附图说明

图1为本发明的流程示意图；

其中，1为补料罐，2为搅拌器，3为发酵罐，4为pH计，5-1为第一阀门，5-2为第二阀门，5-3为第三阀门，6为蠕动泵，7为流量计，8-1为第一过滤装置，8-2为第二过滤装置，9为洗脱溶剂罐，10为水罐，11为缓冲罐，12为蒸发器。

具体实施方式

下面结合附图结合实施例对本发明做进一步说明。

本发明中涉及到一种基于分子印迹膜分离发酵耦合制备埃博霉素B的装置，包括补料罐1、发酵罐3、第一过滤装置8-1、第二过滤装置8-2、洗脱溶剂罐9、水罐10、缓冲罐11和蒸发器12；其中，发酵罐3内设置有搅拌器2，发酵罐3的入口与补料罐1连通，发酵罐3的出口经第一阀门5-1、蠕动泵6、流量计7分别与第一过滤装置8-1、第二过滤装置8-2的入口相连通，第一过滤装置8-1的入口处设置有第三阀门5-2，第二过滤装置8-2的入口处设置有阀门5-3，第一过滤装置8-1、第二过滤装置8-2的出口与缓冲罐11的入口相连通，第一过滤装置8-1、第二过滤装置8-2的出口还与发酵罐3的入口相连通，缓冲罐11的出口与蒸发器12相连通，经过蒸发器12的固形物即为埃博霉素B，经过蒸发器12的溶剂可以回收利用。

发酵罐3内设置有用于测定发酵液pH值的pH计4，发酵过程中通过向发酵罐3中添加KOH溶液调节发酵罐中发酵液的pH值为7.2-7.5，并随时用pH计进行监测。洗脱溶剂罐9内为体积比为9:1的甲醇与乙酸的混合物，水罐10中为蒸馏水，洗脱溶剂罐9、水罐10均与第一过滤装置8-1、第二过滤装置8-2相连通；第一过滤装置8-1、第二过滤装置8-2中均装有分子印迹膜和膜过滤组件，本发明中的过滤膜组件SF-SA购自杭州赛菲膜分离技术有限公司。

本发明中分子印迹膜的制备过程为：以聚砜中空纤维超滤膜为基膜，埃博霉素为模板分子，甲基丙烯酸甲酯为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂，甲醇为溶剂，偶氮二异丁腈为引发剂，采用表面热聚合方法制备了埃博霉素印迹中空纤维复合膜即分子印迹膜。

分子印迹膜具体的制备过程为：将10mmol的埃博霉素溶解于50mL甲醇-水的混合溶液中静置30min，加入40mmolα-甲基丙烯酰胺、200mmol季戊四醇三丙烯酸酯，振荡溶解10min，再加入60mg偶氮二异丁腈，超声脱气，反复冲入高纯氮气脱氧，保持惰性环境，以聚砜中空纤维超滤膜为基膜，在65℃下表面聚合48h，得到含模板分子的印迹膜；利用乙酸-甲醇-水的混合溶液做洗脱液，抽提24h，然后用体积比为4：1的甲醇、水的混合溶液反复洗脱掉模板分子，60℃恒温真空干燥24h，得到埃博霉素B分子印迹膜；其中，甲醇与水的混合溶液中，甲醇与水的体积比为1:4；乙酸-甲醇-水的混合溶液中乙酸、甲醇、水的体积比为1：20：10。

下面通过具体实施例进行说明。

实施例1

参见图1，一种基于分子印迹膜分离发酵耦合制备埃博霉素B的方法，包括以下步骤：

(1)前期发酵

菌种活化：将一支保藏的纤维堆囊菌ATCC25532接种到CNST培养基上活化，并在培养基上放置灭菌的滤纸片，然后将放置有滤纸片的CNST培养基置于恒温培养箱中于30℃培养7d；其中，CNST培养基的pH值为7.2，并于121℃下灭菌30min；CNST培养基中KNO₃为0.5g/L，Na₂HPO₄为0.25g/L，MgSO₄·7H₂O为1g/L，EDTA-Fe³⁺溶液浓度为1mL/L，微量元素液浓度为1mL/L，琼脂为20g/L。

种子培养：用接种环从CNST培养基上刮取降解了滤纸片的黄色菌落，接种到含有种子培养基的种子瓶中，置于巡回式摇床(200r/min)上，在30℃下培养3d，得到种子培养液；其中，种子培养基pH值为7.5，并于115℃灭菌30min；种子培养基中土豆淀粉为9g/L、豆蛋白胨为2g/L、葡萄糖为3g/L、酵母粉为2g/L、MgSO₄为2g/L、CaCl₂为5g/L、EDTA-Fe³⁺的浓度为1mL/L。

(2)发酵培养：按每100mL接种5mL的比例将种子培养液接种于5升的发酵罐中，发酵罐中发酵培养基的装液量为60％，培养温度28℃，搅拌转速为100r/min；通气量4.5L/min。

(3)分子印迹膜过滤除去埃博霉素B：纤维堆囊菌在发酵罐3中发酵培养，发酵培养72h后，开启第一阀门5-1、第二阀门5-2，通过控制蠕动泵6和流量计7使发酵罐3中的发酵液进入第一过滤装置8-1中，过滤除去埃博霉素B，被除去埃博霉素B的发酵液以1mL/min的流速再返回到发酵罐3中。其中，发酵液的pH值为7.2，并于115℃下灭菌30min；发酵液中含有酵母粉20g/L、玉米淀粉8g/L、磷酸二氢钠2g/L、磷酸氢二钠1g/L、MgSO₄·7H₂O5g/L、FeSO₄·7H₂O0.5g/L、CaCl₂2g/L、MnCl₂0.5g/L和葡萄糖10g/L。

(4)补料:补料罐1装有灭菌的新鲜培养基通过泵以1.0mL/min的速度泵入发酵罐3内，为细胞的生长和代谢提供必要的营养。新鲜培养基的pH值为7.2，并于115℃下灭菌30min；新鲜培养基中酵母粉20g/L、玉米淀粉5g/L、磷酸二氢钠1g/L、磷酸氢二钠1g/L、MgSO₄·7H₂O2g/L、FeSO₄·7H₂O0.1g/L、CaCl₂2g/L、MnCl₂0.1g/L和葡萄糖10g/L。

(5)埃博霉素B洗脱分离：发酵96h时，关闭第二阀门5-2，开启第三阀门5-3，使发酵液持续的通入到第二过滤装置8-2中，同时对第一过滤装置8-1中的埃博霉素B进行洗脱，并收集洗脱液。发酵120h时，关闭第三阀门5-3，开启第二阀门5-2是发酵液持续的通入到第一过滤装置8-1中，同时对第二过滤装置8-2中的埃博霉素B进行洗脱，并收集洗脱液；每隔24h交替开启关闭第一阀门5-2和第二阀门5-3，当第一过滤装置中进行过滤时，第二过滤装置中进行洗脱，当第二过滤装置中进行过滤时，第一过滤装置中进行洗脱，第一过滤装置8-1和第二过滤装置8-2中的过滤、洗脱交替进行；洗脱时，先采用体积比为9:1甲醇与乙酸的混合物进行洗脱，再采用蒸馏水进行洗脱，待发酵15d时，停止发酵；将每次收集的洗脱液合并于缓冲罐11中，然后转移至蒸发器12中进行旋转蒸发(转速为100r/min，温度为40℃)回收洗脱溶剂，洗脱溶剂可以重复利用，旋转蒸发后得到的固形物为埃博霉素B。本实施例的埃博霉素B的产量为3mg/L·d。

实施例2

一种基于分子印迹膜分离发酵耦合制备埃博霉素B的方法，包括以下步骤：

(1)前期发酵：同实施例1。

(2)发酵培养：按每100mL接种8mL的比例将种子培养液接种于5升的发酵罐中，发酵罐中发酵培养基的装液量为70％，培养温度为30℃，搅拌转速为130r/min；通气量为2.5L/min。

(3)分子印迹膜过滤除去埃博霉素B：纤维堆囊菌在发酵罐3中发酵培养，发酵培养96h后，开启第一阀门5-1、第二阀门5-2，通过蠕动泵6和流量计7使发酵罐3中的发酵液持续的进入第一过滤装置8-1中，过滤除去埃博霉素B，被除去埃博霉素B的发酵液以3mL/min的流速再返回到发酵罐3中。其中，发酵液的pH值为7.2，并于115℃下灭菌30min；发酵液中含有酵母粉35g/L、玉米淀粉5g/L、磷酸二氢钠1g/L、磷酸氢二钠1g/L、MgSO₄·7H₂O4g/L、FeSO₄·7H₂O0.3g/L、CaCl₂3g/L、MnCl₂0.3g/L和葡萄糖15g/L。

(4)补料:同实施例1。

(5)埃博霉素B洗脱分离：发酵120h时，关闭第二阀门5-2，开启第三阀门5-3，使发酵液持续的进入到第二过滤装置8-2中，同时对第一过滤装置8-1中的埃博霉素B进行洗脱，并收集洗脱液。发酵144h时，关闭第三阀门5-3，开启第二阀门5-2，使发酵液持续的进入到第一过滤装置8-1中，同时对第二过滤装置8-2中的埃博霉素B进行洗脱，并收集洗脱液；每隔24h交替开启关闭第一阀门5-2和第二阀门5-3，当第一过滤装置中进行过滤时，第二过滤装置中进行洗脱，当第二过滤装置中进行过滤时，对第一过滤装置中的分离出的埃博霉素B进行洗脱，第一过滤装置8-1和第二过滤装置8-2中的过滤交替进行；洗脱时，先用体积比为9:1甲醇与乙酸的混合物进行洗脱，再用蒸馏水洗脱，待发酵15d时停止发酵；将每次收集的洗脱液合并于缓冲罐11中，然后转移至蒸发器12中进行旋转蒸发(转速为100r/min，温度为40℃)回收洗脱溶剂，洗脱溶剂可以重复利用，旋转蒸发后得到的固形物为埃博霉素B。本实施例的埃博霉素B的产量为3.53mg/L·d。

实施例3

一种基于分子印迹膜分离发酵耦合制备埃博霉素B的方法，包括以下步骤：

(1)前期发酵:同实施例1。

(2)发酵培养：按每100mL接种10mL的比例将种子培养液接种于5升的发酵罐中，发酵罐中发酵培养基的装液量为75％，培养温度32℃，搅拌转速为150r/min，通气量为3.5L/min。

(3)分子印迹膜过滤除去埃博霉素B：纤维堆囊菌在发酵罐中发酵培养，发酵培养120h后，开启第一阀门5-1、第二阀门5-2.通过蠕动泵6和流量计7使发酵罐3中的发酵液持续的进入第一过滤装置8-1中，过滤除去埃博霉素B，被除去埃博霉素B的发酵液以5mL/min的流速再返回到发酵罐3中。其中，发酵液的pH值为7.5，并于115℃下灭菌30min；发酵液中含有酵母粉50g/L、玉米淀粉10g/L、磷酸二氢钠1g/L、磷酸氢二钠2g/L、MgSO₄·7H₂O2g/L、FeSO₄·7H₂O0.1g/L、CaCl₂5g/L、MnCl₂0.1g/L和葡萄糖12g/L。

(4)补料:同实施例1。

(5)埃博霉素B洗脱分离：发酵144h时，关闭第二阀门5-2，开启第三阀门5-3，使发酵液持续的进入到第二过滤装置8-2中，同时对第一过滤装置8-1中的埃博霉素B进行洗脱，并收集洗脱液，发酵168h时，关闭第三阀门5-3，开启第二阀门5-2，使发酵液持续的进入到第一过滤装置8-1中，同时对第二过滤装置8-2中的埃博霉素B进行洗脱，并收集洗脱液；每隔24h交替开启关闭第一阀门5-2和第二阀门5-3，当第一过滤装置中进行过滤时，第二过滤装置中进行洗脱，当第二过滤装置中进行过滤时，对第一过滤装置中的分离出的埃博霉素B进行洗脱，第一过滤装置8-1和第二过滤装置8-2中的过滤交替进行；洗脱时，先用体积比为9:1甲醇与乙酸的混合物进行洗脱，再用蒸馏水洗脱，待发酵15d时停止发酵；将每次收集的洗脱液合并于缓冲罐11中，然后转移至蒸发器12中进行旋转蒸发(转速为100r/min，温度为40℃)回收洗脱溶剂，洗脱溶剂可以重复利用，旋转蒸发后得到的固形物为埃博霉素B。本实施例获得埃博霉素B的产量为3.13mg/L·d。

实施例4

一种基于分子印迹膜分离发酵耦合制备埃博霉素B的方法，包括以下步骤：

(1)前期发酵

菌种活化：将一支保藏的纤维堆囊菌ATCC25569接种到CNST培养基上活化，并在培养基上放置灭菌的滤纸片，然后将放置有滤纸片的CNST培养基置于恒温培养箱中于28℃培养5d以降解滤纸片；其中，CNST培养基的pH值为7.4，并于121℃下灭菌30min；CNST培养基中KNO₃为0.3g/L，Na₂HPO₄为0.25g/L，MgSO₄·7H₂O为1.5g/L，EDTA-Fe³⁺溶液浓度为1.3mL/L，微量元素溶液浓度为1.5mL/L，琼脂为22g/L。

种子培养：用接种环从CNST培养基上刮取降解了滤纸片的黄色菌落，接种到含有种子培养基的种子瓶中，置于巡回式摇床(180r/min)上，在28℃下培养3d，得到种子培养液；其中，种子培养基pH值为7.3，并于115℃灭菌30min；种子培养基中土豆淀粉为7g/L、豆蛋白胨为3g/L、葡萄糖为2g/L、酵母粉为2g/L、MgSO₄为3g/L、CaCl₂为2g/L、EDTA-Fe³⁺的浓度为1.5mL/L。

(2)发酵培养：同实施例2；

(3)分子印迹膜过滤除去埃博霉素B：同实施例1；

(4)补料：补料罐1装有灭菌的新鲜培养基通过泵以3.0mL/min的速度泵入发酵罐3内，为细胞的生长和代谢提供必要的营养。新鲜培养基的pH值为7.2，并于115℃下灭菌30min；新鲜培养基中酵母粉20g/L、玉米淀粉5g/L、磷酸二氢钠1g/L、磷酸氢二钠1g/L、MgSO₄·7H₂O2g/L、FeSO₄·7H₂O0.1g/L、CaCl₂2g/L、MnCl₂0.1g/L和葡萄糖10g/L。

(5)埃博霉素B洗脱分离：同实施例1。

本实施例获得埃博霉素B的产量为3.2mg/L·d。

实施例5

一种基于分子印迹膜分离发酵耦合制备埃博霉素B的方法，包括以下步骤：

(1)前期发酵

菌种活化：将一支保藏的纤维堆囊菌ATCC25569接种到CNST培养基上活化，并在培养基上放置灭菌的滤纸片，然后将放置有滤纸片的CNST培养基置于恒温培养箱中于32℃培养6d以降解滤纸片；其中，CNST培养基的pH值为7.5，并于121℃下灭菌30min；CNST培养基中KNO₃为0.4g/L，Na₂HPO₄为0.30g/L，MgSO₄·7H₂O为1.0g/L，FeCl₃为1.2mL/L，微量元素液浓度为1.2mL/L，琼脂为25g/L。

种子培养：用接种环从CNST培养基上刮取降解了滤纸片的黄色菌落，接种到含有种子培养基的种子瓶中，置于巡回式摇床(190r/min)上，在32℃下培养2d，得到种子培养液；其中，种子培养基pH值为7.2，并于115℃灭菌30min；种子培养基中土豆淀粉为8g/L、豆蛋白胨为2g/L、葡萄糖为3g/L、酵母粉为3g/L、MgSO₄为5g/L、CaCl₂为4g/L、EDTA-Fe³⁺的浓度为1.2mL/L。

(2)发酵培养：同实施例3；

(3)分子印迹膜过滤除去埃博霉素B：同实施例2；

(4)补料：补料罐1装有灭菌的新鲜培养基通过泵以5.0mL/min的速度泵入发酵罐3内，为细胞的生长和代谢提供必要的营养。新鲜培养基的pH值为7.2，并于115℃下灭菌30min；新鲜培养基中酵母粉20g/L、玉米淀粉5g/L、磷酸二氢钠1g/L、磷酸氢二钠1g/L、MgSO₄·7H₂O2g/L、FeSO₄·7H₂O0.1g/L、CaCl₂2g/L、MnCl₂0.1g/L和葡萄糖10g/L。

(5)埃博霉素B洗脱分离：同实施例2。

本实施例获得埃博霉素B的产量为3.33mg/L·d。

本发明主要针对发酵过程中由于产物埃博霉素B的增加，会对细胞产生毒性和反馈抑制，影响发酵过程中的菌体生长，提出分离发酵耦合的方法；且发酵结束后产物中存在大量埃博霉素同系物，导致目标产物埃博霉素B分离比较困难，提出利用分子印记膜专一性分离本发明采用分子印迹膜对埃博霉素进行专一性吸附分离，并把它和发酵过程相耦合，降低产物抑制作用及对菌株的毒性，提高埃博霉素发酵产量，降低其生产成本。

Claims (10)

1.一种基于分子印迹膜分离发酵耦合制备埃博霉素B的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)前期发酵

菌种活化：将一支纤维堆囊菌接种到CNST培养基上活化，在培养基上放置灭菌的滤纸片，然后将放置有滤纸片的CNST培养基置于恒温培养箱中于28～32℃下培养5～7d；

种子培养：用接种环从CNST培养基上刮取降解了滤纸片的黄色菌落，接种到含有种子培养基的种子瓶中，置于巡回式摇床上，于28～32℃下培养2～3d，得到种子培养液；

(2)发酵培养：按每100mL接种5～10mL的比例将种子培养液接种于发酵罐中进行发酵培养，发酵培养温度为28～32℃，搅拌转速为100～150r/min，通气量为2.5～4.5L/min；

(3)分子印迹膜过滤除去埃博霉素B：待纤维堆囊菌在发酵罐中发酵72～120h后，将发酵罐中的发酵液持续通入到装有分子印迹膜的第一过滤装置中，进行过滤以分离出埃博霉素B，除去埃博霉素B的发酵液返回到发酵罐中继续发酵；

(4)补料：在发酵过程中，将灭菌的新鲜培养基加入到发酵罐中；

(5)埃博霉素B洗脱分离：发酵96～144h之后，对第一分离装置中分离出的埃博霉素B进行洗脱，并收集洗脱液，同时将发酵罐中的发酵液通入到装有分子印迹膜的第二过滤装置中，进行过滤以分离出埃博霉素B，除去埃博霉素B的发酵液返回到发酵罐中继续发酵；发酵120～168h后对第二分离装置中分离出的埃博霉素B进行洗脱，并收集洗脱液；整个发酵过程将发酵罐中的发酵液交替通入到第一分离装置和第二分离装置中，待发酵罐中的发酵液发酵15d后，停止发酵，最后合并收集的洗脱液，浓缩得到埃博霉素B。

2.如权利要求1所述的一种基于分子印迹膜分离发酵耦合制备埃博霉素B的方法，其特征在于，所述CNST培养基的pH值为7.2～7.5，并于121℃下灭菌30min；CNST培养基中KNO₃为0.3～0.5g/L，Na₂HPO₄为0.25～0.30g/L，MgSO₄·7H₂O为1.0～1.5g/L，EDTA-Fe³⁺溶液为1～1.5mL/L，微量元素液浓度为1～1.5mL/L，琼脂为20～25g/L。

3.如权利要求1所述的一种基于分子印迹膜分离发酵耦合制备埃博霉素B的方法，其特征在于，所述种子培养基的pH值为7.2～7.5，并于115℃下灭菌30min；种子培养基中土豆淀粉为7～9g/L、豆蛋白胨为2～3g/L、葡萄糖为2～3g/L、酵母粉为2～3g/L、MgSO₄为2～5g/L、CaCl₂为2～5g/L、EDTA-Fe³⁺溶液浓度为1～1.5mL/L。

4.如权利要求1所述的一种基于分子印迹膜分离发酵耦合制备埃博霉素B的方法，其特征在于，所述分子印迹膜的制备方法如下：

以聚砜中空纤维超滤膜为基膜，埃博霉素为模板分子，甲基丙烯酸甲酯为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂，甲醇为溶剂，偶氮二异丁腈为引发剂，采用表面热聚合方法制备分子印迹膜。

5.如权利要求4所述的一种基于分子印迹膜分离发酵耦合制备埃博霉素B的方法，其特征在于，分子印迹膜具体的制备过程为：

将10mmol的埃博霉素溶解于50mL甲醇-水的混合溶液中静置30min，加入40mmolα-甲基丙烯酰胺、200mmol季戊四醇三丙烯酸酯，振荡溶解10min，再加入60mg偶氮二异丁腈，超声脱气，反复冲入高纯氮气脱氧，保持惰性环境，以聚砜中空纤维超滤膜为基膜，在65℃下表面聚合48h，得到含模板分子的印迹膜；利用乙酸-甲醇-水的混合溶液做洗脱液，抽提24h，然后用体积比为4：1的甲醇、水的混合溶液反复洗脱掉模板分子，60℃恒温真空干燥24h，得到埃博霉素B的分子印迹膜；其中，甲醇与水的混合溶液中，甲醇与水的体积比为1:4；乙酸-甲醇-水的混合溶液中乙酸、甲醇、水的体积比为1：20：10。

6.如权利要求1所述的一种基于分子印迹膜分离发酵耦合制备埃博霉素B的方法，其特征在于，所述发酵液与灭菌的新鲜培养基的pH值均为7.2～7.5，并于115℃下灭菌30min；发酵液中含有酵母粉20～50g/L、玉米淀粉5～10g/L、磷酸二氢钠1～2g/L、磷酸氢二钠1～2g/L、MgSO₄·7H₂O2～5g/L、FeSO₄·7H₂O0.1～0.5g/L、CaCl₂2～5g/L、MnCl₂0.1～0.5g/L和葡萄糖10～15g/L。

7.如权利要求1所述的一种基于分子印迹膜分离发酵耦合制备埃博霉素B的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的纤维堆囊菌为ATCC25532或ATCC25569；巡回式摇床的转速为180～200r/min。

8.如权利要求1所述的一种基于分子印迹膜分离发酵耦合制备埃博霉素B的方法，其特征在于，所述步骤(2)发酵罐的装液量为60-75％。

9.如权利要求1所述的一种基于分子印迹膜分离发酵耦合制备埃博霉素B的方法，其特征在于，所述步骤(3)中除去埃博霉素B的发酵液返回到发酵罐中的流速为1～5mL/min；在发酵过程中新鲜的灭菌培养基以1.0～5.0mL/min的速度泵入发酵罐内。

10.如权利要求1所述的一种基于分子印迹膜分离发酵耦合制备埃博霉素B的方法，其特征在于，所述步骤(4)中洗脱均是先采用体积比为7:3～9:1甲醇与乙酸的混合物进行洗脱，再采用蒸馏水进行洗脱。