CN103924006A - 一种用于检测HoBi样瘟病毒核苷酸片段的引物序列 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于检测HoBi样瘟病毒（HoBi-likepestivirus）核苷酸片段的引物序列，属于动物病原微生物检测技术领域。引物对包括：由序列为TGGTTCGACGCATTAAGGAAT的上游引物HoBi-F和序列为TCTCTGCAGCACCCTATCAG的下游引物HoBi-R组成的引物对。该套引物序列根据GenBank上HoBi样瘟病毒5′-UTR基因序列设计，具有较高的灵敏度和特异性。
Description
技术领域
本发明属于动物病原微生物检测技术领域。具体涉及一种用于检测HoBi样瘟病毒核苷酸片段的引物序列。
背景技术
HoBi样瘟病毒（HoBi-like pestivirus）与牛病毒性腹泻病毒1型（bovine viral diarrheavirus，BVDV-1）和2型（BVDV-2），边界病病毒（Border disease virus，BDV），猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）和野生反刍动物瘟病毒（Pestivirus of giraffe）同属于黄病毒科，瘟病毒属，为一类具有囊膜的单股正链RNA病毒。其基因组约12.5kb，具有一个大的阅读框，编码一个多聚蛋白，在病毒或宿主细胞的酶切作用下，加工为12个结构蛋白和非结构蛋白。
2004年，Schirrmeier等从来源于巴西的胎牛血清（Foetal calf serum，FCS）中分离到一种非典型瘟病毒属病毒D32/00_‘Hobi’株，从遗传特性分析发现这株新的病毒与BVDV-1和BVDV-2亲缘关系较近，但是并不在一个分支上，可能是黄病毒科瘟病毒属的一个新的病毒种，命名为HoBi样瘟病毒，现有报道也将其称之为BVDV-3。意大利、泰国和巴西等国都从病牛中分离到HoBi样瘟病毒，此外，美国，德国和瑞士数次从商品化FCS中检测到HoBi样瘟病毒，这些血清的来源包括美国、澳大利亚、加拿大、墨西哥和巴西。自然感染宿主目前见于报道的仅限于牛，主要症状包括腹泻、流产和呼吸道疾病。
到目前为止，人们对牛HoBi样瘟病毒在世界各地的存在于流行情况所知甚少。我国于2012年发现了HoBi样瘟病毒JS12/01株，根据进化树显示与巴西来源型毒株在一个分支上（Mao L,et al.Genome sequence of a novel hobi-like pestivirus in china.JVirol.2012）。而且，JS12/01毒株与三株意大利分离的HoBi样病毒毒株Italy-83/10-ncp、Italy-83/10-cp和Italy-1/10-1JS12/01毒株亲缘关系极近，而这三株毒株都是从临床感染发病牛体内分离到的。因此，HoBi样瘟病毒是否也可能在国内引起动物致病，正在成为热点。
基于以上研究，申请人根据国内和国外研究者登录在GenBank中HoBi样瘟病毒的基因序列（毒株名称（登录号），JS12/01（JX469119），Th/04_KhonKae（FJ040215）、Italy-1/10-1（HQ231763）、Italy-83/10-ncp（JQ612704）、Italy-83/10-cp（JQ612705）、D32/00_HoBi（AY489116S）、Australia-1（HQ403054）、IZSPLV_To（HM151361）、Italy-280/11-A（JN703311）、SVA/cont-08（FJ232692）），设计了用于检测HoBi样瘟病毒核苷酸片段的引物。
发明内容
技术问题
本发明的目的是提供一种用于检测HoBi样瘟病毒核苷酸片段的引物序列。
技术方案
本发明采用以下技术方案：
一种用于检测HoBi样瘟病毒核苷酸片段的引物，其特征在于，所述的引物为：上游引物HoBi-F：TGGTTCGACGCATTAAGGAAT；
下游引物HoBi-R：TCTCTGCAGCACCCTATCAG。
所述引物对序列用于检测HoBi样瘟病毒核苷酸片段的方法，包括：
1）待测模板的制备：取200μl血清；或取100mg组织样品，加入1mlPBS缓冲液进行充分研磨，-20℃反复冻融3次，8000rpm离心10分钟，取上清液200μl。加入1mlTRizol，混合均匀后静置15分钟，按1mlTRizol加入200μl氯仿，静置5分钟，12000rpm离心15分钟，取上层水相，加等量体积异丙醇，轻轻混匀，-20℃静置2小时，12000rpm离心15分钟，弃去上清，加入1ml无水乙醇于-20℃放置1小时，12000rpm离心10分钟，弃去上清，沉淀于干燥箱干燥后用20μl无RNase水溶解，即为检测用RNA模板；
2）HoBi样瘟病毒实时荧光PCR反应的扩增条件：
将加好样品的PCR管放置荧光PCR仪中进行扩增，反应程序如下：45℃，5分钟，反转录；94℃，30秒预变性；94℃，5秒，60℃30秒，40个循环。试验结果可以实时监测。
3）HoBi样瘟病毒实时荧光PCR的检测结果判定：经检测，若待检样品中含有HoBi样瘟病毒则显示阳性扩增曲线，其检测灵敏度可达10个拷贝/μL；若待检样品中不含有HoBi样瘟病毒则无扩增信号。
有益效果
本发明的具体原理是利用一对靶核苷酸序列的特异性引物，采用耐热DNA聚合酶（Taq酶）、核苷酸单体（dNTP）等成分，并应用PCR技术实现靶核苷酸序列的核酸片段扩增。在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步，荧光信号可以由仪器检测到，荧光信号量的变化与扩增产物量成正比，从而判定待测样本中靶核苷酸序列的存在。
本发明的优点：
1、本发明提供的引物对的检测灵敏度可达10个拷贝/μL，说明其具有非常良好的灵敏度；
2、本发明提供的引物对于不含有HoBi样瘟病毒的检测样品均无扩增信号，说明其具有良好的特异性；
3、由于本发明对已知的HoBi样瘟病毒基因组序列进行比较分析，选择无二级结构且高度保守的区段进行引物设计，避免了假阴性结果的产生。
4、由于本发明采用荧光PCR技术作为检测方法，整个反应均在封闭的反应管内进行，避免了普通PCR检测常出现假阳性结果的现象。由于对PCR产物进行实时监测，大大节省了检测时间，节约了人力物力。
附图说明
图1：利用引物对HoBi-F/HoBi-R检测HoBi样瘟病毒阳性样品的荧光PCR扩增图。
具体实施方式
1、引物设计：通过对HoBi样瘟病毒基因组序列进行比较分析，选择无二级结构且高度保守的区段，设计多对引物，引物长度一般为20-30个碱基左右，引物间和引物内无互补序列。最优引物序列组合如下：
上游引物HoBi-F：TGGTTCGACGCATTAAGGAAT
下游引物HoBi-R：TCTCTGCAGCACCCTATCAG
2、反应体系的建立和优化：利用接种HoBi样瘟病毒的细胞培养物为待检样品，用常规方法提取病毒基因组RNA，分装后储存于-20℃备用。
引物浓度的优化：在反应体系中其它条件相同的情况下，将HoBi样瘟病毒的引物浓度分别从0.1μmol/L至2.0μmol/L做连续倍比稀释，通过实验结果的分析比较，确定最佳引物终浓度为0.4μmol/L。
利用上述引物进行反应体系的建立，最后确定采用的HoBi样瘟病毒实时荧光PCR反应体系为25μl体系，所需各组分及相应浓度见表1。
表1.HoBi样瘟病毒实时荧光PCR反应体系中的各组分情况：
| 组分 | 用量/终浓度 |
| 2×Buffer | 1× |
| 引物 | 0.4μmol/Leach |
| Dye(50×) | 0.4μL |
| 模板 | 2μL |
| One-stepRT/RIEnzymeMix(酶混合物) | 5Unit |
| 无RNase水 | 补足至25μL |
备注：以上试剂均购买自北京全式金生物科技有限公司。
3.仪器检测通道的选择：在进行荧光PCR反应时，应对所使用仪器中反应管荧光信号的收集进行设置，选择的荧光检测通道SYBR荧光染料相一致。具体设置方法参照仪器使用说明书。
4.PCR反应条件选择如下：45℃，5分钟；94℃，30秒，1个循环；94℃，5秒，60℃30秒，40个循环。
5.检测步骤：
5.1选取引物；
5.2制备待测模板，采用常规提取RNA方法提取各种来源样品中HoBi样瘟病毒的核酸；
5.3反应体系的建立：表1。
5.4选择仪器的检测通道；
5.5上机检测。
6.实施例1
6.1待测模板的制备：
取100mgHoBi样瘟病毒(Hobi-like pestivirus)污染的MDBK细胞培养物（MaoL,Li W,Zhang W,Yang L,JiangJ.2012.Genome sequence of a novel Hobi-like pestivirusin China.Journal of Virology.86(22):12444.），加入1mlPBS缓冲液进行充分研磨，-20℃反复冻融3次，8000rpm离心10分钟，取上清液200μl。加入1mlTRizol，混合均匀后静置15分钟，按1mlTRizol加入200μl氯仿，静置5分钟，12000rpm离心15分钟，取上层水相，加等量体积异丙醇，轻轻混匀，-20℃静置2小时，12000rpm离心15分钟，弃去上清，加入1ml无水乙醇于-20℃放置1小时，12000rpm离心10分钟，弃去上清，沉淀于干燥箱干燥后用20μl无RNase水溶解，即为检测用RNA模板；
6.2HoBi样瘟病毒实时荧光PCR反应的扩增条件：根据表1加样，将加好样品的PCR管放置荧光PCR仪（ABIPrism7500）中，设置相应荧光收集条件后进行扩增，反应程序如下：45℃，5分钟；94℃，30秒，1个循环；94℃，5秒，60℃30秒，40个循环。试验结果可以实时监测。仪器检测通道的选择：在进行荧光PCR反应时，应对所使用仪器中反应管荧光信号的收集进行设置，选择的荧光检测通道SYBR荧光染料相一致，参照荧光PCR仪（ABIPrism7500）使用说明书具体设置选择的荧光检测参数。
6.3HoBi样瘟病毒实时荧光PCR的检测结果：经检测，检测样品中含有HoBi样瘟病毒则显示阳性扩增曲线（图1），其检测灵敏度可达10个拷贝/μL；对照样品中不含有HoBi样瘟病毒则无扩增信号，提示上述引物对具有良好的灵敏度和特异性。
7.实施例2
7.1待测模板的制备：取200μl山羊(句容市王道胜羊场)血清，加入1mlPBS缓冲液进行充分研磨，-20℃反复冻融3次，8000rpm离心10分钟，取上清液200μl。加入1mlTRizol，混合均匀后静置15分钟，按1mlTRizol加入200μl氯仿，静置5分钟，12000rpm离心15分钟，取上层水相，加等量体积异丙醇，轻轻混匀，-20℃静置2小时，12000rpm离心15分钟，弃去上清，加入1ml无水乙醇于-20℃放置1小时，12000rpm离心10分钟，弃去上清，沉淀于干燥箱干燥后用20μl无RNase水溶解，即为检测用RNA模板；
7.2待测模板的检验：用RT-PCR方法对上述RNA进行检测（Decaro N,et al.2011.A nested PCR approach for unambiguous typing of pestiviruses infecting cattle.Mol.Cell.Probes doi:10.1016/j.mcp.2011.11.003.），检测阳性样品回收目的条带进行测序鉴定，经序列比对为HoBi样瘟病毒。
7.3HoBi样瘟病毒实时荧光PCR反应的扩增：根据表1加样，将加好样品的PCR管放置荧光PCR仪（ABIPrism7500）中，设置相应荧光收集条件后进行扩增，反应程序如下：45℃，5分钟；94℃，30秒，1个循环；94℃，5秒，60℃30秒，40个循环。试验结果可以实时监测。仪器检测通道的选择：在进行荧光PCR反应时，应对所使用仪器中反应管荧光信号的收集进行设置，选择的荧光检测通道SYBR荧光染料相一致，参照荧光PCR仪（ABIPrism7500）使用说明书具体设置选择的荧光检测参数。
7.4HoBi样瘟病毒实时荧光PCR的检测结果：经检测，测序阳性样品中含有HoBi样瘟病毒则显示阳性扩增曲线；阴性样品中不含有HoBi样瘟病毒则无扩增信号。
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏省农业科学院
<120> 一种用于检测HoBi样瘟病毒核苷酸片段的引物序列
<130> 0
<160> 2
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<221> 下游引物HoBi-F
<222> (1)..(21)
<223>
<400> 1
tggttcgacg cattaaggaa t 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人
<220>
<221> 上游引物HoBi-F
<222> (1)..(21)
<223>
<400> 2
tggttcgacg cattaaggaa t 21
Claims (3)
1.一种用于检测HoBi样瘟病毒核苷酸片段的引物序列，其特征在于，所述的引物为：
上游引物HoBi-F：TGGTTCGACGCATTAAGGAAT
下游引物HoBi-R：TCTCTGCAGCACCCTATCAG。
2.含有权利要求1所述用于检测HoBi样瘟病毒核苷酸片段引物序列的试剂盒。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其用于检测HoBi样瘟病毒核苷酸片段的方法包括：
1）待测模板的制备：取200 μl血清；或取100 mg组织样品，加入1 ml PBS缓冲液进行充分研磨，-20℃反复冻融3次，8000 rpm离心10分钟，取上清液200 μl，
加入1 ml TRizol，混合均匀后静置15分钟，按1 ml TRizol加入200 μl氯仿，静置5分钟，12000 rpm离心15分钟，取上层水相，加等量体积异丙醇，轻轻混匀，-20℃静置2小时，12000 rpm离心15分钟，弃去上清，加入1 ml无水乙醇于-20℃放置1小时，12000 rpm离心10分钟，弃去上清，沉淀于干燥箱干燥后用20 μl无RNase水溶解，即为检测用RNA模板；
2）HoBi样瘟病毒实时荧光PCR反应的扩增条件：
组分 用量/终浓度
2×Buffer 1×
One-step RT/RI Enzyme Mix 0.4μL
引物 0.4μmol/L each
Dye 50× 0.4μL
模板 2μL
无RNase水 补足至25μL
将加好样品的PCR管放置荧光PCR仪中进行扩增，反应程序如下：45℃，5分钟，反转录；94℃，30秒预变性；94℃，5秒，60℃ 30秒，40个循环；试验结果实时监测；
3）HoBi样瘟病毒实时荧光PCR的检测结果判定：经检测，若待检样品中含有HoBi样瘟病毒则显示阳性扩增曲线；若待检样品中不含有HoBi样瘟病毒则无扩增信号。
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-
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