CN103857803A - 利用杂交和增强解离的高精度基因组学分析平台的方法及装置 - Google Patents

Abstract

根据本发明的方法及装置可应用于捕捉/浓缩、基因表达谱和靶向测序。本发明所提供的方法是通过控制表面化学来提高微阵列和/或其它形式的依靠核酸杂交和解链曲线分析的基因组学分析方法的准确度和严谨度。所述方法包括在微阵列玻片的表面或出于相似目的的其它形式（如微珠）的表面形成一带正电的表面或表面涂层，以在一定程度上增强解链曲线分析，使其可检测或区分核酸的结合配体之间序列的细微变化。还公开了一种改进的微阵列阅读器，以收集微阵列玻片上的解链曲线数据。解链曲线分析的准确度或分辨率足以区分完全匹配的双链DNA的解链和具有序列中最小可能的变化—一对碱基错配的双链DNA的解链。

Description

利用杂交和增强解离的高精度基因组学分析平台的方法及装置

相关申请的交叉引用

本申请要求美国临时申请的优先权，该美国临时申请的申请日为2011年4月12日，申请号为61/474,727，在此以引用的方式将其全部内容并入本申请中。

技术领域

本发明总体涉及微阵列技术，具体涉及提高微阵列基因表达谱和单核苷酸多态性（SNP）分析精度的方法和装置。

背景技术

微阵列技术作为一种占主导地位的基因组学方法，却在重复性和不准确性方面存在问题。在追求卓越的基因组学分析的过程中，自20世纪末期开发了大量的新一代测序（NGS）方法。这使得人类基因组测序的价格从每个基因组约300亿美元（2004年）降至2010年年初的约2万美元。基因组学肯定是生命科学中发展最快的领域之一，但是NGS的价格与其它基因技术相比，仍然存在较大差距。虽然在实际测序过程中，价格已有了显著下降，但是将NGS应用于基因表达谱和SNP分析时，与微阵列每次检测几百美元相比不具备竞争力。

此外，NGS技术开发用于全基因组测序和检测样本中存在的所有的DNA序列。对基因组的特定部分或基因的一个子集分析需要捕获浓缩测定。这包括标准的微阵列芯片、其杂交的特定序列，但允许其它不需要的序列被洗掉走。但是，使用这种方法，可以浓缩超过100倍，而只有30%至60%捕获的DNA可能来自于所需的基因组部分。其结果是，捕获浓缩测定不是很有效，且序列覆盖度的深度或冗余随每次实验而变化。

为提高微阵列基因表达谱的准确度，创造了实时阵列方法。使用这种技术的设想是简化单核苷酸多态性（SNP）分析并降低其成本。自20世纪60年代初以来，在单管反应也称为液相反应中，已经开始运用双链DNA(dsDNA)的解链曲线分析。这些实验在DNA游离于溶液中的单管或液相中完成。自解链分析发现以来，已经对液相反应做了大量研究。液相解链曲线的一个常见限制是无法实现对一个碱基对的检测分辨率。然而，解链曲线分析在微阵列或固相反应中的运用是一个相对较新且未被完全了解的过程。

目前，需要一种可以利用将靶DNA从与玻璃微阵列结合的探针上解链的检测、且能够以非常低的成本在个别探针点区别完全匹配和不匹配并估算每个种类的相对量的方法和装置。此外，如果能有一种在分析DNA序列数据时还可作为捕获浓缩的工具、具有灵敏度、不费时且是高效安全和有效的方法将会是很有利的。而且，这种方法和装置还可应用于保健、环境研究、制药工业和食品工业以及适用于许多其他的诊断、生物技术和科学目的。

发明概述

本发明涉及满足这些要求的利用杂交和化学增强解离的高精度基因组分析平台的方法和装置。本发明的方法和装置可应用于捕获/浓缩，基因表达谱和靶向测序。

本发明的实施例提供了一种提高微阵列和/或其它依靠核酸杂交和解链曲线分析的基因组分析方法的准确度和严谨度的方案。所述方法通过控制玻片的表面化学而提供，并开发了改进的微阵列阅读器。在优选的实施例中，包括了通过初始合成、制作或通过二次应用在微阵列玻片表面上或用于相似目的的其他类型（例如微珠）的表面上生产带正电的表面或表面涂层的方法，所述方法提高了解链曲线分析的程度，使得其可检测或区分核酸的结合配体间序列中的细微变化。作为示例性实施例，聚乙烯亚胺，环氧化物或很多其它带正电的化学物质或者甚至是在表面使用电流以产生正电荷，可用来增强DNA微阵列解链曲线分析或其它基于杂交的检测。

本发明涉及捕获/浓缩的方法，其检测测试样品中所关注的靶多核苷酸序列是否存在、测量所述序列的量或对其进行验证。所述方法包括在分析介质中混合下述物质形成反应混合物的步骤：(i)含有结合至固体颗粒上的第一探针的第一试剂，和(ii)可能含有靶核苷酸序列的测试样品的等分试样。所述第一探针包括与靶核苷酸序列的所选链段的两个独立链段中的第一链段互补的第一单链核酸片段。所述固体颗粒为带正电荷的固体颗粒。所述第一探针与靶多核苷酸序列的相互排斥部分互补；

然后对所述反应混合物施行变性条件，使得样品中的靶多核苷酸序列变成单链。随后将所述反应混合物在杂交条件下温育，以使第一探针和靶多核苷酸序列所选链段的第一链段杂交。在靶多核苷酸的存在下，基本上所有的第一探针都杂交到靶多核苷酸序列所选链段的第一链段上，形成结合的靶多核苷酸序列。将反应混合物置于解离条件下。

然后监控所述反应混合物。优选地，解离与提供了解离曲线分析的结合的靶多核苷酸存在下的变化相关。

所述带正电荷的固体颗粒增强了分析的热解特性，使其能够检测，量化或区分靶多核苷酸和第一探针间核酸杂交的细微序列差异。所述细微序列差异可小至一个碱基对。

所述靶多核苷酸可以是DNA或RNA的一个片段。所述第一探针可以是一个DNA或RNA片段。通常，所述第一探针可通过接头结合至固体颗粒上。优选地，所述固体颗粒可选自聚苯乙烯、微珠、玻璃、金属、炭、胶体金、膨润土、聚丙烯、塑料和二氧化硅。更优选地，所述固体颗粒为玻璃。甚至更优选地，所述固体颗粒为一载玻片，且为一微阵列玻片。所述微阵列玻片包括约10个至约420万个探针。

所述带正电荷的颗粒包括一带正电荷的化学品的表面涂层。优选地，所述带正电荷的化学品可选自聚乙烯亚胺、环氧化物、胺和任何带有正电荷的化学品。更优选地，所述带正电荷的化学品为聚乙烯亚胺，且其以约1%至约10%的量存在。

所述带正电荷的颗粒可包括通过利用电流穿过表面以形成正电荷而产生的带正电荷的化学品的表面涂层。

通常，所述靶多核苷酸序列可包括一标记物。所述标记物可以为选自2-（（碘代乙酰基）氨基）乙基）氨基亚萘基-1-磺酸）（1,5-IEDANS）、荧光素、氟硼荧、FTC、德克萨斯红、藻红素、罗丹明、羧基四甲基罗丹明、DAPI、indopyras染料、Cascade蓝、俄勒冈绿、曙红、赤藓红、吡啶恶唑，苯并恶二唑、氨基萘、芘、马来酰亚胺、香豆素、荧光黄、碘化丙啶、卟啉、CY3、CY5、CY9、镧系元素、穴状化学品、镧系元素螯合物的荧光染料。

优选地，将反应混合物暴露于解离条件下的步骤可在约0℃至约100℃下，并以约0.01℃至约5℃的温度递增下进行。

所述的形成，施行，温育，暴露和监控步骤，以一自动化的微阵列装置进行。

所述第一探针可包括一标记物。所述标记物可以为选自2-（（碘代乙酰基）氨基）乙基）氨基亚萘基-1-磺酸）（1,5-IEDANS），荧光素、氟硼荧、FTC、德克萨斯红、藻红素、罗丹明、羧基四甲基罗丹明、DAPI、indopyras染料、Cascade蓝、俄勒冈绿、曙红、赤藓红、吡啶恶唑、苯并恶二唑、氨基萘、芘、马来酰亚胺、香豆素、荧光黄、碘化丙啶、卟啉、CY3、CY5、CY9、镧系元素、穴状化学品和镧系元素螯合物的荧光染料。

所述反应混合物还可进一步包括一缓冲液。

本发明涉及用于基因组序列分析的微阵列装置，其包括一基本结构，后者包括：一实时微阵列阅读盒，其中所述阅读盒设置为能容纳微阵列玻片；一包括热控制单元和流体控制单元的热控制室，其中所述热控制单元测量解链曲线分析的温度数据；一测定标记的核酸样品存在与否及其浓度的光学系统，其为解链曲线分析提供浓度数据；以及一自动聚焦系统。优选地，热控制室中设置有一计算机化的Z-轴，以加速聚焦过程和自动增量调整焦点。优选地，所述解链曲线数据足以对微阵列的每一探针点以一个碱基对的敏感度区分靶DNA的不同序列的解链，使其能够扫描整个基因组测序。

总之，本发明的实时基因组阵列是可提高微阵列系统的准确度并填补NGS未覆盖空白的下一代微阵列技术。

附图简述

参考下面的描述、所附的权利要求以及附图，可更好地理解本发明的这些和其它特征、方面及优点，其中：

图1A为根据本发明的实施例的实时阵列阅读器的模型；

图1B为根据本发明的实施例的温度在45℃至65℃间的解链实验所得到的微阵列图像的示例性对比；

图1C为根据本发明的实施例的杂交有Cy3染料染色的人类cDNA的阵列的示范结果；

图2A为根据本发明的实施例的改进后的微阵列扫描仪的热控制室和加热块；

图2B为根据本发明的一个实施例的图2A中改进后的微阵列扫描仪的重新设计的阵列盒；

图2C为根据本发明的一个实施例的安装在图2A中的改进后的微阵列扫描仪中的微阵列；

图2D为根据本发明的一个实施例的三个定制软件程序的屏幕截图；

图3为根据本发明的Keck中心的微阵列芯片获得的初步结果的一个比较。各个图中显示了共10个探针点，所有数据均为未经修改的原始数据；

图4为根据本发明的结合25mer的小鼠GAPDH探针序列的靶完全匹配和1个碱基对错配的解链曲线对比；

图5为根据本发明的对Microarray公司的阵列进行标准和优化的表面化学获得的解链曲线种类的示例性对比；

图6为根据本发明的一个实施例，用5%聚乙烯亚胺处理玻片后获得的示例性结果；

图7为根据本发明的一个实施例，用10%聚乙烯亚胺处理玻片后获得的示例性结果；

图8为根据本发明的一个实施例，带正电荷的微阵列表面如何能够吸引位于所述带电表面正上方的带负电荷的核酸、从而增强核酸解链的示例图。

发明详述

本发明提供了一种通过控制玻片的表面化学来提高微阵列和/或其它依靠核酸杂交和解链曲线分析的基因组分析方法的准确度和严谨度的方法。所述方法包括在微阵列玻片的表面或用于类似目的的其它类型（如微珠）的表面产生一带正电荷的表面或表面涂层，以增强解链曲线分析的程度，使得其能够检测或区分核酸结合配体间的序列中的细微变化。本发明还提供了一种改进的微阵列阅读器，以收集含有1000个或更多探针点的微阵列玻片上的解链曲线数据。此外，解链曲线分析的准确度或分辨率足以区分完全匹配的双链DNA的解链和序列中具有最小可能的变化—一个碱基对的错配的双链DNA的解链。

在本发明的优选实施例中，本发明的方法和装置可应用于捕获/浓缩，基因表达谱和靶向测序。特别地，在本发明的一个实施例中，给出了一种捕获/浓缩测试样品中所关注的靶多核苷酸的方法。在本发明的另一实施例中，给出了一种检测测试样品中所关注的靶多核苷酸的存在的方法。在本发明的又一实施例中，给出了一种测量测试样品中所关注的靶多核苷酸的量的方法。在本发明的另一更优选实施例中，给出了一种验证测试样品中所关注的靶多核苷酸序列的方法。

在本发明的一个具体实施例中，获得的初步数据表明，在微阵列上创建的解链曲线分析显著提高了微阵列的精度。根据本发明，图1A示出了本发明的一示例性装置。关于图1A，为节省成本所采取的措施，本发明的第一实时微阵列阅读器为一改进的Axon4000a（Molecular Devises,Sunnyvale,CA）机器，其中，热控制和流控与现有的扫描功能相结合。最初的实验使用一印制在具有两个探测块或200个探针点、每个探测块具有100个探测点的阵列上的具有大的300μM的探针点和70mer人类基因探针序列的商业微阵列芯片—“Check芯片”（从Sunnyvale,CA的Arrayit公司市售得到）上。根据本发明，这些玻片通常具有胺涂层表面且所述探针通过UV交联连接。利用Cy3染料（Arrayit公司）染色的人类cDNA作为杂交的靶DNA。通常，解链实验可在约0℃至约100℃下进行。优选地，解链实验在约40℃至约70℃下，且优选温度以1℃递增及流体缓冲液以600μl的2.5倍SSC冲刷下进行。

本发明的实施例提供了一种增强微阵列和/或其它依靠核酸杂交和解链曲线分析的基因组分析方法的准确度和严谨度的解决方案。提供了通过控制如微阵列玻片的表面化学以及开发一种改进型的微阵列阅读器的方法。在一个有利的实施例中，公开了一通过初始合成、制造或二次应用以在微阵列玻片表面或用于类似目的的其它表面（如微珠）上产生带正电荷的表面或表面涂层，以增强解链曲线分析，使其达到能够检测或区分核酸的结合配体之间序列细微变化的程度的方法。作为示例性实施例，聚乙烯亚胺、环氧化物或很多其它带正电荷的化学品或甚至是利用电流穿过表面以产生正电荷，均可用于增强DNA微阵列解链曲线分析或其它基于杂交的分析。

本发明涉及对测试样品中所关注的靶多核苷酸序列进行捕获/浓缩、检测其是否存在、以及对其进行验证或测量其含量的方法。所述方法包括在分析介质中混合下述物质形成反应混合物的步骤：(i)含有结合至固体颗粒上的第一探针的第一试剂，和(ii)可能含有靶核苷酸序列的测试样品的等分试样。所述第一探针包括与靶核苷酸序列的所选链段的两个独立链段中的第一链段互补的第一单链核酸片段。所述固体颗粒为带正电荷的固体颗粒。所述第一探针与靶多核苷酸序列的相互排斥部分互补。

然后对所述反应混合物施行变性条件，使得样品中的靶多核苷酸序列变成单链。随后将所述反应混合物在杂交条件下温育，以使第一探针和靶多核苷酸序列所选链段的第一链段杂交。在靶多核苷酸的存在下，基本上所有的第一探针都杂交到靶多核苷酸序列所选链段的第一链段上，形成结合的靶多核苷酸序列。将反应混合物置于解离条件下。

基于双链DNA的双链结构利用核酸杂交作为分析工具。双链DNA中各自链的嘌呤和嘧啶碱基间的氢键可以可逆地破坏。来自于这种DNA的解链或变性的两条互补的DNA链将相互关联（也被称为再退火或杂交），重组该双链结构。根据具体情况，与含有同第二链核酸在合适条件下足以互补的碱基序列的第一单链核酸（DNA或RNA）进行接触，将会形成核酸杂交体。

然后监控所述反应混合物。优选地，解离与提供了解离曲线分析的结合的靶多核苷酸存在下的变化相关。所述带正电荷的固体颗粒增强了分析的热解特性，使其能够检测、量化或区分靶多核苷酸和第一探针间核酸杂交的细微序列差异。所述细微序列差异可小至一个碱基对。

优选地，所述靶多核苷酸可以是脱氧核糖核酸（DNA）序列或核糖核酸（RNA）序列的一个片段。所关注的靶多核苷酸序列可以是在样品中自然存在的任何多核苷酸序列。它可以是存在于或来源于细胞系统的材料。所述多核苷酸序列可以是所关注的任何基因或多核苷酸序列（DNA或RNA）。

在本发明的一个优选实施例中，所述第一探针可以是核酸片段，优选DNA或RNA片段。更优选地，所述第一探针包括与靶多核苷酸序列的所选片段的两个分离链的第一个互补的第一单链核酸片段。所述核酸片段可以通过本领域技术人员所知的任何方法（如体内或体外的合成生产方法或酶促生产方法）产生或获得。DNA或RNA探针优选由本领域技术人员所已知的基因机器合成的或利用DNA重组方法制备的单链核酸分子。

优选地，所述第一探针表现出在所关注的靶多核苷酸序列的一个或更多点的可检测的杂交。更优选地，所述核酸探针片段连接到可以是几乎任何长度的固体颗粒上，只要该片段足够长，以形成与靶多核苷酸序列所选片段的稳定的核酸杂交。所述第一探针核酸片段通常含有最少4个碱基序列，比氨基酸密码子多一个碱基。优选地，所述第一探针核酸片段的长度为约4至约20个核苷酸。核苷酸越多，特异性越高。

通常，所述第一探针可间隔接头结合至固体颗粒上。

优选地，所述固体颗粒可以是能够连接DNA或RNA的任何不溶颗粒。所述DNA或RNA可通过本领域普通技术人员所知的任何方法连接到固体颗粒上，包括但不限于化学键，包括共价键、离子键和静电引力。优选地，所述固体颗粒可选自聚苯乙烯、微珠、玻璃、金属、炭、胶体金、膨润土、聚丙烯、塑料和二氧化硅。更优选地，所述固体颗粒为玻璃。甚至更优选地，所述固体颗粒为载玻片，且为微阵列玻片。

在本发明的一个更优选实施例中，探针的任何数量都是可能的，可相应地调整。例如，对于简单的应用，（例如在微阵列玻片上）只需利用10个探针点，为用于高通量时，可以使用几百万的探针并可相应地调整。可以通过本领域技术人员已知的任何方法确定所需使用的探针的数量。优选地，所述微阵列玻片包括从约10个至约420万个探针。

根据本发明，所述探针含有与靶多核苷酸序列的所选片段的两个分离链的第一个互补的单链核酸片段。所述核酸片段可以是脱氧核糖核酸（DNA）序列或核糖核酸（RNA）序列的一个片段。优选地，所述核酸片段为单链。所述核酸片段可以通过本领域技术人员所知的任何方法（如体内或体外的合成生产方法或酶促生产方法）产生或获得。DNA和RNA探针为通常由所谓的基因机器合成的或利用DNA重组方法制备的单链核酸分子。

在本发明的另一优选实施例中，所述第一探针链不直接连接到固体颗粒，如微阵列表面上，但是优选通过使用接头连接，所述接头可使DNA从表面上升高。更优选地，所述接头主要使得DNA距离玻片的表面具有更大的距离，但还可以具有其它额外的化学性质，例如，如果所述接头带正电荷，其可获得只有一个带正电荷的表面的双重结果。

本文中所使用的术语“杂交条件”，是指能够使得连接到固体颗粒上的第一探针与靶多核苷酸序列上所选定的片段的第一链杂交的条件。根据本发明，通常杂交技术和解链曲线分析是本领域技术人员所知的，且其可以在本发明中使用。

固体颗粒的选择可受杂交率和探针与靶DNA结合的效果的影响。所述固体颗粒优选能提供足够灵敏度以便检测杂交可获得的靶多核苷酸序列的量。其它的考虑为探针的易合成性，设备的可获得性、实现自动和便捷的能力。

在本发明的另一优选实施例中，通过对固体颗粒的化学表面进行控制。更优选地，所述固体颗粒具有带正电荷的表面或表面涂层，以在一定程度上增强解链曲线分析，使得其能够检测或区分核酸的结合配体之间序列的细微变化，所述序列的细微变化可达到一个碱基对的检测和区分。

在本发明的另一优选实施例中，任何阳离子或其它带正电荷的化学品可用来涂覆在该固体颗粒的表面。更优选地，所述带正电荷的颗粒包括具有正电化学品的表面涂层。优选地，所述带正电荷的化学品可选自聚乙烯亚胺、环氧化物、胺及包括但不限于本领域技术人员所知的任何带有正电荷的化学品。更优选地，所述带正电荷的化学品为聚乙烯亚胺，且其约1%至约10%的量存在。

在本发明的再一优选实施例中，所述带正电荷的颗粒可包括一通过利用电流穿过表面以产生正电荷而生成的带正电荷的化学品的表面涂层，其可用来增强DNA微阵列解链曲线分析或其它基于杂交的分析。

通常，所述靶多核苷酸序列可包括标记物。所述标记物可以为本领域技术人员已知的任何标记物或标签物。所述标记物可包括染料、放射性标记物、金、银、珠、抗体或其它任何本领域技术人员所已知的标记多核苷酸序列的标记物。优选地，所述标记物可为选自2-（（碘代乙酰基）氨基）乙基）氨基亚萘基-1-磺酸）（1,5-IEDANS）、荧光素、氟硼荧、FTC、德克萨斯红、藻红素、罗丹明、羧基四甲基罗丹明、DAPI、indopyras染料、Cascade蓝、俄勒冈绿、曙红、赤藓红、吡啶恶唑、苯并恶二唑、氨基萘、芘、马来酰亚胺、香豆素、荧光黄、碘化丙啶、卟啉、CY3、CY5、CY9、镧系元素、穴状化学品和镧系元素螯合物的荧光染料。更优选地，所述CY3作为染料使用。

在本发明的更优选实施例中，所述将反应混合物暴露于解离条件下的步骤，是指将反应混合物暴露于本领域技术人员所知的任何解链温度或解链条件下。在这里，解离和解链在整个说明书中可交替使用。解离或解链条件可以但不限于本领域技术人员已知任何条件，包括热、化学、电流或其它类型的流体或声波。更优选地，解离是指解链条件。

在解离条件下，所述解链温度可利用探针序列和缓冲液的组成计算得到。所述解链温度通常是使得所有的靶从探针上释放下来的最低温度。如果所述的解链温度太低，则靶将不被释放。另一方面，使用过高的解链温度，除了消耗更多的时间和能量来完成实验外，对结果没有负面影响。

优选地，当确定实时解链（解离）反应发生的温度范围时，通常开始于或低于杂交温度，并结束于稍高于解链温度。

通常，所述将反应混合物暴露于解离条件下的步骤，可在约0℃至约100℃下进行。优选地，所述将反应混合物暴露于解离条件下的步骤，可在约40℃至约70℃下进行，且所述温度以约0.01℃至约5.0℃递增升高。优选地，所述温度可以约0.01℃至约5.0℃递增升高。

根据本发明的一个优选实施例，在将反应混合物暴露于解离条件下的步骤中，所述温度范围可取决于探针序列和探针长度，且可根据本领域技术人员的所知进行调整。通常，在将反应混合物暴露于解离条件下的步骤中，所述实验可在约0℃至约100℃的温度范围下进行。优选地，在将反应混合物暴露于解离条件下的步骤中，所述实验可在约40℃至约70℃的温度范围下进行。

通常，实验能够进行的温度范围由靶序列和探针的杂交温度和解链温度确定。在进行解链反应前，可以先进行杂交反应且完成于一特定的温度。通常，杂交温度可以是生产商所建议的温度，例如，对于微阵列，常见的杂交温度通常是45℃。优选地，温度范围可通过计算或估计靶多核苷酸序列最有可能结合至与其互补的第一探针上的温度来确定。所估计的温度可根据核酸序列和杂交过程中所使用的缓冲液类型发生变化。根据本领域技术人员的公知，GC含量越高，序列越长，杂交温度越高。利用低于所计算出的最优特异性杂交的杂交温度，将使得探针和靶之间发生更多的非特异性结合。所使用的杂交温度过高，将可能导致靶结合不到探针上。

在本发明的另一实施例中，在将反应混合物暴露于解离或解链条件下的步骤中，温度以约0.01℃至约5.0℃递增升高。优选地，温度以约0.01℃至约3.0℃递增升高。本领域技术人员可根据在解链曲线分析中所需要的分辨率来改变温度的递增量。例如，通常，为了后续实验的进行，以1℃的温度递增运作良好，然而，温度以低于1℃的增量升高可以增加为了分析所产生的图像的数据点，从而增加了解链曲线的分辨率，但是，会消耗更多的时间。因此，以高于1℃的增量升高温度将加速实验的进行，但是，会降低解链曲线的分辨率。如果解链曲线的分辨率过低，要确定靶和探针解链分离的确切温度（Tm）是不可能的。优选地，温度以1℃的增量升高。

所述的形成、施行、温育、暴露和监控步骤，优选以一自动化的微阵列装置进行。

所述第一探针可包括一标记物。所述标记物可以为本领域技术人员已知的任何标记物或标签物。所述标记物可包括染料、放射性标记物、金、银、珠、抗体或其它任何本领域技术人员所已知的标记多核苷酸序列的标记物。优选地，所述标记物可以为选自2-（（碘代乙酰基）氨基）乙基）氨基亚萘基-1-磺酸）（1,5-IEDANS）、荧光素、氟硼荧、FTC、德克萨斯红、藻红素、罗丹明、羧基四甲基罗丹明、DAPI、indopyras染料、Cascade蓝、俄勒冈绿、曙红、赤藓红、吡啶恶唑、苯并恶二唑、氨基萘、芘、马来酰亚胺、香豆素、荧光黄、碘化丙啶、卟啉、CY3、CY5、CY9、镧系元素、穴状化学品和镧系元素螯合物的荧光染料。

更优选地，使用CY3作为染料。所述荧光多核苷酸探针结合连续流动系统和仪器的自动或半自动的结果记录中特别有用。

优选地，所述反应混合物还可进一步包括缓冲液。可使用本领域技术人员所已知的任何缓冲液。更优选地，所述缓冲液是基于缓冲液的离子强度所做出的选择，其可对反应产生影响。

本发明涉及了用于基因组序列分析的微阵列装置，其包括一基本结构，后者包括：一实时微阵列阅读盒，其中所述阅读盒用于容纳微阵列玻片；一含有热控制单元和流体控制单元的热控制室，其中所述热控制单元测量解链曲线分析的温度数据；一测定标记的核酸样品存在与否及其浓度的光学系统，其为解链曲线分析提供浓度数据；以及一自动聚焦系统。优选地，热控制室中设置有一计算机化的Z-轴，以加速聚焦过程和自动增量调整焦点，优选地，所述解链曲线数据足以对微阵列的每一探针点以一个碱基对的敏感度区分靶DNA的不同序列的解链，使得其能够扫描整个基因组序列。优选所述光学系统提供荧光强度数据，而所述热控制单元通常提供反应混合物的温度数据。

在本发明的一个实施例中，图1B示出了在45℃至65℃解链实验中获得的微阵列图片的对比。如图1B所示，在65℃下，温度升高、缓冲液冲刷、以及扫描的重复循环，从玻片上解离了大多数结合的靶DNA，确认了靶DNA的释放。

根据本发明的一个优选实施例，在将反应混合物暴露于解离条件下的步骤中，所述温度范围可取决于探针序列和探针长度，且可根据本领域技术人员的所知进行调整。通常，在将反应混合物暴露于解离条件下的步骤中，所述实验可在约0℃至约100℃的温度范围下进行，优选约40℃至约70℃。

在本发明的另一实施例中，在将反应混合物暴露于解离条件下的步骤中，温度以约0.01℃至约5.0℃递增升高。优选地，温度以约0.01℃至约3.0℃递增升高。本领域技术人员可根据在解链曲线分析中所需要的分辨率变化温度的递增量。例如，通常，为了后续实验的进行，以1℃的温度递增运作良好，然而，温度以低于1℃的增量升高将增加分析所产生的更多的数据点，从而增加了解链曲线的分辨率，但是，会消耗更多的时间。因此，以高于1℃的增量升高温度将加速实验的进行，但是，会降低解链曲线的分辨率。如果解链曲线的分辨率过低，要确定靶和探针解链分离的确切温度（Tm）是不可能的。优选地，温度以1℃的增量升高。

在本发明的另一实施例中，图1C示出了以Cy3染料标记的人类cDNA阵列杂交结果。解链分析在40-64℃下以2℃的间隔读出进行。图A（钙粘蛋白1探针）示出的解链曲线显示出了在约63℃处的一处大解链点（箭头），表明了一个主要杂交产物的存在。但是，图B（β肌动蛋白探针）示出了至少两个在46℃和62℃的主要解链点（箭头）。这个结果表明多个杂交产物的存在。传统的微阵列分析不能够做出此种区分。从图中可推断出每种杂交产物的相对丰度。图1C显示了通过编译扫描每一探测点的各个温度获得的荧光强度数据绘制的实际解链曲线，获得了形式良好的曲线。明显地，这些曲线展现出了一锋利的倾斜或下降，其中DNA从阵列上解离，使得易于辨别解链温度（Tm），如图中箭头所示（图1C），以及能够检测连接到某个探针点上的一种类型以上的靶。β肌动蛋白探针点（图1C）的解链曲线显示出了两种不同的解链曲线，表明结合了至少两种不同类型的靶DNA。

通过记录此初步数据，本发明的目的包括在设备和软件方面改进实时阵列阅读器，以及展示了该机器收集含有1000个或更多探针点的微阵列玻片上解链曲线数据的能力。此外，解链曲线分析的准确度或分辨率足以区分完全匹配双链DNA和具有序列的最小可能的变换—一个碱基对错配的双链DNA间的解链。

上述和后续的说明书以及附图集中于本发明的一个或更多优选实施例，同时也描述了一些示例性可选特征和/或可选实施例。说明书和附图是出于对本发明的说明而非限制的目的。本领域技术人员能识别其变化、修改和替换。此种变化，修改和替换也属于本发明的范围。仅是为了方便，使用了简洁的章节标题。

实验

定制微阵列芯片的制造

根据本发明的一个具体实施例，实时阵列的杂交、洗涤和解链循环需要探针分子间坚固耐用的共价连接，以确保分析的重复性。具有环氧硅烷涂层的微阵列玻片Nexterion Slide E(Schott，Louisville，KY)被选为是连接探针最耐用的产品。探针DNA序列具有25个碱基对（bp）的长度，并含有6个氨基酸接头修饰的5’氨基末端。所有的探针序列由IDT(Coralville，IA)定制合成。玻片利用Nexterion Slide E流程在两种不同的工具下专业印刷。首批25张玻片由比较和功能基因组学（Urbana，IL）的W.M.Keck中心（W.M.Keck Center），以下简称“Keck中心”，利用本领域技术人员熟知的标准针印刷技术生产直径为150μm的探针点制造得到。然而，印刷后未反应的环氧基团不以乙醇胺进行化学失活，且玻片带有一活性表面。第二批100张定制芯片，由Microarray Inc.(Huntsville，AL)制造。这批玻片是以相同的方式印制，但是在印刷后，在装运前将未反应的环氧基团以乙醇胺进行化学失活。

探针序列和微阵列布局

由6-8个重复块每块约100个探针点沿玻片向下阵列制得微阵列。表1总结出了总体布局。每个块的第一行和最后一行包含了一组对照探针点。这些包括由浓度为5μM到20μM的Cy3染料加盖的阳性对照点、空白区、作为阴性对照的大肠杆菌基因，以及反义方向的目标基因序列—小鼠GAPDH。小鼠GAPDH探针点在1-10行间以正义方向重复。

表1定制阵列的探针点布局

靶DNA序列

表2示出了包含25mer合成聚寡核苷酸（IDT）和5’末端添加有Cy3或Cy5染料修饰的靶DNA。在靶DNA的第13位加入1个碱基对错配或SNP，导致G到A的突变。

表2探针序列表

寡核苷酸	方向和序列
		反义小鼠GAPDH基因反义完全匹配	5’-TGA CAA TCT TGA GTG AGT TGT CAT A-3'
反义小鼠GAPDH基因反义1个碱基对错配	5’-TGA CAA TCT TGA ATG AGT TGT CAT A-3'

微阵列芯片的杂交

杂交前先根据制造商的说明利用Nexterion E Pre-Hyb溶液（Schott，AG）对印刷好的微阵列进行预杂交清洗。简单地说，将微阵列玻片转移至干净的含有预加热至42℃溶液的科普林氏缸中处理约10分钟。然后将预杂交玻片以蒸馏水（dH₂O）清洗30秒，重复五次，直至溶液中无泡沫。然后将玻片在异丙醇中清洗2分钟并在杂交前在空气中快速干燥。

可选的是，还可进行相同的处理程序，但省略了异丙醇处理步骤，而将玻片在室温下以1ml溶液浓度为1%-10%间变化的聚乙烯亚胺（PEI；Mw70000，（Sigma-AldrichSt.Louis，MO））的2.5倍SSC缓冲溶液中温育20分钟。随后进行3次30秒的2.5倍的SSC缓冲溶液清洗。玻片无需干燥并立即开始杂交过程。

用76μl含甲酰胺（Array It

2，Arrayit公司）的杂交缓冲液、16μl的蒸馏水（dH₂O）、8μl浓度为250μM的靶DNA制得100μl杂交混合物。在样品上覆盖一盖玻片前先在每一玻片上加入33μl到50μl的杂交混合物。微阵列放置于杂交室（Arrayit公司）中，并于45℃下在不加湿的杂交箱中通过摇床轻度搅拌温育16-24小时。

杂交后处理

采用了低、中、高严谨度的Nexterion E Post Hyb清洗液（Schott，AG）。在科普林氏碟中充满预热至45℃的低严谨度缓冲液，玻片在其中浸渍5分钟，在浸渍开始30秒内可将盖玻片分离。接着，将玻片在一系列的含有2个连续的中严谨度介质、含有2个连续的高严谨度介质的室温缓冲液中各温育5分钟。然后，将玻片在含有蒸馏水（dH₂O）的碟中冲洗几次。

清洗后的玻片小心快速地放入（DNA探针点朝下）本发明定制的含有450μl2.5倍SSC的阵列盒（Real-Time Genomics，Honolulu，HI）中，以使得玻片不会干燥。阵列盒以水密和耐热胶带（Grace-Bio Labs，Bend，OR）密封，并利用一插入输入端口处的微量吸管使得阵列盒内充满2.5倍的SSC缓冲液，注意避免在阵列盒中留下任何空间或气泡。

实时解链分析和数据处理

根据本发明的改进的Axon4000微阵列扫描仪，重命名为RTG1000，以定制的软件进行操作，所述软件的操作界面上存在包括Axon阅读器的GenePix软件。在每个实验开始前，RTG1000的管道系统以2.5倍SSC缓冲液冲洗，热控室预热至44℃，扫描仪聚焦。实验的一般编程参数要求在40℃-70℃下，以1℃的温度增加值、1分钟的温度保持时间和600μl的2.5倍SSC缓冲液冲洗进行连续的温育和清洗。起始PMT设置在600-700间在532nm处开始扫描，扫描文件保存至计算机的硬盘中。随着实验的进行，在每次温度升高后，PMT自动增加3个单位，随后通过自动聚焦调整增量。这些循环持续至最后的温度达到实验温度范围。

实验中每提高1℃的温度改变，产生一个扫描文件。典型的实验产生超过20个扫描文件。根据制作商的说明，每一扫描文件利用GenePix软件进行分析。简单地说，对于温度在40℃的第一个扫描文件，文件以微阵列厂商的GAL文件和GenePix软件的对探针点圆的固定表面积进行分析。一旦对第一个扫描文件进行了分析，GenePix软件将形成一GPS文件。GPS文件中包含了用于对第一个扫描文件进行分析的软件参数。为了确保数据分析的一致性，从实验中获得的其它扫描文件均用相同的GPS文件进行分析。

温度每提高1℃产生的扫描文件中包括了GenePix中产生的电子表格格式的所有统计数据，称为GRP文件。每一GRP文件的列中包括的平均F532-B532（平均荧光532-背景532）被复制并转移至微软Excel试算表中。此过程可通过手工计算，但已写入了数据编程软件以自动化该任务。Excel软件程序生成了所有的图表。

Phalanx One Array全人基因组芯片处理

从夏威夷大学的Chad Walton博士处获得并以标准方法制备了由Cy3或Cy5标记的肝cDNA和心脏cDNA组成的人类cDNA样本。这些样本利用来自Phalanx（Palo Alto,CA）的Human One Arrays按照制造商的方案进行杂交和处理。

结果概要

RTG1000的改进

根据本发明的一个实施例，提供了一种改进的微阵列阅读器，RTG1000，包括重新设计的阵列盒端口（图2A）和阵列盒（图2B）。提升了装置的流动和加热特性，使得机器的使用和加载更加简便。图2C显示了一个加载的阵列盒，其位置适合阅读器物镜置于所述盒的下方。写入了3个新的软件程序用于操作机器和帮助分析数据（图2D）。此外，在热控制块中添加了计算机化的Z轴，以在实验过程中加快聚焦过程和允许聚焦的自动增量调整（图中未示出）。

W.M.Keck中心生产的用于比较和功能基因组学的定制微阵列芯片分析

除了对照探针点，伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校的Keck中心生产的微阵列芯片，完全由检测小鼠GAPDH基因序列结合的探针点组成。GAPDH是一种看家基因，由于其参与糖酵解，通常在小鼠细胞内高水平表达。在一个微阵列玻片上重复有8个块或约800个150μM探针点。重复块允许验证结果的一致性，大探针点使得扫描检测更容易。使用了过量的含有以Cy3染料标记的互补的25聚体的靶DNA来杂交阵列。

本发明的实时基因组阵列系统在以Keck中心的微阵列芯片开始实验后产生了意想不到的结果。图3示出了由这些芯片获得的两组非常不同类型的数据。第一组芯片分析产生了代表着从中到高60℃内几乎所有探针从芯片上解链下来的一个平缓向下斜坡的类似滑雪斜坡曲线或A型数据。这是未经处理或未经调整的原始数据。简单看一下曲线（即可发现其）不能显示明显的解链点，后者在陡峭的下降中（才能）显示。而42℃-68℃的范围内呈现的是一个浅显下降的曲线。因此，确定结合靶DNA的具体Tm值是不可能的。它似乎在超过20℃的范围内都可解链。需要注意的是，图中的所有10个探针点具有相同的解链曲线，显示了结果的一致性。此外，这些结果代表了芯片上的8个重复块所获得的数据。在相同的实验和相同的条件下的第二芯片分析产生了阶梯型或B型曲线。B型数据产生了一个非常陡峭下降的解链曲线。完全解链发生在差值小于2.5℃，Tm值大约为55℃。图中的10个探针点从不同的强度开始，表明不同浓度的靶结合，但所有的靶在完全相同的温度下解链，表明了结果的一致性。这数据表征了芯片上的8个重复块。

由于在相同的条件下产生了两种非常不同的曲线类型，利用从Keck中心获得的所有芯片进行重复实验。随着实验的进行，这两种非常不同的图表类型重复产生，A型数据产生是B型数据约5倍以上。由于Tm值更容易计算因此更优选B型或阶梯型数据。此外，由Keck中心的芯片得到的B型数据与商业制造的微阵列芯片（Arrayit公司，见图1）得到的数据相类似。由于机器、方法或试剂上发生的某种程序性的显著差异，还进行了进一步的实验。

因此，本发明实施了提高RTG1000聚焦调整的改进。聚焦通过3个固定螺丝控制使得固定仪器难以调整。需要注意的是，机器不聚焦将产生不可信的数据并且如果RTG1000焦点在实验中发生了移动，结果数据将发生扭曲。此外，在检查聚焦问题时发现在实验过程中，随着2.5倍的SSC缓冲液温度的提升，缓冲液的折射率也发生了变化，导致焦点失调。为了修正此问题，安装了包含在热控制块上增加了一个z-轴的动态调焦系统。此部分一经安装，根据阳性对照Cy3标记的探针点在整个实验过程中保持强度稳定来判断，焦点是稳定的（数据未显示）。

以剩余的Keck中心的芯片进行进一步的实验，所述芯片的靶DNA的类型从完全匹配变为一个碱基对错配或SNP。其它所有的实验参数相同。如图4所示，A型数据同样是获得的最常见的解链曲线，但是也观察到了一些B型数据。当使用1个碱基对错配的靶DNA时，测量的靶的解链温度比完全匹配的靶低约为48.5℃或8.5℃（图4中的图A）。相同的反应在液相下，利用商业软件预测的解链温度差值为4.4℃。因此，本发明的实时阵列看起来既使得解链曲线变得尖又提高了完全匹配和一个碱基对错配间的Tm值的差距，从而加强了SNPs的检测。

Microarray公司生产的定制微阵列芯片分析

为了确认结果，包括不能解释的A型数据，或验证Keck中心芯片的问题，以另一家厂商生产的芯片进行了实验。以从Microarray公司订购的一组类型完全相同的芯片进行了一系列的实验。实时微阵列的最佳结果显示了更尖、更易于阅读的解链曲线，具有提高了的与靶完全匹配和1对碱基错配间的分离程度，表明了良好的SNP检测。此外，图1C中示出的从实验中获得的数据表明：此技术能够区别结合至相同探针点的不同类型的靶。图1C显示了在不同的Tm值处观察到的β肌动蛋白图，表明至少结合了两种靶。使用来自于Microarray公司的芯片的实验，起始使用的是均以Cy3标记的与靶DNA完全匹配和一个碱基对错配的50:50的混合物，并同时进行杂交，此实验的目的是检测同时在同一探针点上的两种类型靶的解链。

图5B示出了初始实验使用Microarray公司的芯片产生的完全不同形状的解链曲线。此曲线是典型的在43℃具有一个短的高原和在44℃至64℃范围内具有一个向下斜坡的滑雪斜坡曲线。中值Tm近似在箭头所在的55℃处，但靶是由两个不同的序列组成，应该依次产生两个不同的Tm值。因此，未检测到完全匹配和一对碱基错配的单独Tm曲线，而是融合成一个大的曲线。几个不同的实验重复得到了这个结果，是在芯片上印制的6个块的有代表性的数据。Microarray公司的芯片的重复性是优秀的，但是没有观察到Keck中心芯片的解链曲线的陡峭下降。

重新评估了Keck中心芯片和Microarray公司芯片的所获得的所有数据。然后确定了在芯片集的阵列制作过程中的一个关键性区别。Microarray公司在印制完成后运送给最终用户前以乙醇胺对未反应的环氧基团进行了化学失活。Keck中心省略了失活步骤并运送具有活性表面的玻片以允许最终客户如果需要的话自行进行失活操作。Nexterion Slide E芯片（Schott，AG）的制造商建议使用乙醇胺进行失活。这可以避免除了氢键或表面环氧的背景物质以外与靶DNA发生不需要的反应，其中可能包括臭氧或空气中的碳氢化学品，后者会产生异常信号使结果失真。

此信息解释了从Keck中心和Microarray公司的玻片所得到的结果。Keck中心的玻片可能已经通过除氢键以外的键结合靶或具有与在夏威夷发达地区的热带空气中存在的丰富的臭氧和碳氢化学品反应的能力，其显然存在于当前的实验室空气中。A型曲线可能与芯片表面与空气中不必要的试剂发生反应导致背景和不可读的结果有关。此外，如果芯片的处理过程非常快并快速放置于液体缓冲液中使得房间内的空气不与表面发生反应，是有可能获得B型结果的。

然而，Keck中心和Microarray公司的芯片的表面化学是明显不同的。Keck中心芯片的活性表面包含暴露于表面的环氧化物。所述环氧化物通过亲核加成与修饰探针DNA的氨基端反应，其中，所述环氧化物具有亲电子的功能且所述探针分子作为亲核试剂。由于环氧化物是不反应的，所述表面涂有强的亲电试剂，所述亲电试剂通常具有正化学电荷。环氧化物与乙醇胺通过亲核加成反应进行失活改变了玻片的表面组成，从环氧化物转变成附带有羟基的碳氢化合物。

如图5所示，从Keck中心的芯片和Microarray公司的芯片（图5B）的获得的B型曲线（图3和图4）的不同解链曲线的比较表明，活性和失活芯片表面的不同化学特性导致了不同形状的解链曲线。这可能是带正电荷活性环氧化物表面以某种方式与结合靶DNA的氢键发生反应，并且在升高温度和流量的特定条件下，可能会导致双链DNA以一个更尖的曲线发生了解链。这增加了完全匹配和一个碱基对错配的Tm间的差异，并有助于在解链分析中确定结合单一探针的靶混合物。

进行了使用专利化学品处理改变生物传感器的表面电荷的测试。该专利化学品混合物包含了主要成分为带正电荷的高分子聚乙烯亚胺的现有化学物质。使用的2.5倍SSC缓冲液中的聚乙烯亚胺溶液的浓度范围为1%至10%，在杂交混合物加入前，以该聚乙烯亚胺溶液涂于Microarray公司玻片的失活表面。

以1%带正电荷的聚乙烯亚胺溶液处理Microarray公司的玻片改变了解链曲线的类型，并使得检测完全匹配和一对碱基错配靶的50:50结合的混合物（图5.A）成为可能。在这个实验中，其它所有的条件均与之前的微阵列相同，除了在玻片上涂有聚乙烯亚胺。如图5.A所示，此解链曲线具有两个陡峭的下降，这被推定为与一对碱基错配的解链曲线的Tm值约为59℃，完全匹配的解链曲线的Tm值约为67℃相关。完全匹配和一对碱基错配的Tm差值约为8℃。此外，每种类型的双链DNA的大概数量可以从每一产品解链的相对荧光量推断出来。如图5.A所示，一对碱基错配的估计数量为18.4%，完全匹配的估计数量为81.6%。

由于聚乙烯亚胺的百分之一溶液改变了曲线形状以允许检测到多种类型的靶，下一步研究以5%的溶液对玻片进行预处理。所有的条件与其它实验相同，其结果如图6所示。图6.A示出了10个不同探针点图且显示出了Tm值大约在箭头所指的64.5℃处的非常陡峭的降落曲线。所有的结果均是原始未经调整的数据。注意图中的一致性，不同强度的斜坡，但解链却发生在极其一致的Tm值。此形状酷似图2中所示出的从Keck中心获得B类型数据，且明显不同于未经聚乙烯亚胺处理的Microarray公司的玻片。因此，以聚乙烯亚胺处理似乎在DNA的结合/解链特性上有一些效果。

如图5所示，在接近解链或分离核酸附近，正电表面的存在可以导致解链特性的改变。通常，在传统的没有正电表面的液相解链或固相解链中，两个互补的核酸在一较宽的温度范围内而不是在一特定温度点解链分离（图5B）。如果解链核酸包含一完全匹配和一对碱基错配都存在的结合配体的杂合子混合物，每一类型的解链曲线将会重叠，使得不可能检测到两种类型，如图5B所示。解链开始时，含有一对碱基错配的结合部分开始解链分离。但是，在错配部分完成解链过程前，完全匹配部分已经开始解链，产生一平滑的滑雪解链曲线，掩盖了两种类型的结合配体的存在。

然而，有了带正电表面的存在，解链动力学会改变曲线的峰化程度。这似乎将在一定温度范围内发生的解链行为变为在一很短的温度转变内发生。最终的结果是，在解链混合物中能区分错配和完全匹配的存在（图5A）。错配类型的解链现在具有更短更尖的性质，且可在完全匹配开始解链前完成。通常情况下，这使得两种类型可进行检测及定量。

根据本领域技术人员的知识，带正电表面的存在改变解链行为的原因并未被大众所周知。然而，根据本发明的一个优选的实施例，带正电表面的存在给解链核酸添加了一额外的力。在大多数条件下，氢键使得双链核酸结合的更牢固。通常情况下，在分离过程中，氢键是必须要克服的力。在固相解链的情况下，带正电表面的存在成为一额外的力，其连同氢键一起在影响核酸解链分离和峰化解链曲线中发挥作用。一个可能的解释是，正电荷有助于微阵列某一特定点的核酸标记链比仅依靠氢键的核酸保持的更强烈。这种保持效果现在改变了所认为的解链行为，保持标记链在位置上更久，然后使得其在非常短的温度转变内解链分离，所述温度转变仍然是链序列特异性的。

图5.A中产生了易于识别的错配和完全匹配的Tm值的阶梯型曲线。然而，要区分图6中二者的Tm值是不容易的。图3中示出的B型数据只有一非常陡峭的解链曲线，从而证实了只存在与靶完全匹配的这一类型。但是，图6显示了两个斜坡，从左至右，斜坡以一浅凸形状开始，然后变成一几乎垂直的线下降。图6B基于曲线的斜率被间隔成几部分。如果浅坡代表了与靶一对碱基不匹配的解链分离，陡坡代表完全匹配的解链分离，则可基于图中每一斜坡相关的荧光量计算出每种产品的相对量。每种产品的估计值，Tm值为59.5℃的一对碱基错配的估计值为27.4%，Tm值为64.5℃的完全匹配的产品的估计为72.6%。为确认这些估计值进行了进一步的实验。还需注意的是，在实验过程中，大部分而不是全部的靶DNA从探针点解链分离下来。

在接下来的实验中，在杂交前，使用聚乙烯亚胺的10%的溶液对Microarray公司的玻片进行预处理。图7A示出了由一些探针点组成的图，并呈现出了阶梯型的曲线类型但比图3B的B型数据或图6平滑的多的斜坡。此图中的形状与多个探针点具有相似但不完全相同的形状相一致（图7A）。在图中的斜坡中可观察到在51℃和59℃的两个截然不同的Tm值，类似于图5A中的曲线形状。每类靶（图7B）的大致量，一对碱基错配的为20.3%，完全匹配的为79.2%。这些解链温度显著低于图5A中59℃和67℃，但Tm值间的差值同样都为8℃。这些结果进一步证实了聚乙烯亚胺影响了靶DNA的解链，有助于区分从相同的探针点上解链下来的多种类型的靶DNA。再次应当注意的是，随着温度的升高，大部分而不是全部的靶DNA从探针点解链分离下来。

Phalanx One Array全人类基因组芯片分析

通常情况下，全人类基因组芯片包含超过30,000探针点和60个碱基对长度的探针序列。由于探针点的数量众多，个别探针点的直径远小于80μM。一个芯片以Cy3标记的人类肝脏和Cy5标记的心脏cDNA的混合物进行处理。这是第一个有大量探针点和两种颜色的基因表达谱微阵列的实验。一个目的是RTG1000能够读出该芯片且解链曲线数据会降低测量中的噪声。例如，如果一个特定基因在两个不同样品比例为2:1进行表达，噪声可能将实测比例改为1:1。人们希望解链过程可在低的解链温度下移除非特异性结合DNA。这将提升在中温和高温下表达比率准确性。随着实验的进行，温度高至足以使所有的cDNA从芯片上解链下来，标志着实验结束。在所有的cDNA解链前获得最终基因表达比率，被认为是最准确的。不幸的是，由于各扫描信号太弱使得分析软件不能对图像文件进行分析，第一次尝试失败（数据未示出）。对图片文件进行肉眼检查，确认了芯片上的非常微弱的荧光信号。导致此失败的原因最有可能是在cDNA合成过程中染料结合差，但这需要更多的实验确认。

根据本发明的一个实施例，提供了一个工作设备，并演示了在一微阵列格式中利用热熔炼分析作为一种新型的低成本的基因组学分析工具的方法。此技术不仅提高了微阵列的准确性，并填补了NGS未涉及的空白。由W.M.Keck比较和功能基因组学研究中心制造的微阵列芯片产生了一些令人惊讶的解链曲线，但是以不相同的方式（图3和4）。为理解结果，开发了改进的微阵列阅读器RTG1000。根据本发明的一个实施例，所述改进的微阵列阅读器包括对机器及其操作系统的改进，包括增加了一可显著提高所采集数据的一致性和质量的自动聚焦系统。

本发明的一个最优选的实施例，是微阵列的芯片表面化学对实际解链分析的影响。如前面所讨论的，以Keck中心的芯片进行的实验获得了意想不到的结果，这被认为是受到了芯片的非标准活性环氧表面涂层的影响所致。本发明中优选，传统现有微阵列及用品并不适合于实时微阵列分析。这一点可由以乙醇胺失活的Microarray公司的芯片所产生的非常一致的解链曲线数据，但不能区分不同类型的结合靶得到确认（图5B）。

通常，DNA解链分析实验是在试管或液相中以游离在溶液中的DNA进行的。液相解链曲线的一个常见限制是无法实现一个碱基对的分辨率检测。此方法通常会产生如图5B所示的细长的微倾斜解链曲线。根据本发明，提高微阵列的准确性受到一种通过热和化学的综合效应产生的变性DNA的新型的且被忽视的属性的影响。固相解链反应的应用可通过创建一新的纳米环境，所述纳米环境的热和化学性能均会影响变性来改变解链曲线的动力学。在此情形下，控制解链反应的相关变量可分解为热、溶剂流、和表面化学的改变。由于靶DNA是结合到探针DNA的，所述探针DNA反过来又结合到玻璃阵列的固体表面，因此，阵列表面的化学组成会影响DNA的变性。

图8示出了微阵列的表面如何影响DNA的解链，其可能涉及碱基对间的氢键结合或解链靶DNA的定位的影响。存在带正电荷的亲电试剂（环氧）的Keck中心的芯片，导致了寻找一种在已使用的Microarray公司玻片上使用带正电荷的表面涂层的简便方法。优选地，根据本发明的一个实施例，选择聚乙烯亚胺来涂覆芯片。夏威夷大学的研究人员使用聚乙烯亚胺作为对结合细胞的生物传感器进行表面涂覆的阳离子试剂。此外，聚乙烯亚胺经常作为阳离子脂质应用于在哺乳动物细胞的转染过程中使用的脂质体的形成。已经确定的是，聚乙烯亚胺的阳离子性质导致了带负电荷的双链DNA凝结在脂质体内，以及引起了双螺旋的有限变性。

有了上述所讨论实验的结果支持，本发明提供了聚乙烯亚胺提高DNA微阵列解链曲线分析的新用途。由于聚乙烯亚胺是熔点约为75℃的固体，因此有合理理由相信停留在玻璃玻片表面的聚合物在温度低于75℃时与位于微阵列表面的双链DNA互相作用。这种相互作用的准确机制还未知，但是聚合物在脂质体中使用时与变性有关，表明微阵列上的条件以能够检测一个碱基对分辨率的方式促进了变性。这继而暗示了其对于碱基对间氢键强度的影响。需要注意的是，完全匹配DNA的Tm值随着聚乙烯亚胺浓度从1%增加至10%而降低，意味着碱基对间氢键的削弱（图5,6和7）。另一种可能是，带正电的表面影响了解链靶DNA的定位，导致其被排斥或吸引至表面，如图8所示。所述排斥效应可能会推动靶DNA远离表面并展现出一加速解链或一低的解链温度的现象。然而，DNA一般带有净负电荷并很有可能被吸引到带正电荷的聚乙烯亚胺上（图8）。以5%和10%聚乙烯亚胺溶液涂覆的微阵列实验显示了靶DNA的不完全解链（图6和7），说明靶可能通过其它非氢键机制结合在微阵列的表面。总而言之，所观察到的DNA解链特性的变化可能是复杂的并包含了一种以上的化学作用。

带正电表面/缓冲液离子强度的影响

如图8所示，固体表面的正电荷通常会直接吸引带负电荷的核酸至正电表面上。核酸的准确构想目前还尚未得到证实，但是可合理假设的是吸引力会导致带负电荷的核酸弯折至某一位置，使得其靠近带正电的表面，提供的核酸和吸附到表面的方法是灵活的（图8）。

核酸和带正电表面间的吸引力可通过缓冲液的组成来调整。含有高离子强度的缓冲液通常包含较多的带正电荷和负电荷的离子，会被吸引至带正电的表面和核酸上，从而减小了表面和核酸间所认为的吸引力。相似地，含有低离子强度的缓冲溶液通常包含较少的可被吸引至表面和核酸上的离子，因此对表面和核酸之间的吸引力的影响较小。可以利用这种效应通过改变缓冲溶液的离子强度来减小或加强吸引力来调整表面和核酸间的吸引力（图8）。

对微阵列的每一探针点能够以一个碱基对的敏感度来检测不同序列靶DNA的解链的能力代表了在同样的微阵列成本下，具有进行某一类型DNA序列确定或低分辨率测序能力的一个强大的基因组分析工具。当以此种形式使用，其功能不再仅是一个微阵列，因为其能够快速高效扫描整个基因组，以找到存在于样品间的一些很少但非常重要的遗传差异。然后，如果需要更详细的分析，当从微阵列芯片上解链时，可对杂交后选择的相同DNA样品上进行NGS。此应用对于以较之全基因组测序而言非常低的成本来快速筛查种群的遗传差异是理想的。例如，单核苷酸多态性在对已知的单核苷酸多态性(SNPs)开发了快速低成本的筛选测试之前总是首先通过测序DNA进行检测。因此，SNP检测仅限于已测序的种群。以实时阵列筛选将会将成本降至如此之低，以至于全部的种群均可进行筛选，且理论上可检测种群中的所有SNP。另一应用可能是跟踪传染病爆发或生物武器攻击的进度。在这种情况下，可对大量的被感染的患者进行筛选以获得致病因子的特性、耐药性、或只是获得爆发是如何进展的流行病学信息。NGS是一种以提供整体信息且从中可以收集具体信息的鸟枪法，但是其不足以便宜至整个种群的测序。相反，实时阵列可侧重于只产生所需要的相关基因组信息，节省了时间、精力和成本。

本发明提供了涉及产生增强的解链曲线的阵列表面化学的相关技术。进一步的研究包括对微阵列玻片的化学涂层的识别改进，其目的在于产生更耐用、更敏感和更一致的结果。此外，杂交/解链过程的严谨度需要加以记录。从每一微阵列上洗脱的靶DNA应通过NGS测序以确认结合探针DNA的到底是何物以及在给定的温度下解链的到底是何物。验证测试将促进发展具体的应用。

因此，本发明的方法可用来确定结合到单个探针点的不同类型的靶DNA的一个碱基对差异。这已在含有600-800个探针点的微阵列玻片上完成。初步尝试了在制作的含有超过30,000个探针点的商业微阵列芯片上进行此分析，但失败了，其原因可能与靶DNA的标记而不是实际的解链分析有关。在阵列的初始开发过程中，选择了阵列靶密度和组成的简单性，以避免结果解释的任何困难。因此，没有下单定制具有1000或更多探针点的微阵列玻片。然而，很可能的是，此技术可在最少含有1000个探针点的玻片上进行，假如所述探针点的直径足够大（＞150μM）的话。可预期的是，控制玻片表面化学的能力进一步发展将有助于此方法的其它应用，例如对结核病分离物的表征。

根据本发明，RTG技术在微阵列和新一代测序(NGS)间架起了桥梁，并可以微阵列的价格实现NGS系统的准确性。RTG技术与微阵列技术的竞争，但可与NGS共同作用或与之抗衡，这取决于其应用。优选地，RTG技术可用作捕获/浓缩平台，且比传统的微阵列捕获系统更特异有效地捕获靶DNA。更优选地，此技术在低解链温度下洗脱非特异性和外源DNA，并能同时保持稳定地结合所需靶DNA。对于NGS，这样可以提高浓缩的功效并通过去除不需要的DNA来降低NGS测序成本。此外，由于通过微阵列的解链曲线分析可获得实际测序数据，实时技术可通过相互关联同时捕获和重测序DNA，从而避免了NGS测序。

在整个说明书和附图中，给出了涉及具体配置的具体实施例。本领域技术人员应当理解的是，本发明还可以其它特定形式体现。本领域技术人员无需过度实验即可进行其它此类实施例。为了本专利文件本发明的范围并不仅限于前述的特定的实施例或其替代。

Claims (24)

1.一种捕捉/浓缩测试样品中所关注的靶多核苷酸序列、检测其是否存在、测定其数量或对其进行验证的方法，包括以下步骤：

a）在分析介质中混合下述物质形成反应混合物：

(i)含有结合至固体颗粒上的第一探针的第一试剂，所述第一探针包括与靶核苷酸序列的所选链段的两个独立链段中的第一个链段互补的第一单链核酸片段，其中，所述固体颗粒为带有正电荷的固体颗粒；以及

(ii)可能含有靶核苷酸序列的测试样品的等分试样，其中，所述第一探针与靶多核苷酸序列的相互排斥部分互补；

b)对所述反应混合物施行变性条件，使得样品中的靶多核苷酸序列变成单链；

c)将所述反应混合物在杂交条件下进行温育，以使第一探针和靶多核苷酸序列的所选链段的第一链之间发生杂交；

从而，在靶多核苷酸的存在下，几乎所有的第一探针都杂交到靶多核苷酸序列的所选链段的第一链上，形成结合的靶多核苷酸序列；

d)将所述反应混合物暴露于解离条件下；并且

e)监控所述反应混合物，其中解离与在结合的靶多核苷酸的存在下的变化相关，提供解离曲线分析；

从而，带正电荷的固体颗粒在一定程度上增强了用于分析的热解特性，使其可检测，量化或区分靶多核苷酸和第一探针的核酸杂交体的细微序列差异，其中，所述细微序列差异可小至一个碱基对。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述靶多核苷酸为DNA片段。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述靶多核苷酸为RNA片段。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述第一探针为DNA或RNA片段。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述第一探针通过接头结合至固体颗粒上。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述固体颗粒选自聚苯乙烯、微珠、玻璃、金属、炭、胶体金、膨润土、聚丙烯、塑料和二氧化硅。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述固体颗粒为玻璃。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述固体颗粒为载玻片。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述带正电荷的固体颗粒包括带正电荷化学品的表面涂层。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述带正电荷化学品选自聚乙烯亚胺、环氧化物、胺和其它任何带有正电荷的化学品。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于：所述带正电荷化学品为聚乙烯亚胺。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于：所述聚乙烯亚胺以约1%至约10%的量存在。

13.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述载玻片为微阵列载玻片。

14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于：所述微阵列载玻片含有约10个至约420万个探针。

15.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述靶多核苷酸序列包括一标记物。

16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于：所述标记物为选自2-（（碘代乙酰基）氨基）乙基）氨基亚萘基-1-磺酸）（1,5-IEDANS）、荧光素、氟硼荧、FTC、德克萨斯红、藻红素、罗丹明、羧基四甲基罗丹明、DAPI、indopyras染料、Cascade蓝、俄勒冈绿、曙红、赤藓红、吡啶恶唑、苯并恶二唑、氨基萘、芘、马来酰亚胺、香豆素、荧光黄、碘化丙啶、卟啉、CY3、CY5、CY9、镧系元素、穴状化学品和镧系元素螯合物的荧光染料。

17.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述将反应混合物暴露于解离条件下的步骤在温度为约0℃至约100℃下进行。

18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于：所述将反应混合物暴露于解离条件下的步骤中，温度以0.01℃至约5.0℃的增量升高。

19.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：形成、施行、温育、暴露和监控步骤，以一自动化的微阵列装置进行。

20.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述带正电荷的颗粒包括一利用电流穿过表面产生正电而产生的带正电荷的化学品的表面涂层。

21.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述第一探针包括一标记物。

22.根据权利要求21所述的方法，其特征在于：所述标记物为选自2-（（碘代乙酰基）氨基）乙基）氨基亚萘基-1-磺酸）（1,5-IEDANS）、荧光素、氟硼荧、FTC、德克萨斯红、藻红素、罗丹明、羧基四甲基罗丹明、DAPI、indopyras染料、Cascade蓝、俄勒冈绿、曙红、赤藓红、吡啶恶唑、苯并恶二唑、氨基萘、芘、马来酰亚胺、香豆素、荧光黄、碘化丙啶、卟啉、CY3、CY5、CY9、镧系元素、穴状化学品和镧系元素螯合物的荧光染料。

23.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述反应混合物还包括一缓冲液。

24.一种用于基因组序列分析的微阵列装置，包括：

一基本结构，该基本结构包括：

一实时微阵列阅读盒，其中，所述阅读盒用于容纳微阵列玻片；

一热控制室，该热控制室包括热控制单元和流体控制单元，其中，所述热控制单元测量反应混合物的温度数据并为解链曲线分析提供温度数据；

一光学系统，该光学系统测定标记的核酸样品的存在与否及其浓度，为解链曲线分析提供浓度数据；

由此解链曲线数据足以针对微阵列的每一探针点以一个碱基对的敏感度区分不同序列的靶DNA的解链，使得能够扫描整个基因组测序；以及

一自动聚焦系统，

其中，热控制室中添加有一计算机化的Z-轴，以加速聚焦过程并允许自动增量调整焦点。

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