CN103933551A - 一种外源性ngf的新用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种外源性NGF的新用途，首先建立SD大鼠隐睾模型，通过外源性注射NGF，设立对照组，利用实时定量PCR、原位杂交、免疫荧光、免疫组化及透射电子显微镜等技术，观察隐睾组织形态学变化，以及睾丸组织中NGF、HoxA10mRNA及蛋白质的表达变化，证实NGF是可促进睾丸精子的形成。因此，NGF在制备用于促生精、促进隐睾模型睾丸组织发育、降低隐睾组织的损伤以及治疗隐睾症药物中具有广泛的应用。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体的涉及一种外源性NGF的新用途。
背景技术
隐睾症即睾丸未降，是由于一侧或两侧睾丸未能成功进入阴囊造成的泌尿生殖系统畸形，新生男婴的发病率为2％-4％，早产儿的发病率更高。正常情况下，在胎儿出生前睾丸首先在腹腔发育，然后在引带的牵拉作用下，逐步下降至阴囊。睾丸之所以未能成功下降至阴囊，主要是由于未将睾丸发生组织学改变。此外，隐睾症是男性不育及睾丸肿瘤发生的危险因素之一。有研究表明，未经及时有效治疗的隐睾患儿，对其以后的生育能力有着不可逆的影响，且患睾丸恶性肿瘤的机率更高。目前睾丸下降固定术和激素疗法是治疗隐睾的主要手段。1930年HCG(人绒毛膜促性腺激素)激素疗法首次应用于临床，并获得广泛应用，尤其是欧洲国家更为盛行。然而，近几年，因激素疗法对生殖细胞的副作用较大，而再次被国内外学者广泛重视，其临床应用较前减少。
隐睾症是一种涉及多种基因的多因素疾病。前期研究证实，在未降睾丸中β-NGF和HoxA10mRNA及蛋白质表达显著降低。NGF(Nerve growth factor，神经生长因子)被认为是神经生长、扩增、分化及存活的主要调控因子之一，而且，在睾丸中也有NGF的表达，且由男性生殖细胞产生。HoxA10则与隐睾症密切相关，是腹腔内睾丸下降、引带发育的重要原因之一。迄今为止，外源性NGF已被应用于多种神经系统模型，且应用于临床，研究NGF的传递方式及在成熟或发育的神经系统中的作用机制。因此，将β-NGF和HoxA10作为睾丸发育情况的检测指标。然而，外源性NGF是否影响大鼠隐睾模型中内源性NGF和HoxA10的表达变化尚未有相关报道。
发明内容
发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种外源性NGF的新用途，通过建立SD大鼠单侧隐睾模型，利用电生理显微技术观察外源性NGF作用于隐睾后NGF和HoxA10基因及蛋白的表达变化，证实其NGF具有明显地促生精作用，外源性注射NGF，可促进隐睾模型睾丸组织发育，降低隐睾组织的损伤，对人类隐睾症具有潜在的治疗效果。
技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
外源性NGF在制备用于促生精药物中的应用。
所述的药物通过提高隐睾组织中NGF基因的蛋白表达量、HoxA10基因的蛋白表达量来实现。
外源性NGF在制备用于降低隐睾组织的损伤药物中的应用。
所述的药物通过提高隐睾组织中NGF基因的蛋白表达量、HoxA10基因的蛋白表达量来实现。
外源性NGF在制备用于治疗隐睾症药物中的应用。
所述的药物通过提高隐睾组织中NGF基因的蛋白表达量、HoxA10基因的蛋白表达量来实现。
外源性NGF在制备用于促进隐睾模型睾丸组织发育药物中的应用。
所述的药物通过提高隐睾组织中NGF基因的蛋白表达量、HoxA10基因的蛋白表达量来实现。
本发明首先建立SD大鼠隐睾模型，通过外源性注射NGF，设立对照组，利用实时定量PCR、原位杂交、免疫荧光、免疫组化及透射电子显微镜等技术，观察隐睾组织形态学变化，以及睾丸组织中NGF、HoxA10mRNA及蛋白质的表达变化，证实NGF是可促进睾丸精子的形成。
有益效果：与现有技术相比，本发明的外源性NGF的新用途，通过一步法实时定量PCR、免疫杂交、免疫荧光、免疫组化技术检测隐睾组织中NGF、HoxA10基因和蛋白表达变化，高剂量组(NGF高浓度)比低剂量组和对照组(HCG组)NGF和HoxA10蛋白和基因表达较高，证实了NGF具有明显地促生精作用，外源性注射NGF，可促进隐睾模型睾丸组织发育，降低隐睾组织的损伤，对人类隐睾症具有潜在的治疗效果。可见，NGF在药物开发中具有广泛的应用。
附图说明
图1是一步法实时定量PCR检测结果图；A图是睾丸中β-NGF mRNA的表达水平，B图是HoxA10mRNA的表达水平；
图2是原位杂交结果图；A图为阴性对照组，B图为HCG组，C图为高剂量组，D图为低剂量组，E图为空白对照组；
图3是免疫荧光结果图；A图为阴性对照组，B图为HCG组，C图为高剂量组，D图为低剂量组，E图为空白对照组；
图4是免疫组化结果图；A图为阴性对照组，B图为HCG组，C图为高剂量组，D 图为低剂量组，E图为空白对照组；
图5是透射电子显微镜下睾丸组织显微结构图；A图为阴性对照组，B图为HCG组，C图为高剂量组，D图为低剂量组，E图为空白对照组；
图6是模型的建立示意图；
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
模型的建立，如图6所示。
获取日龄21天SD雄鼠约30只(此时SD鼠的睾丸尚未下降，SD鼠睾丸的下降通常在日龄20-30d)，戊巴比妥钠腹腔内注射麻醉，下腹正中切开腹腔，切断睾丸引带远端，缝合睾丸白膜，将睾丸固定于相应的腹膜上，关闭腹腔，完成隐睾模型的建立。对侧睾丸作为对照组。
模型建立术后分为4组，每组6只，NGF高、低注射剂量组(HN组、LN组)，注射HCG组(HC组)，阴性对照组(NC组)。自术后第2天起，HN组每次肌肉注射鼠NGF9000IU，LN组每次肌肉注射鼠NGF4500IU，共注射5天。HC组每次肌肉注射HCG400IU，NC组肌肉注射生理盐水。另取6只正常SD大鼠，作为空白对照组。模型建立术后第7天(幼鼠期)、术后第60天(性成熟期)快速脱颈椎法每次处死12只大鼠，取未降睾丸和对侧已降睾丸标本用于后续实验。
实施例2一步法实时定量PCR
组织总RNA的提取：取50～100mg的睾丸组织应用Trizol试剂盒(Invitrogen，USA)，按说明书步骤提取总RNA，置-70℃冰箱保存备用。为了避免可能的基因组DNA污染，所有的RNA样品均使用无RNA酶的DNA酶(Promega，Madison，WI，USA)。经紫外分光光度计测定各样本的OD260/OD280(R)值，以鉴定RNA纯度及完整性。R值如表1所示，1.8＜R＜2.0证实Trizol法提取的RNA纯度较好，可用于后续实验。
根据标准协议，使用Rotor-Gene3000实时DNA分析系统(Corbett Research，Sydney，Australia)，应用SensiMixTM One-Step试剂盒(Quantace，UK)完成一步法荧光实时定量PCR(one-step qPCR)，应用Rotor-Gene实时分析软件6.1(Build90)计算β-NGF和Hox10mRNA的表达结果。PCR扩增体系：Dream Taq PCR Master Mix(2x)10ul；Forward Primer2ul；Reverse Primer2ul；Template DNA3ul；Water，nuclease-free3ul。PCR扩增程序包括：42℃，30min反转录后，95℃Taq酶激活2min，随后95℃15s， 58℃30s共45个循环，最后72℃40s延伸。GAPDH作为标准内参基因对照。β-NGF，Hox10、GAPDH的PCR引物序列如下：
β-NGF-forward：5′-ACCTCTTCGGACACTCTG-3′；
β-NGF-reverse：5′-GTGGCTGTGGTCTTATCTC-3′；
Hox10-forward：5′-ACAAGCACACCACAATTCTCC-3′；
Hox10-reverse：5′-ATCCAAACAATGTCTCCCTTCTC-3′；
GAPDH-forward：5′-TCGTGGAGTCTACTGGCGTCT-3′；
GAPDH-reverse：5′-CAACCTGGTCCTCAGTGTAG-3′。
结果如图1所示，显示在高剂量组(LN)中，HoxA10及β-NGF mRNA的表达水平最高(F＝125.58，P＜0.001and F＝49.03，P＜0.001)，与阴性对照组(NC)相比，高剂量组和低剂量组的HoxA10及β-NGF mRNA的表达水平显著提高。
如下面表一所示，
表1Trizol法提取的RNA纯度鉴定结果
| Name | B | NC | HC | HN | LN |
| 0D260/OD280 | 1.91 | 1.89 | 1.85 | 1.82 | 1.93 |
实施例3地高辛标记抗β-NGF mRNA的原位杂交组织化学法
Dig-NGF RNA探针制备：使用Trizol试剂提取S-D大鼠脑组织中的总RNA，经RT-PCR提取β-NGF的cDNA片段。RT-PCR使用的上、下游引物分别是
5′-GATCGGCGTACAGGCAGAAT-3′及5-GGCTCGGCACTTGGTCTCAA-3′。通过T4连接酶反应，将PCR产物克隆到pGEM-T载体中，从而构建NGF/pGEM-T质粒，将构建的NGF/pGEM-T质粒转化到DH5a感受态细胞中，经筛选、提取、纯化，进而酶切鉴定及测序验证后，将扩增的质粒分别用限制性内切酶SalI和ApaI酶切，使质粒线性化，分别回收酶切片段后，作为正义或反义NGF探针模板。采用Sp6和T7转录酶，按照地高辛RNA标记试剂盒(Roche，Germany)提供的步骤，分别标记SalI和Apa I酶切回收的NGF片段。
原位杂交组织化学法用于检测β-NGF mRNA的表达。取去荚膜的睾丸组织，常规冰冻切片(厚约4μm)，固定于新鲜配制的4％多聚甲醛(pH7.4)，置4℃冰箱8小时。切片于0.1％DEPC水清洗两次并置于43℃环境干燥过夜。预杂交2h后，切片放入杂交液(含反义dig-NGF RNA探针1μg/mL)42℃湿盒中18h。杂交后切片依次入2×SSC/0.1％SDS 25℃5min、1×SSC/0.1％SDS60℃15min、0.1×SSC/0.1％SDS漂洗2次，切片置于室温下封闭液中孵育30min后，入抗地高辛抗体(Roche，1∶5000)4℃过夜。加100mM顺丁烯二酸溶液(pH7.5)及0.3％Tween-20溶液(15min each at25℃)漂洗两次，再加入呈色原稀释剂5min.NBT/BCIP Roche，Germany)显色，封片，光镜下观察结果。空白对照以正义dig-NGF RNA探针取代反义探针，其余步骤相同。
结果如图2所示，由图可见β-NGF mRNA主要集聚在生殖细胞的胞质中，与对照组相比，未降睾丸在高剂量外源性β-NGF作用下，β-NGF mRNA的表达显著增加，结果与一步法实时定量PCR结果一致。
实施例4免疫荧光
将全部冰冻去荚膜睾丸组织制成4μm的切片，3％H2O2及甲醇封闭内源性过氧化物酶活性，在低压下煮沸后，进而提取抗原。在PBS中滴加5％山羊血清，封闭组织中的非特异性染色，室温下孵育15min。除去血清后，滴加羊抗鼠β-NGF多克隆抗体(1∶400，R&D，USA)4℃过夜。PBS冲洗，并用0.01％异硫氰酸荧光素孵育以结合兔抗羊IgG(Sigma-Aldrich，USA)，PBS缓冲液冲洗后，荧光显微镜(ZEISS，Germany)观察样本。免疫荧光试验至少重复3次，阴性对照组由一抗与PBS替代。
结果如图3所示，未降睾丸中β-NGF蛋白为绿色荧光，主要在生殖细胞、间质细胞和睾丸间质细胞的胞质中表达，A图为阴性对照组，与空白对照组相比，有较少的β-NGF蛋白表达，B图为HCG组，β-NGF蛋白比阴性对照组的β-NGF蛋白表达提高，C图为高剂量组，β-NGF蛋白表达水平最高，D图为低剂量组，β-NGF蛋白高于阴性对照组，E图为空白对照组，为正常睾丸中的β-NGF蛋白表达。
实施例5免疫组织化学
4％的多聚甲醛溶液固定睾丸组织24小时，常规脱水、透明、石蜡包埋，4μm连续切片。3％H2O2及甲醇封闭内源性过氧化物酶活性，室温放置15min。切片放入枸橼酸钠抗原修复液内(pH6.0)高压抗原修复3min，在PBS中滴加封闭用5％山羊血清，封闭组织中的非特异性染色，室温下孵育15min。除去血清后，滴加含1％牛血清白蛋白的一抗(兔抗鼠HOXA10多克隆抗体，1μg/mL，H-90，santacruz，USA)，4℃过夜。PBS缓冲液冲洗后，滴加标记辣根过氧化物酶的二抗(羊抗兔IgG抗体，Dako-cytomation，USA)室温孵育15min。DAB(Kem-En-Tec Diagnostics，Denmark)显色于镜下15分钟，苏木素复染，中性树胶封片。利用pBS代替一抗作为阴性对照。
结果如图4所示，阳性染色为棕色，HOXA10主要位于睾丸生殖细胞、支持细胞及睾丸间质细胞的细胞核内。在高剂量注射NGF组中，隐睾组织中HOXA10蛋白的表达量，与其他各组(包括阴性对照组，HCG注射组，低剂量注射NGF组及空白对照组)相比显著增加。
实施例6透射电子显微镜
新鲜去荚膜睾丸组织，用1％低聚甲醛、1.25％戊二醛、四氧化锇固定，环氧树脂812包埋，切片以甲苯胺蓝著色，以超薄切片机切成厚约50nm的超薄切片，经醋酸铀和柠檬酸铅等重金属电子染色后，置于透射电子显微镜(JEOL JEM-1230，Japan)下观察。
结果如图4所示，与正常睾丸相比(即空白对照组，B组)，隐睾睾丸(阴性对照组，NC组)显示了一些病理改变，如核染色质减少、退化，核糖体变性，空泡状，变厚，核膜损害，核周间隙变宽，核固缩等等。高剂量NGF治疗后，病理变化显示高剂量注射NGF组的睾丸与正常睾丸相似。
序列表
Claims (8)
1.外源性NGF在制备用于促生精药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的药物通过提高隐睾组织中NGF基因的蛋白表达量、HoxA10基因的蛋白表达量来实现。
3.外源性NGF在制备用于降低隐睾组织的损伤药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的药物通过提高隐睾组织中NGF基因的蛋白表达量、HoxA10基因的蛋白表达量来实现。
5.外源性NGF在制备用于治疗隐睾症药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的药物通过提高隐睾组织中NGF基因的蛋白表达量、HoxA10基因的蛋白表达量来实现。
7.外源性NGF在制备用于促进隐睾模型睾丸组织发育药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的药物通过提高隐睾组织中NGF基因的蛋白表达量、HoxA10基因的蛋白表达量来实现。
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| WO2023088351A1 (zh) * | 2021-11-19 | 2023-05-25 | 舒泰神（北京）生物制药股份有限公司 | 神经生长因子在制备用于治疗或改善生殖系统疾病的药物中的用途 |
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