CN103860861A - 一种百合黄酮类化合物的提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种百合黄酮类化合物的提取方法，选取百合花内外层花瓣混合，经液氮速冻研磨成百合花瓣粉；在百合花瓣粉中加入乙醇溶液放置于气浴恒温摇床浸提后得到提取液；将提取液采用高速离心机离心除去沉淀，得到上清液；将上清液在旋转蒸发仪上进行浓缩，脱除溶剂，置于真空冷冻干燥机中冷冻至干，得百合花瓣黄酮提取物。对百合花中黄酮类化合物的提取工艺进行研究，以期为进一步研究百合黄酮类化合物清除自由基的能力提供参考。本工艺简单可行，有较好的参考价值。

Description

一种百合黄酮类化合物的提取方法

技术领域

本发明属于植物化合物提取技术领域，涉及一种百合黄酮类化合物的提取方法。 

背景技术

黄酮类化合物是一类在植物中分布很广而且重要的多酚类天然产物，黄酮类化合物通常采用溶剂提取。因黄酮类化合物的结构与来源不同，溶解特性差异也很大。对于黄酮苷类以及极性稍大的苷元（如羟基黄酮、双黄酮、查儿酮等），一般可用水、甲醇、乙醇、丙酮或极性较大的混合溶剂如甲醇-水进行提取^[1]。有研究报道，黄酮类化合物能清除机体代谢过程中产生的多种自由基，如O₂ ^ˉ、·OH等，具有抗氧化、抗肿瘤、消炎及免疫调节、抗病毒等生物活性^[2-4]，因此，黄酮类化合物在当今科学界抗疲劳、抗衰老研究领域具有十分重要的应用价值和研究意义。目前国内外少有关于百合属植物中黄酮类化合物提取条件及其抗氧化性研究的报道[5]。 

发明内容

百合是百合科百合属植物所有种类的总称。百合是经济价值极高的药食兼用作物和著名花卉。1984年，我国卫生部首批颁布了药食兼用植物^[6]，百合就是其中之一。 

卷丹(Liliumlancifolium)的鳞茎近宽球形，鳞片宽卵形，花3-6朵或更多，花下垂反卷，橙红色，有紫黑色斑点，花期7-8月；卷丹在 全国各地均有分布；主要生长于海拔400m-2500m的山坡灌木林下、草地、路边或水旁；卷丹不仅花朵色艳，观赏价值高，而且地下鳞茎部位可药食两用，我国历版药典均有收载^[7,8]。宜昌百合（Lilium leucanthum）鳞茎近球形，花单生或2～4朵；花喇叭形，有微香，白色，里面淡黄色，背脊及近脊处淡绿黄色，主要分布于湖北和四川；生于海拔450m-1500m山沟、河边草丛中；宜昌百合花大美丽，适应性强，是观赏价值极高的切花和百合育种资源^[9]。‘西伯利亚’百合(Liliumorientalhybrids‘Siberia’)属东方百合杂种系，为百合中的名贵切花品种。茎秆坚挺，花白色，大而美丽，花被漏斗状，花瓣有疣状突起，香味浓郁，花期长，是近年来国内外市场热销的切花种类之一^[10]。‘白天使’百合(Liliumasiatichybrids‘Navona’)为亚洲百合品种，为王百合雄性不育突变体，花药褐化，不散粉^[11]；其茎秆坚挺，花大，白色，喇叭形，为近年常用的景观百合栽培品种。目前关于百合鳞茎和花瓣的营养成分研究报道较多，李明河^[12]等、吴汉斌^[13]等、李红娟^[14]、王珍华^[15]等对百合鳞茎的营养成分做了研究；金丽丽等 ^[16]、刘晓辉等^[17]分别指出百合花瓣中含有人体所需的多种营养成分及微量元素。但是关于百合花瓣的抗氧化活性物质黄酮类的最佳提取条件的研究却少有报道。 

本试验以野生百合种卷丹、宜昌百合及栽培百合品种‘西伯利亚’、‘白天使’的花瓣为材料，对百合花瓣中黄酮类化合物提取条件进行研究，旨在提高百合花瓣中黄酮类化合物的提取率，为百合花瓣黄酮类化合物的微波、超声波、酶法辅助提取提供基础，为百合花 瓣的食用、药物及抗氧化作用研究提供参考。 

本发明的目的在于提供一种百合花中黄酮类化合物提取方法，本发明所采用的技术方案是： 

步骤1，选取百合花内外层花瓣混合，经液氮速冻研磨成百合花瓣粉； 

步骤2，在百合花瓣粉中加入乙醇溶液放置于气浴恒温摇床浸提后得到提取液； 

步骤3：将提取液采用高速离心机离心除去沉淀，得到上清液； 

步骤4：将上清液在旋转蒸发仪上进行浓缩，脱除溶剂，置于真空冷冻干燥机中冷冻至干，得百合花瓣黄酮提取物。 

本发明的特点还在于步骤2中称取步骤1百合花瓣粉1-2g于带塞的三角瓶中，在三角瓶中加入60%-80%乙醇溶液形成百合花瓣粉乙醇溶液，其中所述百合花瓣粉质量（单位为克）与所述60%-80%的乙醇溶液体积（单位为毫升）的比值范围为1:10-1:25，将百合花瓣粉乙醇溶液用三角瓶密封，放置于气浴恒温摇床浸提1-3h得到提取液，气浴恒温摇床的浸提温度为50-60℃，摇床转速为100-150r·min^-1；步骤3中将提取液在20℃环境下采用高速离心机离心除去沉淀；离心机转速为4000-10000r·min^-1，离心时间为10-15min；取出上清液，残渣再重复提取2次，将3次得到的上清液合并；步骤4中将上清液在旋转蒸发仪上进行浓缩，脱除溶剂，其中旋转蒸发仪真空度为0.09Mpa，水浴温度控制在50-55℃之间，当脱溶瓶中剩余少量料液且能倾倒出来，停止脱溶，将脱除溶剂后的料液倒入表面皿中， 置于真空冷冻干燥机中冷冻至干，得百合黄酮类化合物。 

本发明的有益效果是：本发明可用不同花期的百合花瓣为原料，通过低温冷冻处理、粉碎、乙醇-加热-震荡联合提取、高速离心去沉淀、浓缩、脱溶、干燥工艺制备黄酮类化合物，有效提高了产品的得率和品质，从而使百合地上部分花瓣不仅可以观赏，也可以和地下部分鳞茎一样作为提取抗氧化活性物质黄酮类化合物提取的原料，由此加大了百合花的利用范围。 

附图说明

图1是芦丁标准曲线图； 

图2是提取剂对黄酮类化合物提取效果的影响图； 

图3是乙醇浓度对黄酮类化合物提取效果的影响图； 

图4是料液比对黄酮类化合物提取效果的影响图； 

图5是提取时间对黄酮类化合物提取效果的影响图。 

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。 

本发明百合黄酮类化合物的提取方法步骤如下： 

步骤1：低温冷冻处理和研磨：选取百合花内外层花瓣混合，经液氮速冻研磨成百合花瓣粉，可贮存于-80℃超低温冰箱备用。 

步骤2：乙醇-加热-震荡联合提取：准确称取上一步液氮研磨成的百合花瓣粉1-2g于带塞的三角瓶中，在三角瓶中加入适量体积的60%-80%乙醇溶液形成百合花瓣粉乙醇溶液，乙醇溶液优选70%，百合花瓣粉质量（单位为克,g）与60%-80%的乙醇溶液体积（单位为 毫升，mL）的比值范围为1:10-1:25，优选1:10。将百合花瓣粉乙醇溶液用三角瓶密封，放置于气浴恒温摇床浸提1-3h得到提取液，浸提时间优选1h，气浴恒温摇床的浸提温度为50-60℃，摇床转速为100-150r·min^-1，得到提取液后取出，放冷。为了进行下面的测量步骤，可以用浸提剂60%-80%的乙醇溶液补足至定容体积（实际体积记为V1，单位mL）。 

步骤3：高速离心去沉淀：将提取液在20℃环境下采用高速离心机离心除去沉淀；离心机转速为4000-10000r·min^-1，离心时间为10-15min；取得上清液，残渣再重复提取2次，合并3次的上清液，上清液可用于测量样品黄酮类物质含量。 

步骤4：提取黄酮类物质浓缩、脱溶、干燥：将上清液在旋转蒸发仪上进行浓缩，脱除溶剂，其中旋转蒸发仪真空度为0.09Mpa，水浴温度控制在50-55℃之间，当脱溶瓶中剩余少量料液且能倾倒出来，停止脱溶，将脱除溶剂后的料液倒入表面皿中，置于真空冷冻干燥机中冷冻至干，得百合黄酮类化合物。 

本发明可按照以下方法测定百合黄酮类化合物含量： 

1）首先制定芦丁标准曲线：精密称取105℃干燥至恒重的芦丁标准品200-210mg，用30%乙醇溶液溶解并定容100mL，得到0.20-0.21mg/mL的芦丁标准品溶液。精密吸取0.20-0.21mg/mL芦丁标准品溶液0、0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL、3.0mL分别置于具塞10mL试管里，加入30%乙醇补足至5mL，混匀，各加入0.3mlNaNO₂(5%，W/V)，混匀后静置5min，加入0.3mlAl(NO₃)₃（10%， W/V），混匀后静置6min，加入4mlNaOH（4%，W/V），再加入0.4ml30%乙醇使总体积为10mL（实际体积记为V，单位mL），混匀后静置10min。以30%乙醇溶液作为空白，用分光光度计在入射光波长510nm下依次测定吸光度A，以芦丁溶液浓度C（mg/mL）为横坐标，吸光度A为纵坐标，制作芦丁标准曲线。在波长510nm下，每个标准品溶液重复测量多次吸光度，取所述标准品溶液测量多次吸光度的平均值为该标准品溶液的吸光度A。用最小二乘法作线性回归方程，要求相关系数r≥0.9990，保证芦丁标准品在一定浓度范围与吸光度呈良好的线性关系。根据此种方法制得如图1所示的芦丁标准曲线。 

2）样品黄酮类化合物的测定方法：精确量取0.1-0.5mL（实际体积记为V2，单位为mL）上清液,放置于与步骤3液体总体积V相同(10mL)具塞的Eppendorf管中；按照上1）中的芦丁标准曲线制定方法，以30%乙醇溶液作为空白，测定稀释后的样品上清液在入射光波长510nm下的吸光度。在所述波长下每个样品上清液重复测量3-5次吸光度，取所述样品上清液测量3-5次吸光度的平均值记为该样品上清液的在入射光波长510nm下的吸光度A，再根据所述样品上清液测定的吸光度A，代入步骤1）芦丁标准曲线得到的线性回归方程，计算该样品上清液黄酮类化合物的浓度C，再代入下列公式，计算样品中黄酮类化合物的含量。黄酮含量(mg/g﹒FW)=C×稀释倍数×V/m。式中：C为稀释后样品上清液根据测定的吸光度A，在回归方程中计算出的黄酮浓度(mg/mL)；稀释倍数为样品上清液测定吸光度时的稀释倍数，即稀释倍数=V1/V2；V为样品上清液体积用于 测定波长510nm下吸光度时液体的总体积（mL），即V=10mL；m为最初用于提取黄酮类化合物的百合花瓣样品质量(g)。 

百合黄酮提取的单因素试验： 

以‘西伯利亚’百合花瓣为试材，研究不同提取剂、提取剂浓度、料液比及提取时间对黄酮类化合物含量的影响。提取剂及提取剂浓度对黄酮类化合物含量的的影响实验： 

考察在提取温度为室温，提取时间为1h，料液比为1:15，研究甲醇、乙醇、丙酮和水作为提取剂对抗氧化性物质含量的影响。在筛选到最佳提取剂的基础上，研究该试剂不同浓度下（40%、50%、60%、70%、80%）对黄酮含量的影响，选取适合的浓度。 

料液比对黄酮类化合物含量的影响： 

以百合黄酮提取的单因素试验中适合的浓度溶剂为提取剂，提取时间为1h,料液比1:5、1:10、1:15、1:20、1:25对黄酮含量的的影响。 

提取时间对黄酮类化合物含量的影响： 

以百合黄酮提取的单因素试验中适合的溶剂为提取剂，以料液比对黄酮类化合物含量的影响中适合的料液比，提取时间0.5、1、1.5、2、2.5、3h对黄酮含量的影响。找出最佳的提取时间。 

百合花瓣黄酮提取工艺参数的优化： 

为了确定百合花瓣中黄酮类化合物的最佳提取工艺，以‘西伯利亚’百合花瓣为试材，在单因素试验的基础上，从提取时间、料液比和乙醇浓度这三个因素中挑选出单因素试验结果中提取效果比较好的3个水平 进行试验，按正交试验设计筛选最佳提取条件，如表1所示抗氧化性物质提取条件的正交试验因素和水平。 

表1抗氧化性物质提取条件的正交试验因素和水平 

统计分析：借助Excel和DPS软件对实验数据进行整理统计。 

以上实验结果与分析：百合花瓣总黄酮提取的单因素试验结果。提取剂对提取效果的影响： 

如图2所示，不同提取试剂对百合花瓣黄酮类化合物的提取有着较大的影响。以水作为提取剂黄酮提取效果最差，显著低于甲醇、丙酮和乙醇。甲醇和丙酮提取效果差异不显著，而乙醇的提取效果最好，达到极显著水平。丙酮和甲醇均为有毒物质，乙醇无毒、安全环保。因此，从提取效果和安全角度来说，乙醇都是百合黄酮类化合物提取的最佳试剂。图2中，图中小写字母表示在P<0.05显著性水平上的差异，大写字母表示在P<0.01显著性水平上的差异，相同字母表示两者之间差异不显著；下同。 

浸提剂浓度对黄酮类化合物提取效果的影响： 

以乙醇为提取剂，不同浓度对百合花瓣黄酮类化合物的提取效果差异显著，如图3所示乙醇浓度对黄酮类化合物提取效果的影响。随着乙醇浓度增高，提取的黄酮含量也增加，在乙醇浓度为70%时达到最大值，但乙醇浓度超过70%时，提取的黄酮含量下降，表明百合花 瓣黄酮提取以60%～70%乙醇为佳。 

料液比对黄酮类化合物提取效果的影响： 

如图4所示，料液比对黄酮类化合物的提取效果也有着较大的影响。在料液比为1:5和1:15时，提取黄酮效果均较差；当料液比为1:10、1:20和1:25时，黄酮提取含量高，差异达显著水平。同时考虑提取效果和成本，百合花瓣提取黄酮时料液比可选取1:10和1:20。 

提取时间对黄酮类化合物提取效果的影响： 

提取时间在0.5h～3h期间，随着时间的增加，黄酮类化合物提取效果越来越好，提取时间在3h时达到最大值，呈极显著水平，因此百合花瓣黄酮提取以3h为佳。提取时间为1h、2h和2.5h时，黄酮的提取效果差异不显著，且提取效果仅次于3h，可为正交试验设计中筛选水平提供参考，如图5所示。 

百合花瓣黄酮类化合物提取工艺的优化： 

以上为单条件提取的最优参数，但组合起来并不是将最佳单条件放在一起即可，进行下面组合实验，以百合花瓣为材料的正交试验设计结果见表2，在70%乙醇作提取剂、按照料液比1:10提取1h的条件下，百合花瓣黄酮类化合物的提取效果最好，此时的黄酮含量为7.913mg/100gFW。极差分析和方差分析均表明，提取时间、料液比和乙醇浓度这3个因素对百合花瓣中黄酮类化合物提取效果的影响均达极显著水平，其中料液比的影响效果最大，其次是乙醇浓度，而提取时间的影响效果相对较小。多重比较的结果显示，提取时间以1h、料液比以1:10、乙醇浓度以70%为各因素的最优水平，这与试验结果一 致，为百合花瓣黄酮类化合物提取的优化条件。 

表2百合花瓣黄酮提取条件优化 

备注：**表示P<0.01显著性水平上的差异。 

对百合花中黄酮类化合物的提取工艺进行研究，以期为进一步研究百合黄酮类化合物清除自由基的能力提供参考。方法：以切花栽培 品种‘西伯利亚’的花瓣为试材，在单因素的试验基础上，通过正交试验筛选出最佳提取工艺。结果：百合花瓣中黄酮类化合物的最佳提取条件为：乙醇提取浓度70%，料液比1:10，提取时间1小时；在最佳提取条件下的含量是7.913mg/100gFW。结论：本工艺简单可行，有较好的参考价值。 

生物体在新陈代谢过程中不可避免的产生具有强氧化性，对机体有毒害作用的自由基。已有研究报道，肿瘤、癌症、心脑血管疾病、呼吸系统病变、衰老等疾病都与细胞内自由基的产生和积累有密切关系^[18]。大量研究表明，天然植物中提取出来的黄酮类化合物能有效清除多种自由基^[19-22]。本试验首次对百合的花瓣中黄酮类化合物的提取工艺进行研究，以期为进一步研究百合黄酮类化合物清除自由基的能力提供参考。 

本课题以百合花瓣为材料进行单因素试验，建立了以乙醇溶液为萃取剂的提取方法，为正交试验设计筛选出了百合花瓣各因素最佳的3水平，通过分析获得百合花瓣黄酮提取的最佳条件，即以70%乙醇作提取剂、按照料液比1:10提取1h，此时的提取的黄酮含量最高（7.913mg/100gFW），与周小琦^[23]等、徐美奕^[24]等所测定的玫瑰花和紫荆花相比，黄酮含量高于玫瑰花和紫荆花，因此，百合花瓣更适宜黄酮类化合物的提取，且百合花瓣的抗氧化性活性能力具有进一步开发的潜力。 

本试验采用鲜重测定，与许丽璇^[25]的干重测定方法相比较黄酮的提取量差异不大，且鲜重测定提取时间更短，操作更简单、方便。就 试验材料而言，目前查阅的文献和书籍来说，还未找到关于百合花瓣黄酮提取条件优化的报道，因此，有继续研究的必要。 

下面列举具体实施例对本发明进行说明： 

实施例1：方法：以切花栽培品种‘西伯利亚’的花蕾显色期(外轮花瓣2/3显色)、初开期(外轮花瓣展开)、盛开期(全部花瓣展开1-2d)3个阶段新鲜内外轮混合花瓣2g为试材，在单因素（不同提取剂、提取剂浓度、料液比及提取时间对黄酮类化合物含量的影响）的试验基础上，通过正交试验筛选出花瓣黄酮类化合物最佳提取工艺。结果：‘西伯利亚’百合混合花瓣中黄酮类化合物的最佳提取条件为乙醇提取浓度70%，料液比1:10，提取时间1h；在最佳提取条件下‘西伯利亚’混合花瓣黄酮类化合物的含量是7.91mg/100g·FW。结论：本工艺简单可行，有较好的参考价值。 

实施例2：方法：分别采取切花百合栽培品种‘西伯利亚’百合花蕾显色期(外轮花瓣2/3显色)、初开期(外轮花瓣展开)、盛开期(全部花瓣展开1-2d)3个阶段新鲜的内外轮花被上部、中部、基部混合样各1g，用15ml（料液比1:15）80%乙醇溶液于50℃恒温、转速100r·min^-1摇床里浸提1h。浸提后用离心机按照4000r·min^-1离心15min，取得上清液。采用硝酸铝-亚硝酸比色法，以芦丁为标样测定黄酮类化合物，测定‘西伯利亚’百合花蕾显色期、初开期和盛开期花瓣黄酮类化合物含量分别为37.88mg/100g·FW、35.68mg/100g·FW和33.87mg/100g·FW。 

实施例3：分别采取景观百合栽培品种‘白天使’百合花蕾显色期(外轮花瓣2/3显色)、初开期(外轮花瓣展开)、盛开期(全部花瓣展开1-2d)、谢花期(柱头变色1-2d)4个阶段的液氮冷冻混合花瓣各1g作为样品，用10mL（料液比1:10）70%乙醇研磨，研磨后放入三角瓶中于恒温摇床(55℃,150r·min^-1)浸提2h，浸提后用离心机按照转速10000r·min^-1离心10min，取得上清液。采用硝酸铝-亚硝酸比色法，以芦丁为标样测定黄酮类化合物，测定景观百合‘白天使’花蕾显色期、初开期、盛开期和谢花期花瓣黄酮类化合物含量分别为369.54mg/100g·FW、326.85mg/100g·FW、383.77mg/100g·FW、409.32mg/100g·FW。 

实施例4：分别采取野生百合种卷丹花蕾显色期(外轮花瓣2/3显色)、初开期(外轮花瓣展开)、盛开期(全部花瓣展开1-2d)3个阶段新鲜各个发育阶段的内外轮花被上部、中部、基部混合样各1g，用15ml（料液比1:15）80%乙醇溶液于50℃恒温转速100r·min^-1摇床里浸提1h。浸提后用离心机按照4000r·min^-1离心15min，取得上清液。采用硝酸铝-亚硝酸比色法，以芦丁为标样测定黄酮类化合物，测定卷丹花蕾显色期、初开期和盛开期花瓣黄酮类化合物含量分别为16.90mg/100g·FW、15.86mg/100g·FW、19.51mg/100g·FW。 

实施例5：分别采取野生百合种宜昌百合花蕾显色期(外轮花瓣2/3显色)、初开期(外轮花瓣展开)、盛开期(全部花瓣展开1-2d)、谢花期(柱头变色1-2d)4个阶段的液氮冷冻混合花瓣各1g作为样品，用10mL（料液比1:10）70%乙醇研磨，研磨后放入三角瓶中于恒温 摇床(55℃,150r·min^-1)浸提2h，浸提后用离心机按照转速10000r·min^-1离心10min，取得上清液。采用硝酸铝-亚硝酸比色法，以芦丁为标样测定黄酮类化合物，测定野生百合种宜昌百合花蕾显色期、初开期、盛开期和谢花期花瓣黄酮类化合物含量分别为134.42mg/100g·FW、109.15mg/100g·FW、78.70mg/100g·FW、99.38mg/100g·FW。 

参考文献： 

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Claims (5)

1.一种百合黄酮类化合物的提取方法，其特征在于按照以下步骤进行：

步骤1，选取百合花内外层花瓣混合，经液氮速冻研磨成百合花瓣粉；

步骤2，在百合花瓣粉中加入乙醇溶液放置于气浴恒温摇床浸提后得到提取液；

步骤3,将提取液采用高速离心机离心除去沉淀，得到上清液；

步骤4，将上清液在旋转蒸发仪上进行浓缩，脱除溶剂，置于真空冷冻干燥机中冷冻至干，得百合花瓣黄酮提取物。

2.按照权利要求1所述一种百合黄酮类化合物的提取方法，其特征在于：所述步骤2中称取上百合花瓣粉1-2g于带塞的三角瓶中，在三角瓶中加入60%-80%乙醇溶液形成百合花瓣粉乙醇溶液，其中所述百合花瓣粉质量与所述60%-80%的乙醇溶液体积的比值范围为1:10-1:25，将百合花瓣粉乙醇溶液用三角瓶密封，放置于气浴恒温摇床浸提1-3h得到提取液，气浴恒温摇床的浸提温度为50-60℃，摇床转速为100-150r·min^-1。

3.按照权利要求1所述一种百合黄酮类化合物的提取方法，其特征在于：所述步骤3中将提取液在20℃环境下采用高速离心机离心除去沉淀；离心机转速为4000-10000r·min^-1，离心时间为10-15min；取出上清液，残渣再重复提取2次，将3次得到的上清液合并。

4.照权利要求1所述一种百合黄酮类化合物的提取方法，其特征在于：所述步骤4中将上清液在旋转蒸发仪上进行浓缩，脱除溶剂，其中旋转蒸发仪真空度为0.09Mpa，水浴温度控制在50-55℃之间，当脱溶瓶中剩余少量料液且能倾倒出来，停止脱溶，将脱除溶剂后的料液倒入表面皿中，置于真空冷冻干燥机中冷冻至干，得百合黄酮类化合物。

5.按照权利要求2所述一种百合黄酮类化合物的提取方法，其特征在于：所述百合花瓣粉质量与所述乙醇溶液体积的比值为1:10；所述气浴恒温摇床浸提时间为1h。

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