CN103864884A - 紫丹参甲素磺酸钠的制备方法 - Google Patents
紫丹参甲素磺酸钠的制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103864884A CN103864884A CN201410093550.2A CN201410093550A CN103864884A CN 103864884 A CN103864884 A CN 103864884A CN 201410093550 A CN201410093550 A CN 201410093550A CN 103864884 A CN103864884 A CN 103864884A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- mobile phase
- water
- phase
- methyl alcohol
- triethylamine
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Landscapes
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了紫丹参甲素磺酸钠的制备方法。该制备方法包括下述步骤:采用高效液相反相色谱法分离丹参酮类磺化液,即可;其中,高效液相反相色谱法的条件如下:流动相A为0.1%三乙胺-水、流动相B为0.1%三乙胺-甲醇;或,流动相A为0.1%二乙胺-水、流动相B为0.1%二乙胺-甲醇;或,流动相A为0.1%乙胺-水、流动相B为0.1%乙胺-甲醇;或,流动相A为水、流动相B为甲醇;百分比为组分占流动相的体积百分比;检测波长为271nm。本发明的制备方法制备能力强、制备量大、周期短、效率高,并且减少了有机溶剂的使用,工艺操作连续性强易于进行质量控制和生产。
Description
技术领域
本发明涉及药物领域,具体涉及紫丹参甲素磺酸钠的制备方法。
背景技术
丹参,又名血参、赤根、红根、血生根,为唇形科植物(Salvia miltiorrhza)的根茎,其入药始载于《神农本草经》。中医认为,其味苦微寒,具有活血痛经、祛瘀止痛、清心除烦、凉血消痈的功效,适用于治疗月经不调、痛经、经闭、崩漏、带下、冠心病、动脉粥样硬化、高血脂、心绞痛、跌打淤血、失眠、神经衰弱、乙肝等疾病,为妇科、内科及外伤科证属血瘀兼热者常用。
现代药学研究表明,丹参中化学成分复杂,主要为水溶性丹参酚酸类和脂溶性二萜醌类丹参酮类化合物。其中,丹参酮类化合物主要包括丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、丹参酮ⅡB、异丹参酮Ⅰ、异丹参酮ⅡA、隐丹参酮、异隐丹参酮、甲基丹参酮、羟基丹参酮等。
丹参酮ⅡA是重要的丹参有效成分。丹参酮ⅡA磺酸钠(SodiumTanshinoneⅡA Sulfonate,STS),则是丹参酮ⅡA经磺化后得到的水溶性磺酸盐。由于磺酸基的引入,在治疗冠心病、心绞痛、心肌梗塞等疾病方面,丹参酮ⅡA磺酸钠相比丹参酮IIA具有更多的优越性,从而成为主要的心血管类丹参提取物中药。
丹参酮IIA是制备丹参酮IIA磺酸钠的原料,从丹参药材饮片提取,故难免混有少量、或极低含量其他结构较为相似的组分,如丹参酮ⅡB、丹参酮I、隐丹参酮、紫丹参甲素等。若要制备高纯度丹参酮IIA磺酸钠,则获得这些极低含量相关组分标准品、以及这些标准品在丹参酮IIA磺酸钠原料相关成分含量控制中的应用,具有重要意义。
但是,由于该类化合物结构复杂,化学全合成难度大,要获得高纯度对照品成为挑战。有研究报道从丹参酮ⅡA磺酸钠原料药中提取相关物质,由于其含量极低,HPLC纯度通常不到百分之一,采用高效液相法分离提取,工作量大、难度高。因此,丹参提取物中极低含量组分的高纯度标准品规模化制备,及其在丹参酮IIA磺酸钠原料药相关物质含量监控中的应用成为本领域长期以来难以解决的技术难题。
紫丹参甲素也是丹参脂溶性二萜醌类化合物有效成分之一,不仅耐缺氧作用比丹参酮ⅡA更强,而且抗菌作用也强于隐丹参酮,并对多种实验肿瘤动物有效。
现有技术公开了紫丹参甲素提取方法,如专利CN02104328.0“高纯度紫丹参甲素的制备方法”和专利CN201210494022.9“紫丹参甲素的医药用途”均采用有机溶剂提取和硅胶柱分离,其分离效果差、流速低、制备量小、周期长;专利CN201210371880.4“一种紫丹参甲素的制备方法”采用闪式提取、超滤浓缩,其中透膜损失大、设备投入高;专利CN201310349682.2“一种紫丹参甲素的提取方法”采用超临界CO2逆流色谱提取,使用耐20MPa高压设备,投入成本大、风险高,后处理采用大孔树脂和重结晶,有机溶剂消耗量大,有效成分损失大、收率低。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于为了克服现有技术中紫丹参甲素提取困难、效率低的缺陷,提供了紫丹参甲素磺酸钠及其制备方法和应用。本发明的紫丹参甲素磺酸钠水溶性好,解决了紫丹参甲素脂溶性太大水溶性不好限制其在医药领域应用的问题,且纯度高,其制备方法的制备能力强、制备量大、周期短、效率高,并且减少了有机溶剂的使用,工艺操作连续性强易于进行质量控制和生产。
本发明通过以下技术方案解决上述技术问题。
本发明提供了紫丹参甲素磺酸钠,其结构如下式:
本发明还提供了上述紫丹参甲素磺酸钠的制备方法,其包括下述步骤:采用高效液相反相色谱法分离丹参酮类磺化液,即可;
其中,高效液相反相色谱法的条件如下:
流动相A为0.1%三乙胺-水、流动相B为0.1%三乙胺-甲醇;或,流动相A为0.1%二乙胺-水、流动相B为0.1%二乙胺-甲醇;或,流动相A为0.1%乙胺-水、流动相B为0.1%乙胺-甲醇;或,流动相A为水、流动相B为甲醇;百分比为组分占流动相的体积百分比;检测波长为271nm,保留时间为50~70min。
其中,所述的高效液相反相色谱法较佳地包括富集纯化、中间纯化和精制纯化,其中,所述的富集纯化的条件优选如下:
流动相A为0.1%三乙胺-水、流动相B为0.1%三乙胺-甲醇;或,流动相A为0.1%二乙胺-水、流动相B为0.1%二乙胺-甲醇;或,流动相A为0.1%乙胺-水、流动相B为0.1%乙胺-甲醇;或,流动相A为水、流动相B为甲醇;流速为80~120mL/min(较佳地为100mL/min),检测波长为271nm;
将丹参酮类磺化液与流动相A按体积比为1:4的混合物上样29~30min,80%流动相A+20%流动相B(体积分数)平衡1min,以流动相A和流动相B按照下述体积比进行线性梯度洗脱45min:80%A+20%B→35%A+65%B,再以100%流动相B再生10min,收集保留时间为50~70min的洗脱液得到富集纯化样品溶液;
采用美国Varian公司的PrepStar SD-1制备系统和L&L4002色谱柱(内径50mm),装Varian公司的PLRP-S反相C18聚合物填料160.0g(粒径10μm,孔径10nm),动态轴向压缩系统装填至压力650psi,静态锁紧至柱床高度25cm。
其中,所述的中间纯化的条件优选如下:
流动相A为0.1%三乙胺-水、流动相B为0.1%三乙胺-甲醇;或,流动相A为0.1%二乙胺-水、流动相B为0.1%二乙胺-甲醇;或,流动相A为0.1%乙胺-水、流动相B为0.1%乙胺-甲醇;或,流动相A为水、流动相B为甲醇;流速为80~120mL/min(较佳地为100mL/min),检测波长为271nm;
将上述富集纯化样品溶液与流动相A按体积比为1:1的混合物上样28min,80%流动相A+20%流动相B(体积分数)平衡1~2min,以流动相A和流动相B按照下述体积比进行线性梯度洗脱40min:80%A+20%B→40%A+60%B,再以100%流动相B再生10min,收集保留时间为50~65min的洗脱液得到中间纯化样品溶液;
采用美国Varian公司的PrepStar SD-1制备系统和L&L4002色谱柱(内径50mm),装Varian公司的PLRP-S反相C18聚合物填料160.0g(粒径10μm,孔径10nm),动态轴向压缩系统装填至压力650psi,静态锁紧至柱床高度25cm。
其中,所述的精制纯化的条件优选如下:
流动相A为0.1%三乙胺-水、流动相B为0.1%三乙胺-甲醇;或,流动相A为0.1%二乙胺-水、流动相B为0.1%二乙胺-甲醇;或,流动相A为0.1%乙胺-水、流动相B为0.1%乙胺-甲醇;或,流动相A为水、流动相B为甲醇;流速为20~30mL/min(较佳地为25mL/min),检测波长为271nm;
将上述中间纯化样品溶液与流动相A按体积比为1:1的混合物上样20min,80%流动相A+20%流动相B(体积分数)平衡4min,以流动相A和流动相B按照下述体积比进行线性梯度洗脱35min:80%A+20%B→45%A+55%B,再以100%流动相B再生10min,收集保留时间为50~60min的洗脱液得到精制纯化样品溶液;
采用美国Varian公司的PrepStar SD-1制备系统和L&L4001色谱柱(内径25mm),装日本YMC公司的ODS-AQ反相C18硅胶填料80.0g(粒径5μm,孔径12nm),动态轴向压缩系统装填至压力650psi,静态锁紧至柱床高度25cm。
其中,所述的丹参酮类磺化液可为本领域常规的丹参进行磺化反应的反应液,较佳地通过下述步骤制得:
(1)将丹参提取物溶解于冰醋酸-乙酸酐的混合溶液中,再加入浓硫酸-冰醋酸的混合溶液,进行反应得到反应液;
(2)将石油醚、二氯甲烷和水的混合溶液加入步骤(1)的反应液,再加入氯化钠溶液,抽滤,得到滤饼;
(3)用石油醚-二氯甲烷的混合溶液浸泡步骤(2)的滤饼,抽滤干燥得粗品;
(4)用甲醇溶解步骤(3)的粗品,活性炭过滤,滤液浓缩,冷却结晶过滤,滤液即为丹参酮类磺化液。
其中,所述的冰醋酸-乙酸酐的混合溶液与所述的丹参提取物的体积质量比较佳地为7~9ml/g。
其中,所述的冰醋酸-乙酸酐的混合溶液较佳地为冰醋酸与乙酸酐体积比为1:(2~3)的混合溶液。
其中,所述的浓硫酸-冰醋酸的混合溶液较佳地为浓硫酸与冰醋酸体积比为1:1的混合溶液,所述的浓硫酸的质量分数较佳地为98%。
其中,所述的石油醚、二氯甲烷和水的混合溶液较佳地为石油醚、二氯甲烷和水的体积比为1:2:(2~2.5)的混合溶液。
其中,所述的石油醚-二氯甲烷的混合溶液较佳地为石油醚与二氯甲烷体积比为1:3的混合溶液。
其中,所述的丹参提取物可为本领域常规方法得到的丹参提取物,较佳地通过下述步骤制得:将丹参用乙醇提取,过滤,滤液浓缩,干燥,即得。
本发明中,色谱柱的柱温较佳地为10~30℃。
本发明的制备方法中,所述的精致纯化结束后还可包括冻干过程。所述的冻干过程优选包括如下步骤:将所述的精制纯化样品溶液浓缩,冷冻干燥,即得纯净的紫丹参甲素磺酸钠。所述的浓缩的压力较佳地为-0.08MPa~-0.1MPa,所述的浓缩的温度较佳地为30~40℃,所述的冷冻干燥较佳地采用上海东富龙科技股份有限公司的LYO-1真空冷冻干燥机进行。
本发明中0.1%三乙胺-水是指三乙胺的体积分数为0.1%的三乙胺水溶液,0.1%三乙胺-甲醇是指三乙胺的体积分数为0.1%的三乙胺甲醇溶液,0.1%二乙胺-水是指二乙胺的体积分数为0.1%的二乙胺水溶液,0.1%二乙胺-甲醇是指指二乙胺的体积分数为0.1%的二乙胺甲醇溶液,0.1%乙胺-水是指乙胺的体积分数为0.1%的乙胺水溶液,0.1%乙胺-甲醇是指乙胺的体积分数为0.1%的乙胺甲醇溶液。
本发明还提供了上述紫丹参甲素磺酸钠在检测药品中紫丹参甲素磺酸钠含量的应用。
其中,所述的药品较佳地为丹参酮IIA磺酸钠原料药。
其中,所述的应用较佳地包括下述步骤:将丹参酮IIA磺酸钠原料药溶液和紫丹参甲素磺酸钠标准品溶液分别进行高效液相色谱检测,根据紫丹参甲素磺酸钠标准品色谱图的保留时间确定丹参酮IIA磺酸钠原料药色谱图中相关物质的峰,并计算丹参酮IIA磺酸钠原料药中紫丹参甲素磺酸钠的含量。
其中,所述的高效液相色谱的条件优选如下:流动相为甲醇:20mmol/L磷酸氢二钠溶液=65:35(体积比),pH为6.0,柱温为25℃,检测波长为271nm,流速为1.0mL/min,进样量20μL,丹参酮IIA磺酸钠原料药溶液的浓度为0.2mg/mL,紫丹参甲素磺酸钠标准品溶液的浓度为0.2mg/mL;记录色谱图至主成分峰保留时间的3倍;控制丹参酮IIA磺酸钠原料药溶液中紫丹参甲素磺酸钠单个最大杂质峰面积不得大于紫丹参甲素磺酸钠标准品溶液峰面积3倍(单个杂质含量不超过2.0%),总杂质峰面积之和不得大于紫丹参甲素磺酸钠标准品溶液峰面积8倍(总杂质含量不超过5.0%)。
其中,所述的紫丹参甲素磺酸钠标准品溶液较佳地为紫丹参甲素磺酸钠溶于流动相所形成的溶液。
其中,所述的丹参酮IIA磺酸钠原料药溶液较佳地为丹参酮IIA磺酸钠原料药溶于流动相所形成的溶液。
本发明还提供了一种药物制剂,其包括上述紫丹参甲素磺酸钠和药学上可接受的载体。
其中,所述的紫丹参甲素磺酸钠与所述的药学上可接受的载体的质量比较佳地为(1:4)~(1:7)。
其中,所述的药学上可接受的载体可为本领域药物制剂中常规使用的各种载体,较佳地包括葡萄糖、甘露醇、氯化钠、淀粉、碳酸钙、高岭土、结晶纤维素和硅酸中的一种或多种。
其中,所述的药物制剂的剂型可为本领域常规的剂型,较佳地为注射液或冻干粉针。
本发明的药物制剂中,每支或每瓶药物制剂可含有9~11mg紫丹参甲素磺酸钠,可含有40~60mg药学上可接受的载体。
本发明还提供了上述紫丹参甲素磺酸钠或药物制剂在制备治疗心血管疾病或治疗肿瘤性疾病药物中的应用。
在不违背本领域常识的基础上,上述各优选条件,可任意组合,即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于:
(1)本发明公开的紫丹参甲素磺酸钠是紫丹参甲素的磺化衍生物,其水溶性优于紫丹参甲酸,解决了紫丹参甲素脂溶性太大、水溶性不好从而限制其在医药领域应用的问题。
(2)本发明运用制备高效液相反相色谱分离技术进行纯化,流速高上样量大,自动化程度高,先磺化后反相纯化,所得产品纯度高,制备能力强、制备量大、周期短、效率高并且减少了有机溶液的使用,工艺操作连续性强,易于进行质量控制和生产。
(3)本发明还公开了一种检测方法,可将紫丹参甲素磺酸钠作为标准品,对丹参酮IIA磺酸钠原料药中的紫丹参甲素磺酸钠的含量进行检测和控制。
附图说明
图1为紫丹参甲素磺酸钠和紫丹参甲素对Hep G-2细胞增殖的影响图谱。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明,但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,按照常规方法和条件,或按照商品说明书选择。
下述实施例中的室温是指25℃。0.1%三乙胺-水是指三乙胺的体积分数为0.1%的三乙胺水溶液,0.1%三乙胺-甲醇是指三乙胺的体积分数为0.1%的三乙胺甲醇溶液,0.1%二乙胺-水是指二乙胺的体积分数为0.1%的二乙胺水溶液,0.1%二乙胺-甲醇是指指二乙胺的体积分数为0.1%的二乙胺甲醇溶液,0.1%乙胺-水是指乙胺的体积分数为0.1%的乙胺水溶液,0.1%乙胺-甲醇是指乙胺的体积分数为0.1%的乙胺甲醇溶液。
实施例1
丹参酮类化合物的提取
称取粉碎的丹参药材(产地:云南、甘孜、阿坝地区)3kg,加入质量分数为90%的乙醇14L,40℃水浴提取2小时。分别用350目滤布和滤纸过滤除去药材渣和泥土,将滤液浓缩至1.4L,4℃静置24小时,静置后的滤液滤纸过滤,过滤所得固体40℃真空干燥,得丹参酮类化合物红色固体粉末65.0g。
实施例2
丹参酮类化合物的磺化反应及后处理
取实施例1中的60g丹参酮类化合物,加入140mL冰醋酸和360mL乙酸酐,搅拌冷却混悬液至0℃。在搅拌状态下,向60mL冰醋酸中加入60mL98%浓硫酸,配制成混酸溶液并静置冷却至室温。滴加混酸溶液,维持反应温度10℃,继续保温反应90min。按300mL石油醚+600mL二氯甲烷+650mL纯化水配制稀释用液,搅拌冷却至4℃。在搅拌状态下,向稀释用液中缓慢加入上述反应液,并强化冷却效果,保证体系温度低于25℃。在2L纯化水中加入700g氯化钠,充分搅拌配制饱和食盐水。将已稀释的反应液加入到饱和食盐水中,温度控制在25℃,继续搅拌25min后静置30min,真空抽滤得到滤饼。在300mL石油醚和900mL二氯甲烷组成的混合溶液中,分散滤饼并常温搅拌20min,浸泡12小时,再次真空抽滤并干燥得丹参酮类磺酸钠粗品。在5L的反应瓶中投入甲醇3.8L和上述丹参酮类磺酸钠粗品,搅拌加热,溶清后加入16g的针用活性炭,加热至回流并保持此状态50min,温度控制在64±1℃,趁热抽滤,滤液在-0.09MPa下通过旋转蒸发仪减压蒸馏,待蒸出约75%体积的甲醇后将料液4℃冷却结晶12小时,再将料液抽滤分离得滤液,旋蒸浓缩两倍后,经0.22μm有机相微孔滤膜进行过滤澄清,得1L滤液,即丹参酮类磺化液。
实施例3
紫丹参甲素磺酸钠的制备纯化
(1)富集纯化:采用美国Varian公司的PrepStar SD-1制备系统和L&L4002色谱柱(内径50mm),自装该公司PLRP-S反相C18聚合物填料160.0g(粒径10μm,孔径10nm),动态轴向压缩系统装填至压力650psi,静态锁紧至柱床高度25cm。富集条件为:流动相A为0.1%三乙胺-水,流动相B为0.1%三乙胺-甲醇,流速为100mL/min,检测波长为271nm,柱温为室温,将实施例2的丹参酮类磺化液与流动相A按体积比为1:4的混合物上样30min,80%流动相A+20%流动相B平衡1min,以流动相A和流动相B按照下述体积比进行线性梯度洗脱45min:80%A+20%B→35%A+65%B,再以100%流动相B再生10min,根据紫外检测结果按峰收集保留时间54-64min的洗脱液得到富集纯化样品溶液。
再通过高效液相色谱法跟踪检测HPLC纯度。检测条件如下:
仪器:美国Waters公司2695-2489高效液相系统,色谱柱:Agilent ExtendC18、4.6×150mm、5μm,流动相:A为0.1%三乙胺-水、B为0.1%三乙胺-甲醇,柱温25℃,流速1mL/min,检测波长271nm,上样量20μL,自动上样。以流动相A与流动相B按照下述体积比进行线性梯度洗脱:0min:90%A+10%B→5min:80%A+20%B→10min:65%A+35%B→25min:50%A+50%B→30min:90%A+10%B。
检测结果显示:丹参酮类磺化液中紫丹参甲素磺酸钠的HPLC纯度为32.62%,保留时间为19.12min。富集纯化样品溶液中紫丹参甲素磺酸钠的HPLC纯度为52.73%,保留时间为19.26min。
(2)中间纯化:采用美国Varian公司的PrepStar SD-1制备系统和L&L4002色谱柱(内径50mm),自装该公司PLRP-S反相C18聚合物填料160.0g(粒径10μm,孔径10nm),动态轴向压缩系统装填至压力650psi,静态锁紧至柱床高度25cm。中间纯化条件为:流动相A为0.1%三乙胺-水,流动相B为0.1%三乙胺-甲醇,流速为100mL/min,检测波长为271nm,柱温为室温,将上述富集纯化样品溶液与流动相A按体积比为1:1的混合物上样28min,80%流动相A+20%流动相B平衡1min,以流动相A和流动相B按照下述体积比进行线性梯度洗脱40min:80%A+20%B→40%A+60%B,再以100%流动相B再生10min,根据紫外检测结果按峰收集保留时间50-60min的洗脱液得到中间纯化样品溶液。
再通过高效液相色谱法跟踪检测HPLC纯度。检测条件如下:
仪器:美国Waters公司2695-2489高效液相系统,色谱柱:Agilent ExtendC18、4.6×150mm、5μm,流动相:A为0.1%三乙胺-水、B为0.1%三乙胺-甲醇,柱温25℃,流速1mL/min,检测波长271nm,上样量20μL,自动上样。以流动相A与流动相B按照下述体积比进行线性梯度洗脱:0min:90%A+10%B→5min:80%A+20%B→10min:65%A+35%B→25min:50%A+50%B→30min:90%A+10%B。
检测结果显示:中间纯化样品溶液中紫丹参甲素磺酸钠的HPLC纯度为82.45%,保留时间为19.02min。
(3)精制纯化:采用美国Varian公司的PrepStar SD-1制备系统和L&L4001色谱柱(内径25mm),自装填料为日本YMC公司的ODS-AQ反相C18硅胶填料80.0g(粒径5μm,孔径12nm),动态轴向压缩系统装填至压力650psi,静态锁紧至柱床高度25cm。精致纯化条件为:流动相A为0.1%三乙胺-水,流动相B为0.1%三乙胺-甲醇,流速为25mL/min,检测波长为271nm,柱温为室温,将上述中间纯化样品溶液与流动相A按体积比为1:1的混合物上样20min,80%流动相A+20%流动相B平衡4min,以流动相A和流动相B按照下述体积比进行线性梯度洗脱35min:80%A+20%B→45%A+55%B,再以100%流动相B再生10min,收集保留时间为51~57min的洗脱液得到精制纯化样品溶液。
再通过高效液相色谱法跟踪检测HPLC纯度。检测条件如下:
仪器:美国Waters公司2695-2489高效液相系统,色谱柱:Agilent ExtendC18、4.6×150mm、5μm,流动相:A为0.1%三乙胺-水、B为0.1%三乙胺-甲醇,柱温25℃,流速1mL/min,检测波长271nm,上样量20μL,自动上样。以流动相A与流动相B按照下述体积比进行线性梯度洗脱:0min:90%A+10%B→5min:80%A+20%B→10min:65%A+35%B→25min:50%A+50%B→30min:90%A+10%B。
检测结果显示:精制纯化样品溶液中紫丹参甲素磺酸钠的HPLC纯度为97.58%,保留时间为19.15min。
(4)冻干:将上述精制样品溶液8L于旋转蒸发仪(上海申生科技有限公司R1002B)、在温度30℃~40℃、压力-0.08MPa~-0.1MPa的条件下,浓缩除甲醇至6L;分装入不锈钢托盘中,液面高度控制在0.5~1.0cm,盖上纱布送入真空冷冻干燥机(上海东富龙科技股份有限公司LYO-1)按照预先设计好的冻干曲线进行冷冻干燥,得到紫丹参甲素磺酸钠无定形红棕色粉末12g。
采用高效液相色谱法检测产品的HPLC纯度。检测条件如下:
仪器:美国Waters公司2695-2489高效液相系统,色谱柱:Agilent ExtendC18、4.6×150mm、5μm,流动相:A为0.1%三乙胺-水、B为0.1%三乙胺-甲醇,柱温25℃,流速1mL/min,检测波长271nm,上样量20μL,自动上样。以流动相A与流动相B按照下述体积比进行线性梯度洗脱:0min:90%A+10%B→5min:80%A+20%B→10min:65%A+35%B→25min:50%A+50%B→30min:90%A+10%B。
产品的HPLC纯度为97.30%,保留时间为18.40min。
质谱鉴定:采用美国Waters公司超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱联用仪(UMS)对上述精制样品进行质谱鉴定,测得其分子离子峰C19H17O7S-([M-Na]-)质荷比(m/z)为389.06,符合紫丹参甲素磺酸钠质谱理论相对分子量412.39,分子式为C19H17O7SNa。
核磁共振鉴定:采用德国Bruker公司AvanceIII400MHz核磁共振波谱仪对上述粉末产物进行测定,紫丹参甲素磺酸钠的碳编号如下所示。
1H-NMR(D2O,400MHz,ppm)数据表明,两个特异性的氢化学位移信号δH7.62(1H,J=8.0Hz,d,H-7)和δH7.27(1H,J=8.0Hz,d,H-6),以及三个亚甲基氢化学位移信号δH2.72(2H,J=6.0Hz,t,H-1),δH1.63(2H,m,H-2)和δH1.54(2H,m,H-3)说明了其具有萘醌并呋喃环结构骨架;δH4.80(2H,s,H-17)因为是单峰,推定其为连在17位的-CH2OH;另外两个甲基氢信号δH1.22(3H,s,H-18)和δH1.22(3H,s,H-19)分别是18、19位上的甲基信号,符合紫丹参甲素结构,差异在于15位H信号消失,说明15位为磺化反应位置;结合13C-NMR(D2O,100 MHz,ppm),δC:29.5(C-1),18.3(C-2),36.8(C-3),34.3(C-4),145.5(C-5),134.7(C-6),122.7(C-7),125.3(C-8),125.0(C-9),150.7(C-10),181.5(C-11),174.6(C-12),118.3(C-13),161.4(C-14),120.9(C-15),152.2(C-16),30.7(C-17),30.8(C-18),52.7(C-19),结果表明该物质为紫丹参甲素磺酸钠。
实施例4
紫丹参甲素磺酸钠的制备纯化
(1)富集纯化:采用美国Varian公司的PrepStar SD-1制备系统和L&L4002色谱柱(内径50mm),自装该公司PLRP-S反相C18聚合物填料160.0g(粒径10μm,孔径10nm),动态轴向压缩系统装填至压力650psi,静态锁紧至柱床高度25cm。富集条件为:流动相A为0.1%二乙胺-水,流动相B为0.1%二乙胺-甲醇,流速为100mL/min,检测波长为271nm,柱温为室温,将实施例2的丹参酮类磺化液与流动相A按体积比为1:4的混合物上样29min,80%流动相A+20%流动相B平衡1min,以流动相A和流动相B按照下述体积比进行线性梯度洗脱45min:80%A+20%B→35%A+65%B,再以100%流动相B再生10min,根据紫外检测结果按峰收集保留时间53-66min的洗脱液得到富集纯化样品溶液。
再通过高效液相色谱法跟踪检测HPLC纯度。检测条件如下:
仪器:美国Waters公司2695-2489高效液相系统,色谱柱:Agilent ExtendC18、4.6×150mm、5μm,流动相:A为0.1%三乙胺-水、B为0.1%三乙胺-甲醇,柱温25℃,流速1mL/min,检测波长271nm,上样量20μL,自动上样。以流动相A与流动相B按照下述体积比进行线性梯度洗脱:0min:90%A+10%B→5min:80%A+20%B→10min:65%A+35%B→25min:50%A+50%B→30min:90%A+10%B。
检测结果显示:丹参酮类磺化液中紫丹参甲素磺酸钠的HPLC纯度为32.65%,保留时间为19.12min。富集纯化样品溶液中紫丹参甲素磺酸钠的HPLC纯度为51.64%,保留时间为19.36min。
(2)中间纯化:采用美国Varian公司的PrepStar SD-1制备系统和L&L4002色谱柱(内径50mm),自装该公司PLRP-S反相C18聚合物填料160.0g(粒径10μm,孔径10nm),动态轴向压缩系统装填至压力650psi,静态锁紧至柱床高度25cm。中间纯化条件为:流动相A为0.1%二乙胺-水,流动相B为0.1%二乙胺-甲醇,流速为100mL/min,检测波长为271nm,柱温为室温,将上述富集纯化样品溶液与流动相A按体积比为1:1的混合物上样28min,80%流动相A+20%流动相B平衡2min,以流动相A和流动相B按照下述体积比进行线性梯度洗脱40min:80%A+20%B→40%A+60%B,再以100%流动相B再生10min,根据紫外检测结果按峰收集保留时间50-62min的洗脱液得到中间纯化样品溶液。
再通过高效液相色谱法跟踪检测HPLC纯度。检测条件如下:
仪器:美国Waters公司2695-2489高效液相系统,色谱柱:Agilent ExtendC18、4.6×150mm、5μm,流动相:A为0.1%三乙胺-水、B为0.1%三乙胺-甲醇,柱温25℃,流速1mL/min,检测波长271nm,上样量20μL,自动上样。以流动相A与流动相B按照下述体积比进行线性梯度洗脱:0min:90%A+10%B→5min:80%A+20%B→10min:65%A+35%B→25min:50%A+50%B→30min:90%A+10%B。
检测结果显示:中间纯化样品溶液中紫丹参甲素磺酸钠的HPLC纯度为81.72%,保留时间为19.22min。
(3)精制纯化:采用美国Varian公司的PrepStar SD-1制备系统和L&L4001色谱柱(内径25mm),自装填料为日本YMC公司的ODS-AQ反相C18硅胶填料80.0g(粒径5μm,孔径12nm),动态轴向压缩系统装填至压力650psi,静态锁紧至柱床高度25cm。精致纯化条件为:流动相A为0.1%二乙胺-水,流动相B为0.1%二乙胺-甲醇,流速为25mL/min,检测波长为271nm,柱温为室温,将上述中间纯化样品溶液与流动相A按体积比为1:1的混合物上样20min,80%流动相A+20%流动相B平衡4min,以流动相A和流动相B按照下述体积比进行线性梯度洗脱35min:80%A+20%B→45%A+55%B,再以100%流动相B再生10min,收集保留时间为50~57min的洗脱液得到精制纯化样品溶液。
再通过高效液相色谱法跟踪检测HPLC纯度。检测条件如下:
仪器:美国Waters公司2695-2489高效液相系统,色谱柱:Agilent ExtendC18、4.6×150mm、5μm,流动相:A为0.1%三乙胺-水、B为0.1%三乙胺-甲醇,柱温25℃,流速1mL/min,检测波长271nm,上样量20μL,自动上样。以流动相A与流动相B按照下述体积比进行线性梯度洗脱:0min:90%A+10%B→5min:80%A+20%B→10min:65%A+35%B→25min:50%A+50%B→30min:90%A+10%B。
检测结果显示:精制纯化样品溶液中紫丹参甲素磺酸钠的HPLC纯度为97.34%,保留时间为19.12min。
(4)冻干:将上述精制样品溶液8L于旋转蒸发仪(上海申生科技有限公司R1002B)、在温度30℃~40℃、压力-0.08MPa~-0.1MPa的条件下,浓缩除甲醇至6L;分装入不锈钢托盘中,液面高度控制在0.5~1.0cm,盖上纱布送入真空冷冻干燥机(上海东富龙科技股份有限公司LYO-1)按照预先设计好的冻干曲线进行冷冻干燥,得到紫丹参甲素磺酸钠无定形红棕色粉末12g。
采用高效液相色谱法检测产品的HPLC纯度。检测条件如下:
仪器:美国Waters公司2695-2489高效液相系统,色谱柱:Agilent ExtendC18、4.6×150mm、5μm,流动相:A为0.1%三乙胺-水、B为0.1%三乙胺-甲醇,柱温25℃,流速1mL/min,检测波长271nm,上样量20μL,自动上样。以流动相A与流动相B按照下述体积比进行线性梯度洗脱:0min:90%A+10%B→5min:80%A+20%B→10min:65%A+35%B→25min:50%A+50%B→30min:90%A+10%B。
产品的HPLC纯度为97.16%,保留时间为18.52min。
同样进行质谱鉴定与核磁鉴定,结果表明该物质为紫丹参甲素磺酸钠。
实施例5
紫丹参甲素磺酸钠的制备纯化
(1)富集纯化:采用美国Varian公司的PrepStar SD-1制备系统和L&L4002色谱柱(内径50mm),自装该公司PLRP-S反相C18聚合物填料160.0g(粒径10μm,孔径10nm),动态轴向压缩系统装填至压力650psi,静态锁紧至柱床高度25cm。富集条件为:流动相A为0.1%乙胺-水,流动相B为0.1%乙胺-甲醇,流速为100mL/min,检测波长为271nm,柱温为室温,将实施例2的丹参酮类磺化液与流动相A按体积比为1:4的混合物上样29min,80%流动相A+20%流动相B平衡1min,以流动相A和流动相B按照下述体积比进行线性梯度洗脱45min:80%A+20%B→35%A+65%B,再以100%流动相B再生10min,根据紫外检测结果按峰收集保留时间53-67min的洗脱液得到富集纯化样品溶液。
再通过高效液相色谱法跟踪检测HPLC纯度。检测条件如下:
仪器:美国Waters公司2695-2489高效液相系统,色谱柱:Agilent ExtendC18、4.6×150mm、5μm,流动相:A为0.1%三乙胺-水、B为0.1%三乙胺-甲醇,柱温25℃,流速1mL/min,检测波长271nm,上样量20μL,自动上样。以流动相A与流动相B按照下述体积比进行线性梯度洗脱:0min:90%A+10%B→5min:80%A+20%B→10min:65%A+35%B→25min:50%A+50%B→30min:90%A+10%B。
检测结果显示:丹参酮类磺化液中紫丹参甲素磺酸钠的HPLC纯度为32.66%,保留时间为19.12min。富集纯化样品溶液中紫丹参甲素磺酸钠的HPLC纯度为50.86%,保留时间为19.36min。
(2)中间纯化:采用美国Varian公司的PrepStar SD-1制备系统和L&L4002色谱柱(内径50mm),自装该公司PLRP-S反相C18聚合物填料160.0g(粒径10μm,孔径10nm),动态轴向压缩系统装填至压力650psi,静态锁紧至柱床高度25cm。中间纯化条件为:流动相A为0.1%乙胺-水,流动相B为0.1%乙胺-甲醇,流速为100mL/min,检测波长为271nm,柱温为室温,将上述富集纯化样品溶液与流动相A按体积比为1:1的混合物上样28min,80%流动相A+20%流动相B平衡2min,以流动相A和流动相B按照下述体积比进行线性梯度洗脱40min:80%A+20%B→40%A+60%B,再以100%流动相B再生10min,根据紫外检测结果按峰收集保留时间50-63min的洗脱液得到中间纯化样品溶液。
再通过高效液相色谱法跟踪检测HPLC纯度。检测条件如下:
仪器:美国Waters公司2695-2489高效液相系统,色谱柱:Agilent ExtendC18、4.6×150mm、5μm,流动相:A为0.1%三乙胺-水、B为0.1%三乙胺-甲醇,柱温25℃,流速1mL/min,检测波长271nm,上样量20μL,自动上样。以流动相A与流动相B按照下述体积比进行线性梯度洗脱:0min:90%A+10%B→5min:80%A+20%B→10min:65%A+35%B→25min:50%A+50%B→30min:90%A+10%B。
检测结果显示:中间纯化样品溶液中紫丹参甲素磺酸钠的HPLC纯度为82.36%,保留时间为19.32min。
(3)精制纯化:采用美国Varian公司的PrepStar SD-1制备系统和L&L4001色谱柱(内径25mm),自装填料为日本YMC公司的ODS-AQ反相C18硅胶填料80.0g(粒径5μm,孔径12nm),动态轴向压缩系统装填至压力650psi,静态锁紧至柱床高度25cm。精致纯化条件为:流动相A为0.1%乙胺-水,流动相B为0.1%乙胺-甲醇,流速为25mL/min,检测波长为271nm,柱温为室温,将上述中间纯化样品溶液与流动相A按体积比为1:1的混合物上样20min,80%流动相A+20%流动相B平衡4min,以流动相A和流动相B按照下述体积比进行线性梯度洗脱35min:80%A+20%B→45%A+55%B,再以100%流动相B再生10min,收集保留时间为50~58min的洗脱液得到精制纯化样品溶液。
再通过高效液相色谱法跟踪检测HPLC纯度。检测条件如下:
仪器:美国Waters公司2695-2489高效液相系统,色谱柱:Agilent ExtendC18、4.6×150mm、5μm,流动相:A为0.1%三乙胺-水、B为0.1%三乙胺-甲醇,柱温25℃,流速1mL/min,检测波长271nm,上样量20μL,自动上样。以流动相A与流动相B按照下述体积比进行线性梯度洗脱:0min:90%A+10%B→5min:80%A+20%B→10min:65%A+35%B→25min:50%A+50%B→30min:90%A+10%B。
检测结果显示:精制纯化样品溶液中紫丹参甲素磺酸钠的HPLC纯度为97.34%,保留时间为19.16min。
(4)冻干:将上述精制样品溶液8L于旋转蒸发仪(上海申生科技有限公司R1002B)、在温度30℃~40℃、压力-0.08MPa~-0.1MPa的条件下,浓缩除甲醇至6L;分装入不锈钢托盘中,液面高度控制在0.5~1.0cm,盖上纱布送入真空冷冻干燥机(上海东富龙科技股份有限公司LYO-1)按照预先设计好的冻干曲线进行冷冻干燥,得到紫丹参甲素磺酸钠无定形红棕色粉末12g。
采用高效液相色谱法检测产品的HPLC纯度。检测条件如下:
仪器:美国Waters公司2695-2489高效液相系统,色谱柱:Agilent ExtendC18、4.6×150mm、5μm,流动相:A为0.1%三乙胺-水、B为0.1%三乙胺-甲醇,柱温25℃,流速1mL/min,检测波长271nm,上样量20μL,自动上样。以流动相A与流动相B按照下述体积比进行线性梯度洗脱:0min:90%A+10%B→5min:80%A+20%B→10min:65%A+35%B→25min:50%A+50%B→30min:90%A+10%B。
产品的HPLC纯度为97.18%,保留时间为18.51min。
同样进行质谱鉴定与核磁鉴定,结果表明该物质为紫丹参甲素磺酸钠。
实施例6
紫丹参甲素磺酸钠的制备纯化
(1)富集纯化:采用美国Varian公司的PrepStar SD-1制备系统和L&L4002色谱柱(内径50mm),自装该公司PLRP-S反相C18聚合物填料160.0g(粒径10μm,孔径10nm),动态轴向压缩系统装填至压力650psi,静态锁紧至柱床高度25cm。富集条件为:流动相A为水,流动相B为甲醇,流速为100mL/min,检测波长为271nm,柱温为室温,将实施例2的丹参酮类磺化液与流动相A按体积比为1:4的混合物上样29min,80%流动相A+20%流动相B平衡1min,以流动相A和流动相B按照下述体积比进行线性梯度洗脱45min:80%A+20%B→35%A+65%B,再以100%流动相B再生10min,根据紫外检测结果按峰收集保留时间52-70min的洗脱液得到富集纯化样品溶液。
再通过高效液相色谱法跟踪检测HPLC纯度。检测条件如下:
仪器:美国Waters公司2695-2489高效液相系统,色谱柱:Agilent ExtendC18、4.6×150mm、5μm,流动相:A为0.1%三乙胺-水、B为0.1%三乙胺-甲醇,柱温25℃,流速1mL/min,检测波长271nm,上样量20μL,自动上样。以流动相A与流动相B按照下述体积比进行线性梯度洗脱:0min:90%A+10%B→5min:80%A+20%B→10min:65%A+35%B→25min:50%A+50%B→30min:90%A+10%B。
检测结果显示:丹参酮类磺化液中紫丹参甲素磺酸钠的HPLC纯度为32.67%,保留时间为19.12min。富集纯化样品溶液中紫丹参甲素磺酸钠的HPLC纯度为48.96%,保留时间为19.26min。
(2)中间纯化:采用美国Varian公司的PrepStar SD-1制备系统和L&L4002色谱柱(内径50mm),自装该公司PLRP-S反相C18聚合物填料160.0g(粒径10μm,孔径10nm),动态轴向压缩系统装填至压力650psi,静态锁紧至柱床高度25cm。中间纯化条件为:流动相A为水,流动相B为甲醇,流速为100mL/min,检测波长为271nm,柱温为室温,将上述富集纯化样品溶液与流动相A按体积比为1:1的混合物上样28min,80%流动相A+20%流动相B平衡2min,以流动相A和流动相B按照下述体积比进行线性梯度洗脱40min:80%A+20%B→40%A+60%B,再以100%流动相B再生10min,根据紫外检测结果按峰收集保留时间50-65min的洗脱液得到中间纯化样品溶液。
再通过高效液相色谱法跟踪检测HPLC纯度。检测条件如下:
仪器:美国Waters公司2695-2489高效液相系统,色谱柱:Agilent ExtendC18、4.6×150mm、5μm,流动相:A为0.1%三乙胺-水、B为0.1%三乙胺-甲醇,柱温25℃,流速1mL/min,检测波长271nm,上样量20μL,自动上样。以流动相A与流动相B按照下述体积比进行线性梯度洗脱:0min:90%A+10%B→5min:80%A+20%B→10min:65%A+35%B→25min:50%A+50%B→30min:90%A+10%B。
检测结果显示:中间纯化样品溶液中紫丹参甲素磺酸钠的HPLC纯度为80.12%,保留时间为19.18min。
(3)精制纯化:采用美国Varian公司的PrepStar SD-1制备系统和L&L4001色谱柱(内径25mm),自装填料为日本YMC公司的ODS-AQ反相C18硅胶填料80.0g(粒径5μm,孔径12nm),动态轴向压缩系统装填至压力650psi,静态锁紧至柱床高度25cm。精致纯化条件为:流动相A为水,流动相B为甲醇,流速为25mL/min,检测波长为271nm,柱温为室温,将上述中间纯化样品溶液与流动相A按体积比为1:1的混合物上样20min,80%流动相A+20%流动相B平衡4min,以流动相A和流动相B按照下述体积比进行线性梯度洗脱35min:80%A+20%B→45%A+55%B,再以100%流动相B再生10min,收集保留时间为50~59min的洗脱液得到精制纯化样品溶液。
再通过高效液相色谱法跟踪检测HPLC纯度。检测条件如下:
仪器:美国Waters公司2695-2489高效液相系统,色谱柱:Agilent ExtendC18、4.6×150mm、5μm,流动相:A为0.1%三乙胺-水、B为0.1%三乙胺-甲醇,柱温25℃,流速1mL/min,检测波长271nm,上样量20μL,自动上样。以流动相A与流动相B按照下述体积比进行线性梯度洗脱:0min:90%A+10%B→5min:80%A+20%B→10min:65%A+35%B→25min:50%A+50%B→30min:90%A+10%B。
检测结果显示:精制纯化样品溶液中紫丹参甲素磺酸钠的HPLC纯度为97.17%,保留时间为19.12min。
(4)冻干:将上述精制样品溶液8L于旋转蒸发仪(上海申生科技有限公司R1002B)、在温度30℃~40℃、压力-0.08MPa~-0.1MPa的条件下,浓缩除甲醇至6L;分装入不锈钢托盘中,液面高度控制在0.5~1.0cm,盖上纱布送入真空冷冻干燥机(上海东富龙科技股份有限公司LYO-1)按照预先设计好的冻干曲线进行冷冻干燥,得到紫丹参甲素磺酸钠无定形红棕色粉末12g。
采用高效液相色谱法检测产品的HPLC纯度。检测条件如下:
仪器:美国Waters公司2695-2489高效液相系统,色谱柱:Agilent ExtendC18、4.6×150mm、5μm,流动相:A为0.1%三乙胺-水、B为0.1%三乙胺-甲醇,柱温25℃,流速1mL/min,检测波长271nm,上样量20μL,自动上样。以流动相A与流动相B按照下述体积比进行线性梯度洗脱:0min:90%A+10%B→5min:80%A+20%B→10min:65%A+35%B→25min:50%A+50%B→30min:90%A+10%B。
产品的HPLC纯度为96.82%,保留时间为18.62min。
同样进行质谱鉴定与核磁鉴定,结果表明该物质为紫丹参甲素磺酸钠。
实施例7
紫丹参甲素磺酸钠作为标准品检测丹参酮ⅡA磺酸钠原料药中的相关物质
美国Waters公司的2695-2489高效液相系统和色谱柱Diamonsil C18(4.6×250mm,5μm);流动相为甲醇︰20mM磷酸氢二钠溶液=65︰35(体积比),稀磷酸调节pH至6.0;柱温为25℃,检测波长为271nm,流速为1.0mL/min;进样量20μL,取丹参酮ⅡA磺酸钠原料药和紫丹参甲素磺酸钠标准品适量,加流动相配制成各含10μg/mL的溶液,为系统预试验溶液;丹参酮ⅡA磺酸钠和紫丹参甲素磺酸钠及其他杂质峰的分离度应符合规定,理论塔板数按丹参酮ⅡA磺酸钠计算应不低于2000。
取丹参酮ⅡA磺酸钠原料药(批号见下表)2mg,置10mL量瓶中,加流动相溶液稀释至刻度,摇匀,作为供试品溶液;取紫丹参甲素磺酸钠20mg,置100mL量瓶中,加流动相溶液稀释至刻度,摇匀,作为标准品溶液;照色谱条件,取标准品溶液20μL注入色谱仪,调节检测灵敏度,使主成分峰高为满量程的10-25%,再分别取标准品溶液、供试液各20μL注入色谱仪,记录色谱图至供试液主成分峰保留时间的3倍;检测紫丹参甲素磺酸钠含量:控制紫丹参甲素磺酸钠单个最大杂质峰面积不得大于对照品溶液峰面积3倍(单个杂质含量不超过2.0%),总杂质峰面积之和不得大于对照品溶液的峰面积8倍(总杂质含量不超过5.0%)。结果见下表。
实施例8
紫丹参甲素磺酸钠作为对照品检测丹参酮ⅡA磺酸钠注射液中的相关物质
仪器:美国Waters公司2695-2489高效液相系统;色谱柱:DiamonsilC18(4.6×250mm,5μm);流动相为甲醇︰20mM磷酸氢二钠溶液(65︰35),稀磷酸调节pH至6.0;柱温为25℃,检测波长为271nm,流速为1.0mL/min;进样量20μL,取丹参酮ⅡA磺酸钠对照品和紫丹参甲素磺酸钠对照品适量,加流动相配制成各含10μg/mL的溶液,为系统预试验溶液,丹参酮ⅡA磺酸钠和紫丹参甲素磺酸钠及其他杂质峰的分离度应符合规定,理论塔板数按丹参酮ⅡA磺酸钠计算应不低于2000。
精密量取含丹参酮ⅡA磺酸钠2mg的丹参酮ⅡA磺酸钠注射液(批号见下),置10mL量瓶中,加流动相溶液稀释至刻度,摇匀,作为供试品溶液;取紫丹参甲素磺酸钠20mg,置100mL量瓶中,加流动相溶液稀释至刻度,摇匀,作为对照品溶液;照色谱条件,取对照溶液20μL注入色谱仪,调节检测灵敏度,使主成分峰高为满量程的10-25%,再分别取对照溶液、供试液各20μL注入色谱仪,记录色谱图至供试液主成分峰保留时间的3倍;检测紫丹参甲素磺酸钠含量:控制紫丹参甲素磺酸钠单个最大杂质峰面积不得大于对照品溶液峰面积3倍(单个杂质含量不超过2.0%),总杂质峰面积之和不得大于对照品溶液的峰面积8倍(总杂质含量不超过5.0%)。结果见下表。
实施例9
水溶解性的比较
紫丹参甲素与紫丹参甲素磺酸钠的水溶性比较见下表:
化合物 | 紫丹参甲素 | 紫丹参甲素磺酸钠 |
水溶性 | 不溶 | 溶解 |
实施例10
紫丹参甲素磺酸钠急性毒性试验
取体重18-22g的昆明种小鼠40只,雌雄各半,分别用小鼠单次腹腔注射、静脉注射或单次肌肉注射给药法进行给药。最大给药剂量0.4g/kg,给药后,4小时内密切观察,此后每日上下午各一次,连续观察14天,记录动物中毒症状出现时间、持续时间和恢复情况、外观体征及死亡情况,于第14天全部动物脱颈椎处死,并进行尸解,观察各主要脏器的改变。结果,动物外观、行为体重变化情况、对刺激的反应、分泌物、排泄物均正常,试验期间受试鼠未有死亡,试验结束,动物尸检受试鼠各脏器均为出现任何异常表现。该药物在0.4g/kg剂量下对小鼠无急性毒性反应,其安全性极高。
实施例11
紫丹参甲素磺酸钠对小鼠常压缺氧的影响
取丹参酮ⅡA磺酸钠为阳性对照组,紫丹参甲素磺酸钠为给药组,生理盐水做空白对照,每组各用小鼠12只,腹腔注射给药剂量为200mg/kg。给药后1小时,将小鼠放入磨口玻璃瓶内,瓶容量为150mL,内放稍许钠石灰,吸收CO2及水气。每瓶一鼠,放入后密封盖紧,开始记录其存活时间,以t测验比较组间均数差异的显著性。结果,空白对照组平均存活时间为19±4.5min,阳性对照组平均存活时间为27±4.1min,紫丹参甲素磺酸钠组平均存活时间为30±5.2min。丹参酮ⅡA磺酸钠和紫丹参甲素磺酸钠均能显著延长小鼠在缺氧情况下的存活时间,提高机体在低氧状态下利用氧的能力,且紫丹参甲素磺酸钠比丹参酮ⅡA磺酸钠延长时间要长,效果好。
实施例12
紫丹参甲素磺酸钠对人肝癌细胞株Hep G-2增殖的影响实验
在37℃,5%CO2条件下,将人肝癌细胞株Hep G-2培养24小时,将其按照每孔6000个细胞的密度接种至96孔板中,在上述条件下培养24小时后,设置空白对照组,分别再将紫丹参甲素、紫丹参甲素磺酸钠配制成0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0mg/L的不同浓度药液分别加入96孔板中,每组设五个复孔。在37℃,5%CO2条件下继续培养24小时,加入MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐)每孔20μL,继续孵育4小时,弃去上清液,加入150μL DMSO(二甲基亚砜),震荡15min,于酶标仪(瑞士Tecan公司M1000型)490nm处测吸光度OD值。实验结果如图1所示,当紫丹参甲素磺酸钠浓度大于2.0mg/L时,细胞的增殖活性明显下降,增殖率明显下降,并且其抑制增殖活性强于紫丹参甲素(增殖率=加药组OD值/空白对照组OD值)。
实施例13
紫丹参甲素磺酸钠注射液的制备
取紫丹参甲素磺酸钠10g,葡萄糖60g,加注射用水至2L(1000支量),搅拌加热至50℃使溶解,用1M氢氧化钠溶液调节pH值为4.8~5.2,加入4g针用活性炭,粗滤脱炭,再用0.22μm微孔滤膜精滤,检测中间体含量,灌装2mL/瓶,灭菌,即得紫丹参甲素磺酸钠注射液。
实施例14
紫丹参甲素磺酸钠冻干粉针的制备
取紫丹参甲素磺酸钠10g,甘露醇40g,加注射用水至2L(1000支量),搅拌加热至50℃使溶解,用1M氢氧化钠溶液调节pH值为4.8~5.2,加入4g针用活性炭,粗滤脱炭,再用0.22μm微孔滤膜精滤,检测中间体含量,合格后滤液2mL/瓶灌装入10mL管制西林瓶中,半压丁基橡胶塞,放入冻干机中按照预先设计好的冻干曲线进行冷冻干燥。干燥过程结束后压紧胶塞,出箱,铝塑组合盖轧盖即得紫丹参甲素磺酸钠冻干粉针。
Claims (8)
1.一种紫丹参甲素磺酸钠的制备方法,其包括下述步骤:采用高效液相反相色谱法分离丹参酮类磺化液,即可;
其中,高效液相反相色谱法的条件如下:
流动相A为0.1%三乙胺-水、流动相B为0.1%三乙胺-甲醇;或,流动相A为0.1%二乙胺-水、流动相B为0.1%二乙胺-甲醇;或,流动相A为0.1%乙胺-水、流动相B为0.1%乙胺-甲醇;或,流动相A为水、流动相B为甲醇;百分比为组分占流动相的体积百分比;检测波长为271nm,保留时间为50~70min。
2.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述的高效液相反相色谱法包括富集纯化、中间纯化和精制纯化;其中,所述的富集纯化的条件如下:
流动相A为0.1%三乙胺-水、流动相B为0.1%三乙胺-甲醇;或,流动相A为0.1%二乙胺-水、流动相B为0.1%二乙胺-甲醇;或,流动相A为0.1%乙胺-水、流动相B为0.1%乙胺-甲醇;或,流动相A为水、流动相B为甲醇;流速为80~120mL/min,检测波长为271nm;
将丹参酮类磺化液与流动相A按体积比为1:4的混合物上样29~30min,80%流动相A+20%流动相B平衡1min,以流动相A和流动相B按照下述体积比进行线性梯度洗脱45min:80%A+20%B→35%A+65%B,再以100%流动相B再生10min,收集保留时间为50~70min的洗脱液得到富集纯化样品溶液;
所述的中间纯化的条件如下:
流动相A为0.1%三乙胺-水、流动相B为0.1%三乙胺-甲醇;或,流动相A为0.1%二乙胺-水、流动相B为0.1%二乙胺-甲醇;或,流动相A为0.1%乙胺-水、流动相B为0.1%乙胺-甲醇;或,流动相A为水、流动相B为甲醇;流速为80~120mL/min,检测波长为271nm;
将所述的富集纯化样品溶液与流动相A按体积比为1:1的混合物上样28min,80%流动相A+20%流动相B平衡1~2min,以流动相A和流动相B按照下述体积比进行线性梯度洗脱40min:80%A+20%B→40%A+60%B,再以100%流动相B再生10min,收集保留时间为50~65min的洗脱液得到中间纯化样品溶液;
所述的精制纯化的条件如下:
流动相A为0.1%三乙胺-水、流动相B为0.1%三乙胺-甲醇;或,流动相A为0.1%二乙胺-水、流动相B为0.1%二乙胺-甲醇;或,流动相A为0.1%乙胺-水、流动相B为0.1%乙胺-甲醇;或,流动相A为水、流动相B为甲醇;流速为20~30mL/min,检测波长为271nm;
将所述的中间纯化样品溶液与流动相A按体积比为1:1的混合物上样20min,80%流动相A+20%流动相B平衡4min,以流动相A和流动相B按照下述体积比进行线性梯度洗脱35min:80%A+20%B→45%A+55%B,再以100%流动相B再生10min,收集保留时间为50~60min的洗脱液得到精制纯化样品溶液。
3.如权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述的富集纯化采用的装置如下:采用PrepStar SD-1制备系统和L&L4002色谱柱,装PLRP-S反相C18聚合物填料160.0g,动态轴向压缩系统装填至压力650psi,静态锁紧至柱床高度25cm;柱温为10~30℃;
和/或,所述的中间纯化采用的装置如下:采用PrepStar SD-1制备系统和L&L4002色谱柱,装PLRP-S反相C18聚合物填料160.0g,动态轴向压缩系统装填至压力650psi,静态锁紧至柱床高度25cm;柱温为10~30℃;
和/或,所述的精制纯化采用的装置如下:采用PrepStar SD-1制备系统和L&L4001色谱柱,装ODS-AQ反相C18硅胶填料80.0g,动态轴向压缩系统装填至压力650psi,静态锁紧至柱床高度25cm;柱温为10~30℃。
4.如权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述的富集纯化中,所述的流速为100mL/min;
和/或,所述的中间纯化中,所述的流速为100mL/min;
和/或,所述的精制纯化中,所述的流速为25mL/min。
5.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述的丹参酮类磺化液通过下述步骤制得:
(1)将丹参提取物溶解于冰醋酸-乙酸酐的混合溶液中,再加入浓硫酸-冰醋酸的混合溶液,进行反应得到反应液;
(2)将石油醚、二氯甲烷和水的混合溶液加入步骤(1)的反应液,再加入氯化钠溶液,抽滤,得到滤饼;
(3)用石油醚-二氯甲烷的混合溶液浸泡步骤(2)的滤饼,抽滤干燥得粗品;
(4)用甲醇溶解步骤(3)的粗品,活性炭过滤,滤液浓缩,冷却结晶过滤,滤液即为丹参酮类磺化液。
6.如权利要求5所述的制备方法,其特征在于,所述的冰醋酸-乙酸酐的混合溶液与所述的丹参提取物的体积质量比为7~9ml/g;
和/或,所述的冰醋酸-乙酸酐的混合溶液为冰醋酸与乙酸酐体积比为1:(2~3)的混合溶液;
和/或,所述的浓硫酸-冰醋酸的混合溶液为浓硫酸与冰醋酸体积比为1:1的混合溶液;
和/或,所述的石油醚、二氯甲烷和水的混合溶液为石油醚、二氯甲烷和水的体积比为1:2:(2~2.5)的混合溶液;
和/或,所述的石油醚-二氯甲烷的混合溶液为石油醚与二氯甲烷体积比为1:3的混合溶液;
和/或,所述的丹参提取物通过下述步骤制得:将丹参用乙醇提取,过滤,滤液浓缩,干燥,即得。
7.如权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述的精致纯化结束后还包括冻干过程;所述的冻干过程包括如下步骤:将所述的精制纯化样品溶液浓缩,冷冻干燥,即可。
8.如权利要求7所述的制备方法,其特征在于,所述的浓缩的压力为-0.08MPa~-0.1MPa,所述的浓缩的温度为30~40℃。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201410093550.2A CN103864884B (zh) | 2014-03-14 | 2014-03-14 | 紫丹参甲素磺酸钠的制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201410093550.2A CN103864884B (zh) | 2014-03-14 | 2014-03-14 | 紫丹参甲素磺酸钠的制备方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN103864884A true CN103864884A (zh) | 2014-06-18 |
CN103864884B CN103864884B (zh) | 2015-10-07 |
Family
ID=50903945
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201410093550.2A Active CN103864884B (zh) | 2014-03-14 | 2014-03-14 | 紫丹参甲素磺酸钠的制备方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN103864884B (zh) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105287462A (zh) * | 2015-12-03 | 2016-02-03 | 南京赋海澳赛医药科技有限公司 | 一种组合物及其在抗缺氧药物中的应用 |
CN105343063A (zh) * | 2015-11-10 | 2016-02-24 | 南京赋海澳赛医药科技有限公司 | 一种组合物及其在抗缺氧药物中的应用 |
CN105998005A (zh) * | 2016-04-22 | 2016-10-12 | 南京赋海澳赛医药科技有限公司 | Salviskinone A的苯并咪唑基和二(2-甲硫基乙基)胺基衍生物的组合物在抗缺氧药物中的应用 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1380295A (zh) * | 2002-02-27 | 2002-11-20 | 北京天纯维通生物技术有限公司 | 高纯度紫丹参甲素的制备方法 |
CN102827117A (zh) * | 2012-09-29 | 2012-12-19 | 南京泽朗医药科技有限公司 | 一种紫丹参甲素的制备方法 |
CN102936275A (zh) * | 2012-11-13 | 2013-02-20 | 中国人民解放军第二军医大学 | 一种丹参酮iia磺酸钠原料药中杂质的分离纯化方法 |
-
2014
- 2014-03-14 CN CN201410093550.2A patent/CN103864884B/zh active Active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1380295A (zh) * | 2002-02-27 | 2002-11-20 | 北京天纯维通生物技术有限公司 | 高纯度紫丹参甲素的制备方法 |
CN102827117A (zh) * | 2012-09-29 | 2012-12-19 | 南京泽朗医药科技有限公司 | 一种紫丹参甲素的制备方法 |
CN102936275A (zh) * | 2012-11-13 | 2013-02-20 | 中国人民解放军第二军医大学 | 一种丹参酮iia磺酸钠原料药中杂质的分离纯化方法 |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105343063A (zh) * | 2015-11-10 | 2016-02-24 | 南京赋海澳赛医药科技有限公司 | 一种组合物及其在抗缺氧药物中的应用 |
CN105287462A (zh) * | 2015-12-03 | 2016-02-03 | 南京赋海澳赛医药科技有限公司 | 一种组合物及其在抗缺氧药物中的应用 |
CN105998005A (zh) * | 2016-04-22 | 2016-10-12 | 南京赋海澳赛医药科技有限公司 | Salviskinone A的苯并咪唑基和二(2-甲硫基乙基)胺基衍生物的组合物在抗缺氧药物中的应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN103864884B (zh) | 2015-10-07 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN108083989B (zh) | 一种高纯度大麻二酚的制备方法 | |
CN1813900B (zh) | 南五味子木脂素的提取物及其制备方法和用途 | |
CN105294623B (zh) | 一种倍半萜内酯类化合物、其制备方法以及应用 | |
CN103054907A (zh) | 一种蜂胶总黄酮提取物及其制备方法 | |
CN103864884B (zh) | 紫丹参甲素磺酸钠的制备方法 | |
CN107118219B (zh) | 从钩吻中分离提纯钩吻绿碱、钩吻碱戊、钩吻素子、钩吻素甲和呋喃钩吻素子的方法 | |
CN109879919B (zh) | 一种从酸枣仁中分离制备三种黄酮苷的方法 | |
CN102526150A (zh) | 一种土木香总倍半萜内酯提取物的制备方法 | |
CN106349304A (zh) | 高纯度荨麻新苷及荨麻木脂素的制备方法 | |
WO2012061984A1 (zh) | 制备芍药内酯苷和芍药苷的方法 | |
CN103822987B (zh) | 紫丹参甲素磺酸钠的应用 | |
CN106916162B (zh) | 一种岩大戟内酯b原料药的制备方法 | |
CN101880269A (zh) | 二萜单体及从大青中分离制备二萜单体的方法 | |
CN101721434B (zh) | 一种阿里红有效组分及其制备方法和用途 | |
CN103804465A (zh) | 紫丹参甲素磺酸钠及其药物制剂的应用 | |
CN103819533B (zh) | 丹参酸甲酯磺酸钠的制备方法和应用 | |
CN107722080A (zh) | 一种从岩白菜叶中提取熊果苷的方法 | |
CN103191143A (zh) | 一种强心苷化合物的新用途 | |
CN109206392B (zh) | 一种香豆素类化合物及其制备方法与应用 | |
CN103156893B (zh) | 紫金砂及其提取物的新用途 | |
CN112724192A (zh) | 一种采用娑罗子提取制备七叶皂苷钠的方法 | |
CN105801541A (zh) | 一种阿莫西林的药物组合物及其医药用途 | |
CN103819532B (zh) | 丹参酮iib磺酸钠的制备方法和应用 | |
CN105250391A (zh) | 一种秃疮花生物碱有效部位的制备方法 | |
CN104230864A (zh) | 新的羟基红花黄色素a二价药用盐及其制备方法和用途 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
C56 | Change in the name or address of the patentee | ||
CP01 | Change in the name or title of a patent holder |
Address after: 200240 Shanghai city Minhang District Jianchuan Road No. 1317 Patentee after: Add medicine to the first biochemical pharmaceutcal corporation, Ltd in Shanghai Address before: 200240 Shanghai city Minhang District Jianchuan Road No. 1317 Patentee before: Shanghai No.1 Biochemical & Pharmaceutical Co., Ltd. |