CN103923170A - 一种聚乙二醇修饰的微管蛋白解聚剂多肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及药物领域，具体涉及具有抑制微管蛋白聚合，治疗实体肿瘤的多肽。此多肽经过了聚乙二醇修饰，其序列为mPEG-SC_10k-CRALERLV是全新的序列，它们可以在体外抑制微管蛋白聚合，并在体内试验中提高荷瘤小鼠生存率，具有潜在的新药开发价值。

Description

一种聚乙二醇修饰的微管蛋白解聚剂多肽及其应用

技术领域

本发明涉及聚乙二醇修饰的微管蛋白解聚剂及其应用，具体涉及具有抑制微管蛋白聚合、可治疗实体肿瘤的的多肽。

背景技术

近年来随着医学研究的深入，发现微管蛋白在实体肿瘤生长中扮演着重要角色。微管是细胞骨架的主要组成部分，由α-微管蛋白和β-微管蛋白异二聚体组成，具有中空管状结构的特点。此外，还有一种γ微管蛋白，它不是微管的组成成分，但参与微管的组装。微管具有聚合和解聚的动力学特性，在维持细胞形态、细胞分裂、信号转导及物质输送等过程中起着重要作用。微管在细胞分裂前期聚合成为纺锤体，而纺锤体在有丝分裂中牵引染色体向两极移动进入两个子细胞中，完成细胞增殖。微管的组装过程是α-和β-微管蛋白异性二聚体之间紧密的非共价相互作用，这一过程是受GTP水解驱动的。异性二聚体不断地在微管的正极生长，在负极收缩，并且维持动态稳定。当微管的动态稳定性被破坏时，细胞的有丝分裂过程就有可能被阻止，从而导致细胞死亡。由于微管在细胞分裂中具有极其重要的作用，现已成为抗肿瘤药物研究的重要靶点之一。

抑制微管蛋白聚合的微管蛋白解聚剂有长春碱类、秋水仙碱等化合物，多用于肿瘤治疗。这类化合物其特点是作用于微管的长春碱位点的微管蛋白解聚剂。研究表明， 长春碱类药物作用于细胞微管蛋白并干扰细胞周期的有丝分裂阶段，抑制微管聚合，阻止纺锤体微管的形成，从而阻止肿瘤细胞分裂增殖。该类生物碱自发现具有抗肿瘤活性以来，已有长春碱 (vinblastine，15)、长春新碱 (vincristine，16)、长春地辛 (vindesine，17)和长春瑞滨 (vinorelbine，18) 用于临床治疗，而长春氟宁 (vinflunine，19)、长春甘酯(vinglycinate，20) 及脱水长春碱 (anhydrovinblastine，21) 正处于临床研究阶段。但这些都有自身的缺陷，如长春碱与作用靶点亲和力小，药效不强。长春新碱有两个重要的因素限制了它在临床上的应用：（1）长春新碱神经系统毒性和局部刺激性较大；（2）水溶性相对较低，吸收能力差。

CRALERLV是一个全新的序列，前期的研究表明，该多肽经反复体内外活性评价证实具有较好的抑瘤效果，能够显著抑制微管蛋白聚合。然而上述多肽的半衰期短，拟用临床人的给药是每天静脉滴注，这给患者带来了一定的痛苦。

文献报道中，对分子结构进行修饰或改造是解决半衰期较短、需连续给药问题的常用方法，其中以化学修饰应用最为广泛，常用的化学修饰剂有聚乙二醇(polye thylene glycol，PEG)、葡聚糖、聚氨基酸、聚酸酐等。PEG具有无毒、无免疫原性、水溶性好的特点，被美国食品与药物管理局(FDA)认可作为药品的辅助原料和修饰剂。蛋白质类药物经PEG修饰后，分子量增加，肾小球的滤过率减少，PEG的屏障作用保护了蛋白质不易被蛋白水解酶水解，同时减少了中和抗体的产生，这些均有助于蛋白质类药物生物半衰期的延长。目前已有多种PEG修饰的蛋白质类药物上市销售。但PEG修饰同时也可能影响蛋白质的生物学活性，其影响大小与修饰剂、修饰条件及蛋白质本身的性质有关。对于具体的蛋白质，其最佳修饰需通过制备PEG修饰的蛋白质及生物活性研究来决定。合成小分子多肽的PEG修饰研究起步较晚，但已引起不少研究者的关注。

发明内容

发明目的

 本发明针对mPEG-SC-CRALERLV做了进一步研究，发现其在降低给药频率的情况下对多种肿瘤有治疗作用。

技术方案

一种聚乙二醇修饰的微管蛋白解聚剂多肽，其特征在于其序列为mPEG-SC_10k-CRALERLV。mPEG-SC的分子量为5000-20000。一种聚乙二醇修饰的微管蛋白解聚剂多肽在制备治疗肿瘤药物中的应用，其特征在于所述的肿瘤为起源于人的胃部、皮肤、头颈部、甲状腺、胰腺、肺脏、食管、乳腺、肾脏、胆囊、结肠/直肠、卵巢、子宫、子宫颈、前列腺、膀胱、睾丸的原发/继发的癌或肉瘤。

有益效果

为了延长多肽CRALERLV的半衰期，我们采用不同分子量的聚乙二醇（PEG）对此多肽进行了修饰，发现mPEG-SC_10k-CRALERLV具有延长半衰期，但又不影响其体内外活性的特点。一个多肽的修饰产物属于一个新型分子，往往与修饰前的分子在活性上产生不同的效果。本发明针对上述聚乙二醇修饰的微管蛋白解聚剂mPEG-SC_10k-CRALERLV对多种肿瘤有治疗作用进行了大量的体内外活性研究，发现给药频率降低的情况下，mPEG-SC_10k-CRALERLV对抑制多种肿瘤生长保持了很好的活性，拓展了其社会价值和经济价值。

具体实施方式

实施例1

聚乙二醇修饰的微管蛋白解聚剂对体外微管蛋白聚合与解聚的作用。

取新鲜牛脑组织，剥去脑膜和大的血管，剪碎，用冷 MES 缓冲液洗涤 1-2 次，以每克脑组织 0.5-1ml 的比例加入 MES 缓冲液，在 4℃下，用电动匀浆器匀浆;4℃，105000g 离心 1h，取上清，加入等体积的微管聚合缓冲液，37℃水浴保温 30min。26℃，105000g 离心 1h，取沉淀，加入约 1/10 匀浆体积的冷 MES 缓冲液，轻轻搅拌或用匀浆器将沉淀碾碎；将悬液放冰浴 30min，使沉淀完全溶解。用 Lowry’s法测定蛋白含量（SDS 聚酰胺凝胶电泳法）。微管蛋白用 MES 缓冲液稀释至 4-5mg/ml，置液氮中保存。取冷冻的微管蛋白溶液，快速用常温水冲其壁，使之融化，放入冰浴，用 MES 缓冲液稀释至所需浓度（2-3mg/ml），加入 ATP至 1mmol/l。以从冰浴中马上取出的微管蛋白溶液在分光光度计 350nm处调定为“0”点。然后将比色杯在37℃温度下测定微管蛋白溶液的 OD值，连续 20-30min，记录温度-吸光值曲线（T-OD 曲线），重复三次。

抑制率计算：抑制率（%）=（对照管“OD”值－加药管“OD”值）／对照管“OD”

实验组设五个剂量：0.75μM、1.5μM、3μM、12μM、24μM，阳性对照组紫杉醇剂量3μM，空白组加入等体积的溶剂 DMSO；按上述操作测定吸光值。结果，随聚乙二醇修饰的微管蛋白解聚剂浓度增加，聚合抑制率逐渐升高，说明有聚合能力的微管蛋白随药物浓度的增加而不断增强。

实施例2

聚乙二醇修饰的微管蛋白解聚剂对体外培养肿瘤细胞的生长和存活IC50。

采用 MTT 比色法。将对数生长的U937细胞，以 1.0×105加入 96 孔培养板中，培养 24h，实验孔、阳性药物对照孔分别加入不同浓度的实验药物聚乙二醇修饰的微管蛋白解聚剂和阳性对照药物紫杉醇；空白组加入相同体积的溶剂。每孔设五个复孔，培养 48h，分别在0h、2h、8h、14h、20h、24h、36h、，48h 每孔加入 MTT，作用 4h 后，加入 DMSO，孵育 30min，在酶标仪 620nm 处测定吸光度 A 值，按公式肿瘤细胞生长抑制率＝（1-实验组吸光值/对照组吸光值）×100％。计算出实验药物的 IC50 为5.43μM。

实施例3

用肿瘤模型检测聚乙二醇修饰的微管蛋白解聚剂的体内活力。

建立U937肿瘤模型，阳性对照药物紫杉醇；空白组加入相同体积的溶剂， 实验组设3个剂量：0.75、1.5μM、3μM mg/Kg。21天后，观察小鼠存活数量，计算存活率。结果显示，聚乙二醇修饰的微管蛋白解聚剂可有效地保护小白鼠，提高荷瘤小鼠的生存率，生存率达到79.1%。

序列表

        SEQUENCE LISTING

<110> 南通诚信氨基酸有限公司

 <120>  一种聚乙二醇修饰的微管蛋白解聚剂多肽及其应用

<130> 

<160>  1    

<170>  PatentIn version 3.3

<210>  1

<211>  8

<212>  PRT

<213>  人工序列

<400>  1

mPEG-SC10k- Cys Arg Ala Leu Glu Arg Leu Val

1                                                            5

 

Methoxy-PEG-Succinimidyl Carbonate

 

Claims (3)

1.一种聚乙二醇修饰的微管蛋白解聚剂多肽，其特征在于其序列为mPEG-SC_10k-CRALERLV。

2.根据权利要求1所述的一种聚乙二醇修饰的微管蛋白解聚剂多肽，其特征在于所述的mPEG-SC的分子量为10000。

3.根据权利要求1所述的一种聚乙二醇修饰的微管蛋白解聚剂多肽在制备治疗肿瘤药物中的应用，其特征在于所述的肿瘤为起源于人的胃部、皮肤、头颈部、甲状腺、胰腺、肺脏、食管、乳腺、肾脏、胆囊、结肠/直肠、卵巢、子宫、子宫颈、前列腺、膀胱、睾丸的原发/继发的癌或肉瘤。