CN103254282A - 一种微管蛋白解聚剂多肽5及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及药物领域，具体涉及具有抑制微管蛋白聚合，治疗治疗急性淋巴细胞性白血病的多肽。其序列为CRALERLV是全新的序列，它们可以在1微摩尔水平上体外抑制微管蛋白聚合，并在体内试验中提高荷瘤小鼠生存率，具有潜在的新药开发价值。

Description

一种微管蛋白解聚剂多肽5及其应用

技术领域

本发明涉及微管蛋白解聚剂多肽5及其应用，具体涉及具有抑制微管蛋白聚合、治疗急性淋巴细胞性白血病的多肽。

背景技术

急性淋巴细胞性白血病（ALL）是一种进行性恶性疾病，其特征为大量的类似于淋巴母细胞的未成熟白细胞。这些细胞可在血液、骨髓、淋巴结、脾脏和其它器官中发现。急性淋巴细胞性白血病占儿童急性白血病的80%，发病率高峰在3岁至7岁之间。ALL也可发生于成年人，占所有成年人白血病的20%。近年来随着医学研究的深入，对急性淋巴细胞性白血病的认识和治疗取得了很大进展。其中，微管蛋白在急性淋巴细胞性白血病中扮演着重要角色。

微管是细胞骨架的主要组成部分， 由α-微管蛋白和β-微管蛋白异二聚体组成， 具有中空管状结构的特点。此外，还有一种γ微管蛋白，它不是微管的组成成分，但参与微管的组装。微管具有聚合和解聚的动力学特性，在维持细胞形态、细胞分裂、信号转导及物质输送等过程中起着重要作用。微管在细胞分裂前期聚合成为纺锤体，而纺锤体在有丝分裂中牵引染色体向两极移动进入两个子细胞中，完成细胞增殖。微管的组装过程是α-和β-微管蛋白异性二聚体之间紧密的非共价相互作用，这一过程是受GTP水解驱动的。异性二聚体不断地在微管的正极生长，在负极收缩，并且维持动态稳定。当微管的动态稳定性被破坏时，细胞的有丝分裂过程就有可能被阻止，从而导致细胞死亡。由于微管在细胞分裂中具有极其重要的作用，现已成为抗肿瘤药物研究的重要靶点之一。

微管蛋白抑制剂有两种分类方法。一种是根据作用机制的不同分为两种类型：① 抑制微管蛋白聚合的微管蛋白解聚剂； ② 促进微管蛋白聚合的微管蛋白聚合剂。

抑制微管蛋白聚合的微管蛋白解聚剂有长春碱类、秋水仙碱等化合物，多用于肿瘤治疗。这类化合物其特点是作用于微管的长春碱位点的微管蛋白解聚剂。研究表明， 长春碱类药物作用于细胞微管蛋白并干扰细胞周期的有丝分裂阶段，抑制微管聚合，阻止纺锤体微管的形成，从而阻止肿瘤细胞分裂增殖。该类生物碱自发现具有抗肿瘤活性以来，已有长春碱 (vinblastine，15)、长春新碱 (vincristine，16)、长春地辛 (vindesine，17)和长春瑞滨 (vinorelbine，18) 用于临床治疗，而长春氟宁 (vinflunine，19)、长春甘酯(vinglycinate，20) 及脱水长春碱 (anhydrovinblastine，21) 正处于临床研究阶段。但这些都有自身的缺陷，如长春碱与作用靶点亲和力小，药效不强。长春新碱有两个重要的因素限制了它在临床上的应用：（1）长春新碱神经系统毒性和局部刺激性较大；（2）水溶性相对较低，吸收能力差。

因此，需要开发水溶性好，特异性强的微管蛋白解聚剂用于治疗急性淋巴细胞白血病。微管蛋白解聚剂包括大分子和小分子。 大分子解聚剂的制备和使用限制了它们的发展，例如重组人微管蛋白抑制因子的体内半衰期只有4分钟。很多成功的小分子解聚剂，可以在纳摩尔水平上抑制微管蛋白的活力，但小分子解聚剂缺乏特异性，如果在慢性疾病中长期使用缺乏特异性的微管蛋白解聚剂可产生较大副作用。 因而，从微管蛋白解聚剂的应用角度来看，以急性淋巴细胞白血病作为研究对象是正确的选择。在急性反应期，机体能够耐受短期的、微管蛋白广谱解聚剂对正常生理功能的抑制，同时使关键组织器官的生理结构免受破坏，增加了生存几率。

本专利中的微管蛋白解聚剂多肽5已证明在急性淋巴细胞白血病中有效，具有在其他肿瘤模型中开发的前景。

发明内容

发明目的

    本发明提供全新的序列，该序列微管蛋白解聚剂，对急性淋巴细胞白血病具有很好的疗效。

技术方案

    微管蛋白解聚剂多肽5，其特征在于其序列为SEIPEIIHM。

微管蛋白解聚剂多肽5在制备治疗急性淋巴细胞白血病药物中的应用。

有益效果

利用固相合成法化学合成微管蛋白解聚剂多肽5，该多肽具有全新的序列，该多肽可体外抑制微管蛋白，治疗急性淋巴细胞白血病。在内毒素休克模型实验中成功的增加了小鼠的生存率。我们发现的多肽解聚剂可以同时抑制微管蛋白聚合活力，并在体内试验中提高荷瘤小鼠生存率，具有潜在的新药开发价值。

具体实施方式

本发明涉及的肽由上海生工合成。

实施例1

微管蛋白解聚剂多肽5对体外微管蛋白聚合与解聚的作用。

取新鲜牛脑组织，剥去脑膜和大的血管，剪碎，用冷 MES 缓冲液洗涤 1-2 次，以每克脑组织 0.5-1ml 的比例加入 MES 缓冲液，在 4℃下，用电动匀浆器匀浆;4℃，105000g 离心 1h，取上清，加入等体积的微管聚合缓冲液，37℃水浴保温 30min。26℃，105000g 离心 1h，取沉淀，加入约 1/10 匀浆体积的冷 MES 缓冲液，轻轻搅拌或用匀浆器将沉淀碾碎；将悬液放冰浴 30min，使沉淀完全溶解。用 Lowry’s法测定蛋白含量（SDS 聚酰胺凝胶电泳法）。微管蛋白用 MES 缓冲液稀释至 4-5mg/ml，置液氮中保存。取冷冻的微管蛋白溶液，快速用常温水冲其壁，使之融化，放入冰浴，用 MES 缓冲液稀释至所需浓度（2-3mg/ml），加入 ATP至 1mmol/l。以从冰浴中马上取出的微管蛋白溶液在分光光度计 350nm处调定为“0”点。然后将比色杯在37℃温度下测定微管蛋白溶液的 OD值，连续 20-30min，记录温度-吸光值曲线（T-OD 曲线），重复三次。

抑制率计算：抑制率（%）=（对照管“OD”值－加药管“OD”值）／对照管“OD”

实验组设五个剂量：0.75μM、1.5μM、3μM、12μM、24μM，阳性对照组长春新碱剂量3μM，空白组加入等体积的溶剂DMSO；按上述操作测定吸光值。结果，随微管蛋白解聚剂多肽5浓度增加，聚合抑制率逐渐下降，说明有聚合能力的微管蛋白随药物浓度的增加而不断减少。

实施例2

微管蛋白解聚剂多肽5对体外培养肿瘤细胞的生长和存活IC50。

采用MTT 比色法。将对数生长的U937细胞，以 1.0×105加入 96 孔培养板中，培养 24h，实验孔、阳性药物对照孔分别加入不同浓度的实验药物微管蛋白解聚剂多肽5和阳性对照药物长春新碱；空白组加入相同体积的溶剂。每孔设五个复孔，培养 48h，分别在0h、2h、8h、14h、20h、24h、36h、，48h 每孔加入MTT，作用4h后，加入 DMSO，孵育 30min，在酶标仪 620nm 处测定吸光度 A 值，按公式肿瘤细胞生长抑制率＝（1-实验组吸光值/对照组吸光值）×100％。计算出实验药物的 IC50 为13.24μM。

实施例3

用肿瘤模型检测微管蛋白解聚剂多肽5的体内活力。

建立U937肿瘤模型，阳性对照药物长春新碱；空白组加入相同体积的溶剂，实验组设3个剂量：0.75、1.5μM、3μM mg/Kg。21天后，观察小鼠存活数量，计算存活率。结果显示，微管蛋白解聚剂多肽5可有效地保护小白鼠，提高荷瘤小鼠的生存率，生存率达到73.1%。

                                    SEQUENCE LISTING

<110>  苏州普罗达生物科技有限公司

 <120>  一种微管蛋白解聚剂多肽5及其应用

<130> 

<160>  1    

<170>  PatentIn version 3.3

<210>  1

<211>  9

<212>  PRT

<213>  人工序列

<400>  1

Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met

 1            5

 

Claims (2)

1.微管蛋白解聚剂多肽5，其特征在于其序列为SEIPEIIHM,即为Seq NO.1。

2.微管蛋白解聚剂多肽5在制备、治疗急性淋巴细胞性白血病药物中的应用。