CN103852878A - 一种具有实时聚焦的显微切片快速数字扫描装置及其方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有实时聚焦的显微切片快速数字扫描装置及其方法，该装置包含一个数字显微成像系统及一个与之匹配组合的实时对焦装置。该数字显微镜系统包括计算机、实现光电转换的图像探测装置、显微光学成像系统、自动载物台及对应的运动及控制系统、显微镜照明光学系统及照明光源等。实时对焦装置包括一个测量样品离焦量的装置和一个驱动样品或者物镜移动并使得样品与物镜的焦面的重合的装置。本发明能够在切片扫描过程中实时探测样本离开成像系统焦面的距离并实现实时对焦，从而获得优良图像。利用该实时对焦技术可以避免耗时的焦面建模过程；同时兼顾大的对焦范围与对焦精度；另外该方法不仅效率高，而且成本低。

Description

一种具有实时聚焦的显微切片快速数字扫描装置及其方法

技术领域

本发明属于显微镜技术领域，特别是涉及一种具有实时聚焦的显微切片快速数字扫描装置及其方法。

背景技术

在教学、远程病理诊断、基于软件的智能自动识别系统等应用中，都需要对显微镜下观察的组织样品全貌提供给多人阅读，或异地阅读，或不同时候在既无实际切片又无显微镜情况下阅读、诊断、或者永久保存。这些应用都需要将组织样品全区域或相当大部分区域进行数字化。为了这一需求，显微切片全片数字快速扫描系统又称虚拟显微成像系统就是最近二十多年发展起来的一项高度集成显微光学成像技术、数字成像技术、控制技术于一体的装置。

操作员在显微镜下实际观察组织样品时，一般是在低放大倍数下对组织样品进行快速扫描，寻找到感兴趣或可疑区域后，再换用高倍数物镜对样品局部放大观察。然而，在对组织样品全区域或相当大部分区域进行数字化扫描过程中，一般采用高放大倍数如20X，40X物镜观察，这样，一个相机的视场即一个瞬间能看到的样品区域就非常小。这样就需要使得相机与样品有上百个甚至上万个相对移动才能在高放大倍数下将大部分组织区域或者全部数字化扫描完毕。

区分不同显微切片全片数字扫描系统或者方法的关键指标有：扫描图像质量与扫描全片的速度。图像质量主要由显微光学系统决定，也与扫描过程中显微光学系统是否对焦有关系，而且受后者影响很大。在显微光学系统光学性能满足要求下，实际扫描所获得图像质量则主要由样品在扫描过程中是否始终保持良好对焦而定：即样品待测表面与光学成像系统的焦面重合好坏/离焦量大小而定，重合越好，图像质量越好；离焦量越大，图像质量越差。

为了减小待测样品离焦量，显微切片全片数字扫描系统需要在扫描过程中根据当前扫描位置的变化而进行实时调焦操作。这是因为样品表面高低不平会导致样品表面不同位置有几个微米的高度差；由于加工精度原因载物台运动到不同位置时也会导致其表面不同位置在经过物镜时有高度差，这个差额值一般在几个微米甚至几十个微米之间；在完成全片扫描的长达几分钟时间内，物镜本身有可能在Z轴上不能锁定位置造成滑动而离焦；再有，热膨胀造成的可以高达1个微米的热效应也会致使样品表面Z值变化。实时调焦操作需要知道样品当前扫描点的焦面位置信息。

根据确定样品当前扫描点的焦面位置所使用的方法的不同，显微切片全片数字扫描系统大体上可以分为两类：一类是焦面建模法。使用焦面建模法的虚拟扫描系统，首先上片：将切片上传到载物台并固定好；第二步：获取多个位置焦面数字；在对其扫描前，首先选定切片多处不同位置，控制载物台移动，按序列的将所选定的每个位置移动到物镜下；在每一个位置，通过调节物镜与样品光轴方向即Z向的相对距离并在不同Z值下多次拍照，图像清晰的那一个位置就是该样品点的焦面值；重复这个操作，获取样品多个分离位置的焦面值；第三步：拟合建模；计算机根据几个孤立点位置的焦面位置情况，拟合出一个样品的连续的焦面表面模型；第四步：实际扫描；控制载物台移动开始扫描，从样品待测区域的起点开始，每一个扫描位置的焦面位置根据扫描前所获取的焦面表面模型获得，焦面调节可以是载物台在Z轴方向运动也可以是物镜在Z轴方向运动。

利用焦面建模的全片数字扫描系统，其缺点是焦面建模时间长，往往与实际全片扫描的时间相当或者更长。同时建模选点多，所获得的焦面模型就准确，各个实际扫描点的焦面信息就比较准确，然而所需要时间很长，建模时间可以长达几分钟。

因此出现第二类焦面信息获取方法即实时测焦方法。在实时测焦方面，美国专利申请US7，232，980、美国专利申请US7，813，579、美国专利申请US8027548、美国专利申请US8，184，920、US5432331,US6023056,US7171054，欧洲专利申请EP2390706及其他专利申请WO2011/080670,WO2011/161594，WO2005/010495等公布用于可以用于数字图像扫描系统的实时测量离焦量的方法，这类方法的共同点是利用倾斜相机来实现样品离开物镜焦面即样品离焦量的测量。这类方法的共同缺点是：第一，在成像所需要的相机之外，还需要一个调焦专用相机，因此该类方法所导致的调焦装置昂贵。第二，该方法所导致的调焦速度会较低，因为成像过程、图像因为数据量大导致传输速度低，大部分相机的帧率都只有15fps,即便忽略计算比较时间，一个帧率15fps的相机所能达到的最快焦面测量周期在60毫秒。第三个缺点是不能兼顾离焦距离测量范围与精度：相机倾斜度高测量范围大但是精度较差，反之，相机倾斜度小测量精度高但是测量范围就小，容易造成焦面丢失现象。第四个缺点是该实时对焦装置体积大，对放置位置要求高。

美国专利申请US20110134308A1公布一种可以用于数字图像扫描系统的实时对焦方法。该实时对焦方案的实时对焦装置中包含一个实时聚焦功能专用的倾斜光栅和一个与之匹配的成像相机。调制倾斜光栅照明模式，产生周期明暗相间的照明空间调制模式落射到样品上，成像相机获取的带有明暗相间照明模式的样品，通过计算机分析相机的明暗条纹中最亮的条纹在图像水平面的位置，从而获取样品待测点离开物镜焦面的距离，通过调焦系统驱动而达到样品表面与物镜焦面重合。然而该方法的第一个缺点是，需要一个调焦专用相机、一个产生明暗条纹的光栅，该方法所导致的调焦装置昂贵。第二个缺点是，该方法所导致的调焦速度会较低，因为成像过程、图像因为数据量大导致传输速度低，大部分相机的帧率都只有15fps,即便忽略计算比较时间，一个帧率15fps的相机所能达到的最快焦面测量周期在60毫秒。第三个缺点是不能兼顾离焦距离测量范围与精度：光栅倾斜度高测量范围大但是精度较差，反之，光栅倾斜度小测量精度高但是测量范围就小，容易造成焦面丢失现象。第四个缺点是该实时对焦装置体积大，对放置位置要求高。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术之不足，提供一种具有实时聚焦的显微切片快速数字扫描装置及其方法，是利用实时测量样品离焦量来避免扫描前耗时的焦面建模过程，将样品当前扫描点的焦面测量与扫描过程并行处理，从而能够提高系统速度与通量，具有简单、快捷、造价低、每小时扫描切片数量通量高、能够较好地兼顾测量范围与测量精度的特点。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种具有实时聚焦的显微切片快速数字扫描装置，包括一个数字显微成像系统及一个与之匹配组合的实时对焦装置；所述数字显微成像系统至少包括计算机、与计算机相连的能够实现光电转换的图像探测装置、显微光学成像系统、与显微光学成像系统同轴设置的照明光学系统及照明光源；在同轴放置的显微光学成像系统与照明光学系统之间放置有自动载物台，自动载物台在载物台控制系统控制下能够带动载物台上的样品沿着至少两个方向即X/Y方向运动，所述计算机与所述载物台控制系统电相连；所述实时对焦装置包括一个测量样品离焦量的离焦测量装置和一个实现样品与显微光学成像系统的物镜的焦面相重合的离焦运动控制装置；

所述离焦测量装置包含沿预置的第一直线方向放置的至少一对光信号探测元件；所述第一直线方向与所述图像探测装置的成像面的共轭面XY之间形成一个夹角为α，各个光信号探测元件在XY平面上的投影位置不相同并且都是在显微光学成像系统的物镜与管镜的视场区域之内；它们的关键技术指标基本等同；

所述至少一对光信号探测元件分别将所接收到的光强度信号线性或接近线性地转换为电信号并分别输出到与之相联接的电信号强度比较元件中，所述比较元件将至少一对光信号探测元件的信号进行比较运算，并输出一个标志样品离开物镜焦面距离的比较信号到与之相连的离焦运动控制装置；

所述离焦运动控制装置根据样品离焦量大小，驱动物镜或者驱动所述自动载物台带动样品沿着Z轴运动，其运动的范围足够使得待测样品表面与物镜的焦面位置在Z轴方向上重合。

进一步优选的是，所述至少一对光信号探测元件设置在与所述数字显微成像系统共享部分光路的位置，所述图像探测装置与所述显微光学成像系统之间设有分光镜，所述照明光源所发出的光线，经过照明光学系统后，透射过样本或者被样本反射后，经过物镜，再经过与照明光学系统同轴设置的显微光学成像系统，再经过分光镜分为两路，一路透射部分沿着透射光轴进入图像探测装置，另一路反射部分沿着反射光轴进入实时对焦装置的离焦测量装置的光信号探测元件。光信号探测元件的光信号接收部分所构成的直线与光轴Z方向有倾斜夹角（90度减去α），并且与图像探测装置的成像面的共轭面相交，交角为α。

进一步优选的是，所述至少一对光信号探测元件设置在与所述数字显微成像系统共享全部光路的位置，所述实时对焦装置的光信号探测元件放置在图像探测装置的图像传感器的紧邻周围，且在沿着光线照射方向上具有不同位置；所述照明光源所发出的光线，经过照明光学系统后，透射过样本或者被样本反射后，经过物镜，再经过与照明光学系统同轴设置的显微光学成像系统，样品所形成的影像的中心部分进入图像探测装置，样品所形成的影像的边缘部分进入实时对焦装置的离焦测量装置的光信号探测元件。

进一步优选的是，所述离焦测量装置包含R个沿第一直线方向放置的光信号探测元件，其中，R≧2，R个光信号探测元件中的相邻两个之间在光路方向的距离相等，所述第一直线在XY平面投影与X轴重合或者平行。即与扫描方向X方向匹配，第一直线与物镜焦面的共轭面XY的夹角为α，相邻两个光信号探测元件所对应的离焦量测量范围[-d,d],R个同一方向放置的光信号探测元件能够构成R-1对光电距离探测装置，能够测量离焦量范围在[-（R-1）*d,（R-1）*d]之间。

进一步优选的是，所述离焦测量装置包含至少两对（即4个）分别放置在沿着第一直线方向和第二直线方向的光信号探测元件；所述第一直线方向的至少一对光信号探测元件在垂直光轴Z方向的XY平面的投影与X轴重合或者平行，即与扫描方向X方向匹配；类似地，所述第二直线上的至少一对光信号探测元件在XY平面投影与扫描方向Y轴重合或者平行；两条直线与XY平面夹角等同为α，如果沿着光路方向Z向旋转第一直线方向放置的光信号探测元件90度就会基本上与第二直线方向放置的光信号探测元件位置重合。

进一步优选的是，所述离焦测量装置至少包含沿两个不同直线方向分别放置的R个光信号探测元件和Q个光信号探测元件，其中，R≧2，Q≧2；所述第一直线方向的R个光信号探测元件与成像面XY的夹角为α，所述第二直线方向的Q个光信号探测元件与成像面XY的夹角为β，α与β为相等或不相等。第一直线测量离焦量范围在[-（R-1）*d,（R-1）*d]之间，第二直线测量离焦量范围在[-（Q-1）*t*d,（Q-1）*t*d]之间。

进一步优选的是，所述离焦测量装置所包含得其光信号探测元件可以是任何探测光信号的元件，如用以探测光强度、能将光强转换为电信号的光电二极管。比较普通的且廉价的选择是使用能够将光强度信号线性地转换为点压信号的光电二级管，因为其速度快、体积小，可以小到如CCD/CMOS相机或者CCD/CMOS摄像头的一个像素，但是每个光信号探测元件是独立输出、具有相等的光信号接收面积及相同的转换效率。

进一步优选的是，放置在同一个X或者Y方向的光信号探测元件多于两个时，相邻两个光信号探测元件之间的距离由它们输出电压之差能够明显的随着离焦量的改变而改变的距离而定，沿着一个方向排列的光信号探测元件每相邻的两个光信号探测元件的距离相等。

进一步优选的是，所述离焦测量装置的比较元件对光信号探测元件输入到其中的电信号进行相减比较，输出带有相位的比较结果的控制信号，比较元件输出的控制信号接至所述离焦运动控制装置，以驱动离焦运动控制装置动作。

进一步优选的是，所述离焦测量装置所包含的比较元件是一个对光电转换输出的两个模拟信号进行相减的差分元件，或者是对一个对光电转换输出的两个模拟信号首先数字转换之后对其进行数字运算的数字计算元件甚至计算机，该计算机为单独的计算机或者是显微成像系统的计算机共用，比较元件与实时对焦装置的离焦运动控制装置电相连。

进一步优选的是，所述离焦运动控制装置与驱动物镜运动的电机相连，离焦运动控制装置驱动物镜在光轴方向移动，移动距离由比较元件所测定的样品离焦距离而定，实现样品待测表面与焦面的重合即对焦。

进一步优选的是，所述离焦运动控制装置与载物台控制装置相连，离焦运动控制装置通过载物台控制装置驱动载物台带动样品在光轴方向移动，移动距离由比较元件所测定的样品离焦距离而定，实现样品待测表面与焦面的重合即对焦。

进一步优选的是，所述图像探测装置是面阵CCD/CMOS相机，或CCD/CMOS摄像头。

一种具有实时聚焦的显微切片快速数字扫描方法，在完成待测样品前一个扫描视场区域L-1后、但在扫描紧邻的下一个视场区域L前，实时对焦装置对样品离开物镜焦面的距离进行实时测量，并根据测量结果驱动离焦运动控制装置实现对扫描L区域扫描前的实时对焦；还包含如下步骤：

第一步：将待扫描的显微切片放置在载物台上，利用载物台片夹装置将待扫描显微切片位置固定，首先获取待测切片的需要进行数字扫描并获取数字图像的区域，接着将待测切片需要数字化区域分成N个长方形条带（N为自然数字），每个条带的宽度由图像探测装置所观测到的样品的视场区域亦即一次曝光所完成的样品扫描区域的较长那边的宽度来决定，每个条带在长度方向上包含M个图像探测装置的扫描视场，每个条带长度方向与载物台运动的X、Y的其中一个方向一致，可以是每个条带长度方向与载物台运动的X方向一致（宽度方向就是载物台的Y方向），也可以是每个条带长度方向与载物台运动的Y方向一致（宽度方向就是载物台的X方向），为方便叙述，假设长方形条带长边与载物台运动的X方向一致；

第二步：控制载物台带动放置在上面的显微切片沿着长方形条带的长度方向亦即载物台的X方向均匀移动，使当前扫描条带匀速地进入显微成像系统的物方视场，在当前扫描条带第L视场进入显微成像系统物方视场过程中，物镜观察到的样品区域部分属于前一扫描视场L-1的后部分区域，部分属于当前视场L的待测区域；在这一个移动过程中，离焦测量装置的光信号探测元件所分别输出的信号到比较元件，比较元件确定当前扫描视场L离焦距离并将该参数送到离焦运动控制装置；

第三步：在载物台匀速运动将样品的第L视场送入到物方视场的过程中，离焦运动控制装置根据比较元件所确定的样品当前视场L离开焦面距离，驱动样品或者物镜沿着光路方向Z移动并使得样品待测表面与物镜的焦面重合，待样品的当前扫描视场L基本上进入物镜物方视场时，计算机控制图像探测装置开始图像采集的曝光，在图像采集的曝光过程中，样品仍然沿着长方形条带即X方向匀速运动；曝光时间与载物台运动速度匹配，使得图像质量因为样本运动所造成的运动模糊没有或者微小到可以忽略；

第四步：等待图像探测装置对当前视场L曝光完成，将所获得的图形数据输运到与图像探测装置相连接的计算机，计算机进行该视场L图像与先前采集的图像的拼接合并工作之后将图像存储；

第五步：重复上面第二到第四步，完成当前扫描条带所有M个扫描区域的扫描；

第六步：控制载物台带动待测样品移动，开始扫描紧邻的下一个扫描条带；重复上述第二到第五步动作；完成该长方形扫描条带的扫描；

第七步：重复上述第六步动作，完成待测样本的所有长方形条带的数字扫描，获得整张切片的已经拼接好的数字图像。

进一步优选的是，在所述第三步骤、第四步骤、第五步骤当中，载物台带动待测样品沿着扫描条带扫描方向即X方向匀速运动。

进一步优选的是，在所述第三步骤、第四步骤、第五步骤当中，在完成前一个扫描区域之后而在载物台完全移动样品紧邻的下一个扫描区域到物镜视场之前，实时对焦装置完成测量样品的离焦量并完成驱动物镜焦面与样品待测面重合。

进一步优选的是，在所述的第六步骤中，控制载物台带动待测样品沿着Y轴方向移动，移动样品的紧邻的下一个扫描条带的最后一个扫描视场如物镜的物方视场，控制载物台沿着-X方向移动，使得该条带的第一个扫描区域为该长方形条带的第一个扫描视场；重复上述第二步骤至第五步骤动作；完成该长方形扫描条带的扫描；

进一步优选的是，所述的长方形条带与长方形条带之间有0～20%之间的重叠量，所述图像探测装置视场即紧邻的扫描视场之间有0～20%之间重叠量。

与现有技术相比较，本发明的有益效果是：

1、本发明的实时对焦装置所使用的光信号探测元件，比已有技术所使用的CCD/CMOS相机廉价；

2、本发明的数据采集频率比已有的使用相机的技术高几个量级；

3、本发明可以使用放置在互相垂直的X/Y方向的两对光信号探测元件，同时测量样品沿X/Y方向的离焦量；

4、本发明可以兼顾大测量范围与高测量精度；

5、本发明利用实时测量样品离焦量来避免扫描前耗时的焦面建模过程，将样品当前扫描点的焦面测量与扫描过程并行处理，从而能够提高系统速度与通量，具有简单、快捷、造价低、每小时扫描切片数量通量高、能够较好地兼顾测量范围与测量精度的优点。

以下结合附图及实施例对本发明作进一步详细说明；但本发明的一种具有实时聚焦的显微切片快速数字扫描装置及其方法不局限于实施例。

附图说明

图1是本发明的总流程图；

图1（A）是本发明的扫描装置（其中数字显微成像系统与实时对焦装置共享部分光路，并适用于通过调节物镜位置实现实时聚焦）示意图；

图1（B）是本发明的扫描装置（其中数字显微成像系统与实时对焦装置共享部分光路，并适用于通过调节载物台位置实现实时聚焦）示意图；

图2（A）是实现本发明的离焦量实时探测（沿着第一直线方向放置二个光信号探测元件）的示意图；

图2（B）是对应于图2（A）的光信号探测元件的输出图及比较元件的输出示意图；

图3（A）是延拓本发明实时调焦范围（沿着第一直线方向放置多个光信号探测元件）的示意图；

图3（B）是对应于图3（A）的光信号探测元件的输出图及比较元件的输出示意图；

图4是本发明的扫描装置（其中数字显微成像系统与实时对焦装置共享全部光路，并适用于通过调节物镜位置实现实时聚焦）示意图；

图5（A）是实时对焦装置的光信号探测元件（共二个）放置在物镜视场边缘的示意图；

图5（B）是实时对焦装置的光信号探测元件（共四个）放置在物镜视场边缘的示意图；

图6是本发明的扫描装置（其中数字显微成像系统与实时对焦装置共享全部光路，并并适用于通过调节载物台位置实现实时聚焦，且离焦运动控制装置与数字显微成像系统的载物台控制装置合并）示意图；

图7是本发明的扫描装置（其中数字显微成像系统与实时对焦装置共享全部光路，并并适用于通过调节载物台位置实现实时聚焦，且离焦运动控制装置与计算机合并）示意图；

图8（A）是本发明的实时对焦装置的光信号探测元件（沿着第一直线包含多个光信号探测元件）分布示意图；

图8（B）是本发明的实时对焦装置的光信号探测元件（沿着多个直线，每个直线包含多个光信号探测元件）分布示意图；

图9是本发明的实时对焦装置的光信号探测元件（沿多个直线方向，每个直线方向包含多个光信号探测元件，且每条直线沿着成像面XY平面的夹角不同）的位置的示意图；

图10是本发明的实时对焦装置的光信号探测元件在XY平面投影均在物镜与管镜的视场之内的示意图。

图11是本发明的扫描区域（示意显微切片分割为多个扫描条带、每个扫描条带包含多个扫描区域）的示意图。

具体实施方式

实施例一：

结合附图1（A）、图1（B）、附图2（A）、2（B）。

本发明的一种具有实时聚焦的显微切片快速数字扫描装置，是一种用于快速获取显微切片全部或者相当大部分的数字图像的扫描装置，包括：一个数字显微成像系统1及一个与之匹配组合的实时对焦装置2。数字显微成像系统1至少包括计算机3，与计算机相连的实现光电转换的图像探测装置4，在置于自动载物台6上面的样品7与图像探测装置4之间的显微光学成像系统5。其中显微光学成像系统5至少包括一个物镜11，与之匹配的管镜18，物镜与管镜之间还可能安放滤镜立方块。数字显微成像系统1至少还包括与光学成像系统5同轴设置的照明光学系统8及照明光源9，在同轴放置的显微光学成像系统5与照明光学系统8之间放置有自动载物台6，自动载物台6在对应的载物台控制系统10控制下能够带动样品7沿着X/Y方向均匀匀速运动，计算机3与载物台控制系统10电相连。

如图1（A）所示，实时对焦装置2包括一个测量样品离焦量的离焦测量装置19，一个实现样品待测表面与物镜的焦面的重合的离焦运动控制装置20。如图2（A）所示，测量样品离焦量的离焦测量装置19包含沿第一直线25方向放置的至少一对（即两个）光信号探测元件16，17，它们的光信号接收部分中心沿着直线25，因此光信号探测元件16，17所构成的直线25与光轴方向有倾斜夹角（90度-α），与成像面24相交，交角为α。成像面24与图像探测装置的图像传感器所形成的表面共轭。光信号探测元件16，17在成像面的共轭面的投影在对应于物镜和管镜的视场区域以内。光信号探测元件除位置不同外，其它关键技术指标等同。

光信号探测元件16、17分别将所接收到的光强度信号线性或接近线性地转换为电信号并分别输出到与之相联接的电信号强度比较元件14，比较元件14将一对光信号探测元件16，17的信号进行比较运算，并输出一个标志样品离开物镜焦面距离的比较信号到与之相连的离焦运动控制装置20；

沿着光轴方向前后放置的一对光信号探测元件16、17，他们沿Z轴上前后放置，在垂直于光路方向上可以随意放置，但是为了方便起见，它们在XY平面的投影要么沿着对应于载物台运动的X方向放置，要么沿着对应于载物台运动的Y方向放置。图2（A）示意沿着Z轴方向前后放置、在XY平面投影位置构成直线的两个光信号探测元件。它们在垂直于光路的平面简称XY平面的投影满足他们在物镜像面共轭的成像空间之内。

测量样品离焦量的离焦测量装置19所包含的光信号探测元件可以是任何探测光信号的元件，如用以探测光强度、能将光强转换为电信号的光电二极管。比较普通的且廉价的选择是使用能够将光强度信号线性地转换为点压信号的光电二级管，因为其速度快、体积小，可以小到如CCD/CMOS相机或者CCD/CMOS摄像头的一个像素，但是每个光信号探测元件是独立输出、具有相等的光信号接收面积及相同的转换效率。

普通的光强探测元件如光电二级管、图像传感器的单个像素、光谱仪中的单个光电转换装置、光电倍增管的光电转换元件等都能以极高的速度输出探测结果。该发明使用独立的光强探测元件，每个光强探测元件的输出是独立的，彼此之间不共享输出电路，从而避免了面阵CCD/CMOS的摄像头使用超百万个阵列排列、共享输出电路的光电转换元件（即像素）所导致速度降低的问题。

图2（B）纵坐标对应于光亮度或者电信号强度I，横坐标对应于样品离开物镜焦面的距离光信号探测元件16、17输出的电信号为图2（A）中曲线60、61所示，假设是分段线性曲线。当样品待测表面与物镜焦面重合时，从样品7处来的光信号经过物镜、成像光路、分光镜13后到达光信号探测元件16、17的信号较弱，比较元件14对它们的输出信号进行比较后的输出也弱如图2（B）曲线MAP的原点O位置示意。

如图2（B）所示，当物镜焦面离开样品待测表面的距离为d时候，光信号探测元件17的有效面处于物镜像面的共轭面上，它这时候接收到的光的信号最强，输出电信号最强在曲线61的N位置，而光信号探测元件16的有效面远离物镜焦面的共轭面，它这时候接收到的光的信号最弱，输出电信号最弱。对光信号探测元件16、17的输出电信号进行比较的比较元件14的输出结果如图2B中曲线MAP的P点所示。

如图2（B）所示，当物镜焦面高于样品待测面距离的-d时，光信号探测元件16的有效面处于物镜像面的共轭面上，它这时候接收到的光的信号最强，输出电信号最强，在曲线60的M位置，而光信号探测元件17的有效面远离物镜焦面的共轭面，它这时候接收到的光的信号最弱，输出电信号最弱。比较元件14输出信号如图2B中M点所示。

如图2（B）所示，当待测样品离开物镜焦面距离在[-d,d]之间时，比较元件14的输出在曲线MAP之间。预先刻度好曲线MA0P，在实际使用中，根据比较元件14输出信号在MOP曲线的位置A，可以推断物镜焦面离开待测样品表面的距离X。在离焦范围在[-d,d]之间时，实时对焦装置2能够根据比较元件14的输出结果获得离焦量的定量数字。

如图1（A）所示，比较元件14与离焦控制装置20电相连。离焦控制装置20包括物镜运动控制装置15和驱动电机12，离焦控制装置20可以根据比较元件14所测得的样品离焦量大小，其物镜运动控制装置15驱动电机12带动物镜11沿着光轴Z1方向运动，使得待测样品7表面与物镜的焦面位置在光轴Z1方向上重合。在图1（A）所示实例中，Z轴运动控制装置15与运动实现装置12电相连，运动实现装置可以是步进电机、直流电机、伺服电机、压电陶瓷电机或者别的运动实现装置。

如图1（B）所示，对于可以X、Y、Z三维运动的载物台，离焦控制装置20也可以与载物台控制装置10合并。比较元件14与载物台控制装置10电相连。载物台控制装置10能够以比较元件14所测得的样品离焦量X大小，驱动载物台带动样品在光路方向X方向运动，使得待测样品表面与物镜的焦面位置在光轴Z1方向上重合。从而实现系统的实时对焦。

实施例二：

结合附图1（A）、图1（B）、附图3（A）、3（B）。

该实施例与实施例一相比较，只是拓展实施例一的离焦量探测范围。因此除了多放置几个光信号探测元件以外，其余部件相同，在此不再重复叙述，下面仅仅描述本实施例特别的地方即离焦量测量部分。

当沿着第一直线方向的一对光信号探测元件所能够有效测得的离焦距离2d不能够满足要求时，可以沿着该直线放置多对光信号探测元件。图3（A）示意放置两对即4个光信号探测元件的情况，它们在XY平面投影沿着X方向，其中第一对光信号探测元件16、17能够测量的焦面离焦范围为2d,在光信号探测元件16沿光路方向远离物品方向放置光信号探测元件26，在光信号探测元件17沿光路方向物品7方向更近距离放置光信号探测元件27。在光轴方向Z上光信号探测元件26与电转换元件16的距离与光信号探测元件16、17的距离相等，与转换元件17、27的距离也相等，就是说它们在光轴方向的距离两两相等。

图3（A）所示放置4个光信号探测元件的输出图如图3（B）示意。光信号探测元件26输出曲线如图3（B）中曲线32所示，类似地光信号探测元件16输出曲线如图3（B）中曲线28所示。这两个光信号探测元件的输出与它们电相连的比较元件14相连，比较元件14输出曲线如图3（B）中曲线33所示。在样品离焦面-3d时候，光信号探测元件26正处于物镜焦面共轭面，因此输出最大在曲线33所示的Q位置，而其它三个光信号探测元件16、17、27都远离物镜焦面的共轭面，因此接收到的光信号很弱，几乎为零。比较元件14的输出中，只有比较光信号探测元件26、16的输出曲线32、28才有对应于曲线33的Q点的输出。当在样品离焦面-d时候，光信号探测元件16正处于物镜焦面共轭面，因此输出最大在曲线28所示的R位置，而其它三个光信号探测元件26、17、27都远离物镜焦面的共轭面，因此接收到的光信号很弱，几乎为零。比较元件14的输出中，只有比较光信号探测元件对26、16的输出曲线32、28才有对应于曲线33的U点的输出。因此当样品7待测表面离开物镜11焦面的距离在-3d到-d之间时，离焦测量装置19的比较元件14输出曲线如3（B）中曲线33所示即QU曲线。

如图3（B）所示，当样品7待测表面离开物镜焦面的距离在-d到d之间时，离焦测量装置19的比较元件输出曲线如3（B）中曲线30所示。当在样品离焦面-d时候，光信号探测元件16正处于物镜焦面共轭面，因此输出最大在曲线28所示的R位置，而其它三个光信号探测元件26、17、27都远离物镜焦面的共轭面，因此接收到的光信号很弱，几乎为零。比较元件14的输出中，只有比较光信号探测元件对26、16的输出曲线32、28才有对应于曲线33的U点的输出，比较元件14对应于光信号探测元件对16、17的输出也是在曲线30的R点。当在样品离焦面d时候，光信号探测元件17正处于物镜焦面共轭面，因此输出最大在曲线29所示的S位置，而其它三个光信号探测元件26、16、27都远离物镜焦面的共轭面，因此接收到的光信号很弱，几乎为零。比较元件14的输出中，比较元件14对应于光信号探测元件对16、17的输出也是在曲线30的V点，因此当样品7待测表面离开物镜11焦面的距离在-d到d之间时，离焦测量装置19的比较元件输出曲线如3（B）中曲线30所示即RV曲线。

类似地，如图3（B）所示，因此当样品7待测表面离开物镜11焦面的距离在d到3d之间时，离焦测量装置19的比较元件输出曲线如3B中曲线34所示即SW曲线。

本发明的优点是通过放置多个光信号探测元件实现大的离焦范围的分段测量，在保证测量精度的同时，拓展测量范围，从而避免别的实时离焦测量方法由于测量范围小而导致的脱焦现象或者为了保证较大测量范围而带来焦面测量精度低等问题。

在上述描述中，只是以举例的形式描述在XY平面投影沿X方向成直线放置4个光信号探测元件，它们在光路Z方向两两等距离摆放在物镜焦面的共轭成像体积内。为了更大的拓展离焦量测量范围，还可以继续呈直线添加更多的光信号探测元件，该执行与XY平面夹角为δ，它们在光路方向Z上前后两两等距离放置。

实施例三：

该实施例与实施例一相比较，在于在第一直线方向放置一对光信号探测元件，它们在XY平面投影沿着X方向，它们与XY平面构成夹角α。在此基础之上，在第二直线方向放置第二对光信号探测元件，它们与XY平面构成夹角也为α，第二对在XY平面的投影与Y方向平行。因此与实施例一相比，除了在Y方向多放置一对光信号探测元件以为，其余部件相同，在此不再重复叙述。

在本实施例子中，在XY平面投影为X/Y方向的光电转换的离焦测量范围分别是[-d,d]之间。当沿着X方向的离焦测量装置测定离焦量为x,而沿着Y方向的离焦测量装置测定离焦量为y,那么可以使用这两个测量值的加权平均来作为系统离焦测量装置的输出，比如离焦量为二者的简单平均。

实施例四：

该实施例与实施例二相比较，在于在第一直线方向放置多对光信号探测元件基础之上，在垂直于第一直线方向的再放置多对光信号探测元件，两个直线方向与成像面夹角均为α。因此除了在第二方向放置一些光信号探测元件以为，其余部件与第二实施例相同，在此不再重复叙述。

在本实施例子中，沿着第一直线方向与第二直线方向的光电转换的离焦测量范围是[-md,md]之间。当沿着第一方向的离焦测量装置测定离焦量为x,而沿着第二方向的离焦测量装置测定离焦量为y,那么可以使用这两个测量值的加权平均来作为系统离焦测量装置的输出，比如离焦量为二者的简单平均。

实施例五：

结合附图4、附图5（A）、5（B），附图2（A）、2（B）。

本发明的一种具有实时聚焦的显微切片快速数字扫描装置，是一种用于快速获取显微切片全部或者相当大部分的数字图像的扫描装置，包括：一个数字显微成像系统1及一个与之匹配组合的实时对焦装置2。数字显微成像系统1至少包括计算机3，与计算机相连的实现光电转换的图像探测装置4，在置于载物台6上面的样品7与图像探测装置4之间的显微光学成像系统5。其中显微光学成像系统5至少包括一个物镜11，与之匹配的管镜52，物镜与管镜之间还可能安放滤镜立方块51。数字显微成像系统1至少还包括与显微光学成像系统5同轴设置的照明光学系统8及照明光源9，在同轴放置的显微光学成像系统5与照明光学系统8之间放置有自动载物台6，自动载物台6在对应的控制系统10控制下能够带动样品7能至少沿着X/Y方向运动，计算机与载物台控制系统10电相连。

如图4所示，实时对焦装置2包括一个测量样品离焦量的装置19，一个实现样品待测表面与物镜的焦面的重合的离焦运动控制装置20。测量样品离焦量的离焦测量装置19包含至少一对（即两个）放置在沿光路方向Z前后不同位置的光信号探测元件16，17，它们在沿着光轴垂直的平面上的位置也是不同的。如图5（A）所示，物镜及管镜的视场一般是圆形区域21。光信号探测元件16、17放置在紧邻图像探测装置4的图像传感器方形区域22周围，从样品来的光信号通过物镜、成像光学系统5后中心部分进入图像探测装置4的图像传感器方形区域22，边缘部分进入光信号探测元件16，17。物镜及管镜的视场一般在22毫米，而一般摄像头对角线尺寸在1/2”到2/3”之间，也少有使用大靶面摄像头如4/3”的。摄像头靶面最大是与光学成像系统的视场圆圈内接。在方形图像传感器和与之外接的光学成像系统的视场圆圈之间，有一个所有这些摄像头都留有足够的边缘放置几个微小的光信号探测元件16、17的，它们的光电转换部分尺寸可以小到几个微米，就如图像传感器的一个像素，电传输及电数字化转换部分可以外接。

作为举例，图5（A）中示意光信号探测元件16、17在XY平面的投影沿着X方向的位置连成平行于X的直线，经过物镜焦面的共轭面中心及X/Y/Z座标系原点。在图4中，光信号探测元件16，17的光信号接收部分所构成的平面62与光轴方向有倾斜夹角并且与图像探测器图像传感器的表面即成像面63相交夹角为α，成像面63与物镜焦面共轭，光信号探测元件除位置不同外，其它关键技术指标等同。

如图2（B）所示，光信号探测元件16、17分别将所接受到的光强度信号线性或接近线性地转换为电信号并分别输出到与之相联接的电信号强度比较元件14，比较元件14将一对光信号探测元件的信号进行比较运算，并输出一个标志样品离开物镜焦面距离的比较信号到与之相连的离焦运动控制装置20；

沿着光轴方向前后放置的一对光信号探测元件16、17，他们沿Z轴上前后放置，在垂直于光路方向上可以随意放置，但是为了方便起见，要么沿着对应于载物台运动的X方向放置，要么沿着对应于载物台运动的Y方向放置。图2（A）示意沿着Z轴方向前后放置、投影在X方向位置构成直线的两个光信号探测元件。它在垂直于光路的平面简称XY平面的投影的距离满足他们在物镜像面共轭的成像空间之内。光信号探测元件16、17输出的电信号为图2（B）中曲线60、61所示曲线。图2（B）纵坐标对应于光亮度或者电信号强度I，横坐标对应于样品离开物镜焦面的距离。

当样品待测表面与物镜焦面重合时，从样品7处来的光信号经过物镜11、显微光学成像系统5后到达光信号探测元件16、17的信号较弱。当物镜焦面离开样品待测表面的距离为d时候，光信号探测元件17的有效面处于物镜像面的共轭面上，它这时候接收到的光的信号最强，输出电信号最强，而光信号探测元件16的有效面远离物镜焦面的共轭面，它这时候接收到的光的信号最弱，输出电信号最弱。对光信号探测元件16、17的输出电信号进行比较的比较元件14的输出结果如图2（B）中曲线M0P所示。当物镜焦面高于样品待测面距离的d时，比较元件14输出信号如图2（B）中P点所示。当物镜焦面低于样品待测面距离的d时，比较元件14输出信号如图2（B）中M点所示。预先刻度好曲线M0P，在实际使用中，根据比较元件14输出信号在MOP曲线的位置A，可以推断物镜焦面离开待测样品表面的距离X。

如图5（B）所示，除了沿X方向成直线且沿Z方向前后放置光信号探测元件16、17外，还可以类似地沿Y方向成直线且沿Z方向前后放置光信号探测元件26、27。离焦测量装置19所测得的样品7待测表面离焦量由X方向与Y方向所测得的离焦量的加权平均值来确定。

如图4所示，比较元件14与离焦控制装置20电相连。离焦控制装置20包含物镜运动控制装置15和物镜运动执行装置12。能够以比较元件14所测得的样品离焦量大小，其物镜运动控制装置15驱动电机12带动物镜11沿着光轴Z1方向运动，使得待测样品7表面与物镜的焦面位置在光轴Z1方向上重合。在图4所示实例中，Z轴运动控制装置15与运动实现装置12电相连，运动实现装置可以是步进电机、直流电机、伺服电机、压电陶瓷电机或者别的运动实现装置。

实施例六：

结合附图6、附图7、附图5，附图2（A）、2（B）、附图3（A）、3（B）、附图8。

如图6所示，对于可以X、Y、Z三维运动的载物台，离焦控制装置20也可以与载物台控制装置10合并。比较元件14与载物台控制装置10电相连。载物台控制装置10根据比较元件14所测得的样品离焦量大小，驱动载物台带动样品在光路方向Z方向运动，使得待测样品表面与物镜的焦面位置在光轴Z1方向上重合。

在具体实施中，也可以如附图7所示，将比较元件与计算控制元件（如计算机）3直接相连，由计算控制元件3分析比较元件的输出结果，直接控制载物台控制装置10。由载物台控制装置10驱动载物台带动样品在光路方向Z方向运动，使得待测样品表面与物镜的焦面位置在光轴Z1方向上重合。

当一对沿着第一方向放置的物镜转换元件所能够有效测得的离焦距离2d不能够满足要求时，可以多放置多对光信号探测元件。图8（A）示意沿着第一方向放置6个光信号探测元件，它们每相邻两个构成一对，一共5对光信号探测元件。第一方向与成像面XY平面夹角为α，在光轴方向Z上光信号探测元件35与电转换元件37的距离为δ、与光信号探测元件37、16的距离相等也为δ，与转换元件16、17的距离也相等为δ，与转换元件17、38的距离也相等为δ，与转换元件38、36的距离也相等为δ，就是说它们在光轴方向的距离两两相等，间距为δ。第一对光信号探测元件35、37所测得的离焦范围为[-5d,-3d]；第二对光信号探测元件37、36所测得的离焦范围为[-3d,-d]；第三对光信号探测元件16、17所测得的离焦范围为[-d,d]；第四对光信号探测元件17、38所测得的离焦范围为[d,3d]；第五对光信号探测元件38、36所测得的离焦范围为[3d,5d]。类似地，如果沿着Z方向等距离δ放置R个光信号探测元件，它们构成R-1对，可以测量离焦范围[（-R+1）d,(R-1)d],其中“d”与光信号探测元件Z向间距δ、光电转换效率等有关系。

以上具体实施例中，沿着Z方向的光信号探测元件的距离也可以是非等间距的。方向也不仅仅限制在X/Y方向，在XY平面内任意方向均可。

图8（B）示意沿着第一方向放置6个光信号探测元件，沿着第二方向放置6个光信号探测元件。

本实例其它方面与实施例五类似或者是前面几个实施例的组合，在此不再重复。

实施例七：

结合附图9、附图10。

在实施例六中沿着第一直线方向的R个光信号探测元件，它们紧邻两者之间沿着Z方向等间距δ，它们构成R-1对，可以测量离焦范围[（-R+1）d,(R-1)d],其中“d”与光信号探测元件Z向间距δ、光电转换效率等有关系。如附图9所示，为了进一步拓展离焦测量装置的离焦量测量范围，还可以在第二方向放置另外一组光信号探测元件Q。第一方向包含R个光信号探测元件，它们在XY平面的投影沿X方向，它们构成的直线与成像面XY之间夹角α较小，用以保持较高的测量精度；第二直线方向放置另外一组Q个光信号探测元件，它们在XY平面的投影沿Y方向：它们构成的直线与成像面XY之间夹角β较大，用以保持较高的测量范围，它们的离焦量测量范围为[（-R+1）*t*d,(R-1)*t*d],其中t是大于1的数。在附图9中，作为举例R值为4：光信号探测元件26、16、27、17两两之间Z向间距为δ，它们的离焦量测量范围为[（-3d,3d]。而在Y方向放置的光信号探测元件Q值也碰巧是4个：48、47、49、50，它们两两之间Z向间距为3δ，它们的离焦量测量范围为[-9d,9d]。

如附图10所示，R个光信号探测元件在XY平面的投影是沿着X方向的，Q个光信号探测元件在XY平面的投影是沿着另一个方向如Y方向的。它们在XY方向投影都包含在物镜与管镜的视场21之内。

类似地，还可以根据需要放置第三组光信号探测元件，第4组光信号探测元件等等，它们构成的直线与成像面XY之间夹角分别是α、β、γ等等。用以满足各种各样的离焦测量精度与离焦测量范围的要求。

在具体实施中，沿着Z方向的光信号探测元件的距离也可以是非等间距的。方向也不仅仅限制在X/Y方向，在XY平面内任意方向均可。

本实例其它方面与实施例六例相似或者是前面几个实施例的组合，在此不再重复。

结合以上实施例一～七，快速测量样品待测表面离开物镜焦面的距离。本总体实施例是在以上具体实施离焦量测量的实例基础上，实现系统实时聚焦快速扫描整个切片或者切片相当大部分的快速数字扫描具体实施方法举例。

如附图11所示。

本发明的一种具有实时聚焦的显微切片快速数字扫描方法，即一种用于快速获取显微切片全部或者相当大部分的数字图像的扫描方法，在完成待测样品前一个扫描视场区域L-1后、但在扫描紧邻的下一个视场区域L前，实时对焦装置对样品离开物镜焦面的距离进行实时测量，并根据测量结果驱动离焦运动控制装置实现对扫描L区域扫描前的实时对焦；还包含如下步骤：

第一步：将待扫描的显微切片放置在载物台6上，利用载物台片夹装置将待扫描显微切片位置固定，首先获取待测切片的需要进行数字扫描并获取数字图像的区域，接着将待测切片需要数字化区域分成N个长方形条带（N为自然数字）：第1条带、2条带…N条带，每个条带包含多个图像探测装置的视场（又称像方视场也称单次扫描视场区域）：1视场、2视场、L-1视场、L视场、L+1视场,…,M视场；每个条带的宽度由图像探测器所观测到的样品的视场区域亦即一次曝光所完成的样品扫描区域的较长那边的宽度来决定，每个条带在长度方向上包含M个图像探测装置的扫描视场，每个条带长度方向与载物台运动的X方向一致（宽度方向就是载物台的Y方向），也可以是每个条带长度方向与载物台运动的Y方向一致（宽度方向就是载物台的X方向），为方便叙述，假设长方形条带长边与载物台运动的X方向一致；

第二步：控制载物台6带动放置在上面的显微切片沿着长形状条带的长度方向亦即载物台的X方向均匀移动，使当前扫描条带匀速地进入显微成像系统的物方视场，在当前扫描条带第L视场进入显微成像系统物方视场过程中，物镜观察到的样品区域部分属于前一扫描视场L-1的后部分区域，部分属于当前视场L的待测区域；在这一个移动过程中，离焦测量装置19的光信号探测元件16、17所分别输出的信号到比较元件14，比较元件14确定当前扫描视场L离焦距离并将该参数送到离焦运动控制装置20；在扫描每一个长方形条带过程中，样品基本匀速运动通过显微成像系统的物方视场（物镜视场）；在完成一个条带的前一个像方视场数字成像扫描后但在扫描同一条带的下一个像方视场前，实时对焦装置2对样品离开物镜焦面的距离进行测量并根据测量结果驱动离焦运动控制装置20以便在实时对焦过程中提供及时反馈；

第三步：在载物台匀速运动将样品的第L视场送入到物方视场的过程中，离焦运动控制装置20根据比较元件14所确定的样品7当前视场L离开焦面距离，驱动样品或者物镜沿着光路方向Z移动并使得样品待测表面与物镜的焦面重合，待样品的当前扫描视场L基本上进入物镜物方视场时，计算机控制图像探测装置4开始图像采集的曝光，在图像采集的曝光过程中，样品7仍然沿着X方向匀速运动；曝光时间与载物台运动速度匹配，使得图像质量因为样本运动所造成的运动模糊没有或者微小到可以忽略；

第四步：等待图像采集装置对当前视场L曝光完成，将所获得的图形数据输运到与图像采集装置相连接的计算机3，计算机3进行该视场L图像与先前采集的图像的拼接合并工作之后将图像存储；

第五步：重复上面第二到第四步，完成当前扫描条带所有M个扫描区域的扫描；

第六步：控制载物台带动待测样品移动，开始扫描紧邻的下一个扫描条带；重复上述第二到第五步动作；完成该长方形扫描条带的扫描；

第七步：重复上述第六步动作，完成待测样本的所有长方形条带的数字扫描，获得整张切片的已经拼接好的数字图像。

在上述第三步骤、第四步骤、第五步骤当中，载物台带动待测样品沿着扫描条带扫描方向即X方向匀速运动。

在上述第三步骤、第四步骤、第五步骤当中，在完成前一个扫描区域之后而在载物台完全移动样品紧邻的下一个扫描区域到物镜视场之前，实时对焦装置完成测量样品的离焦量并完成驱动物镜焦面与样品待测面重合。

在上述的第六步骤中，控制载物台带动待测样品沿着Y轴方向移动，移动样品的紧邻的下一个扫描条带的最后一个扫描视场如物镜的物方视场，控制载物台沿着-X方向移动，使得该条带的第一个扫描区域为该长方形条带的第一个扫描视场；重复上述第二步骤至第五步骤动作；完成该长方形扫描条带的扫描；

所述的长方形条带与长方形条带之间可以有0～20%之间的重叠量，所述图像探测装置视场即紧邻的扫描视场之间可以有0～20%之间重叠量。

上述说明示出并描述了本发明的优选实施例，如前所述，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。

Claims (18)

1.一种具有实时聚焦的显微切片快速数字扫描装置，包括一个数字显微成像系统及一个与之匹配组合的实时对焦装置；所述数字显微成像系统至少包括计算机、与计算机相连的能够实现光电转换的图像探测装置、显微光学成像系统、与显微光学成像系统同轴设置的照明光学系统及照明光源；在同轴放置的显微光学成像系统与照明光学系统之间放置有自动载物台，自动载物台在载物台控制系统控制下能够带动载物台上的样品沿着至少两个方向运动，所述计算机与所述载物台控制系统电相连；所述实时对焦装置包括一个测量样品离焦量的离焦测量装置和一个实现样品与显微光学成像系统的物镜的焦面相重合的离焦运动控制装置；其特征在于： 

所述离焦测量装置包含沿预置的第一直线方向放置的至少一对光信号探测元件；所述第一直线方向与所述图像探测装置的成像面的共轭面XY之间形成一个夹角，各个光信号探测元件在XY平面上的投影位置不相同并且都是在显微光学成像系统的物镜与管镜的视场区域之内； 

所述至少一对光信号探测元件分别将所接收到的光强度信号线性或接近线性地转换为电信号并分别输出到与之相联接的电信号强度比较元件中，所述比较元件将至少一对光信号探测元件的信号进行比较运算，并输出一个标志样品离开物镜焦面距离的比较信号到与之相连的离焦运动控制装置； 

所述离焦运动控制装置根据样品离焦量大小，驱动物镜或者驱动所述自动载物台带动样品沿着Z轴运动，其运动的范围足够使得待测样品表面与物镜的焦面位置在Z轴方向上重合。 

2.根据权利要求1所述的具有实时聚焦的显微切片快速数字扫描装置，其特征在于：所述至少一对光信号探测元件设置在与所述数字显微成像系统共享部分光路的位置，所述图像探测装置与所述显微光学成像系统之间设有分光镜，所述照明光源所发出的光线，经过照明光学系统后，透射过样本或者被样本反射后，经过物镜，再经过与照明光学系统同轴设置的显微光学成像系统，再经过分光镜分为两路，一路透射部分沿着透射光轴进入图像探测装置，另一路反射部分沿着反射光轴进入实时对焦装置的离焦测量装置的光信号探测元件。 

3.根据权利要求1所述的具有实时聚焦的显微切片快速数字扫描装置，其特征在于：所述至少一对光信号探测元件设置在与所述数字显微成像系统共享全部光路的位置，所述实时对焦装置的光信号探测元件放置在图像探测装置的图像传感器的紧邻周围，且在沿着光线照射方向上具有不同位置；所述照明光源所发出的光线，经过照明光学系统后，透射过样本或者被样本反射后，经过物镜，再经过与照明光学系统同轴设置的显微光学成像系统，样品所形成的影像的中心部分进入图像探测装置，样品所形成的影像的边缘部分进入实时对焦装置的离焦测量装置的光信号探测元件。 

4.根据权利要求1所述的具有实时聚焦的显微切片快速数字扫描装置，其特征在于：所述离焦测量装置包含R个沿第一直线方向放置的光信号探测元件，其中，R≧2，R个光信号探测元件中的相邻两个之间在光路方向的距离相等，所述第一直线在XY平面投影与X轴重合或者平行。 

5.根据权利要求1所述的具有实时聚焦的显微切片快速数字扫描装置，其特征在于：所述离焦测量装置包含至少两对分别放置在沿着第一直线方向和第二直线方向的光信号探测元件；所述第一直线方向的至少一对光信号探测元件在垂直光轴Z方向的XY平面的投影与X轴重合或者平行，所述第二直线上的至少一对光信号探测元件在XY平面投影与扫描方向Y轴重合或者平行；两条直线与XY平面夹角等同。 

6.根据权利要求5所述的具有实时聚焦的显微切片快速数字扫描装置，其特征在于：所述离焦测量装置至少包含沿两个不同直线方向分别放置的R个光信号探测元件和Q个光信号探测元件，其中，R≧2，Q≧2；所述第一直线方向的R个光信号探测元件与成像面XY的夹角为α，所述第二直线方向的Q个光信号探测元件与成像面XY的夹角为β，α与β为相等或不相等。 

7.根据权利要求1所述的具有实时聚焦的显微切片快速数字扫描装置，其特征在于：所述离焦测量装置的光信号探测元件为光电二极管。 

8.根据权利要求5所述的具有实时聚焦的显微切片快速数字扫描装置，其特征在于：放置在同一个X或者Y方向的光信号探测元件多于两个时，相邻两个光信号探测元件之间的距离由它们输出电压之差能够明显的随着离焦量的改变而改变的距离 而定，沿着一个方向排列的光信号探测元件每相邻的两个光信号探测元件的距离相等。 

9.根据权利要求1所述的具有实时聚焦的显微切片快速数字扫描装置，其特征在于：所述离焦测量装置的比较元件对光信号探测元件输入到其中的电信号进行相减比较，输出带有相位的比较结果的控制信号，比较元件输出的控制信号接至所述离焦运动控制装置，以驱动离焦运动控制装置动作。 

10.根据权利要求1所述的具有实时聚焦的显微切片快速数字扫描装置，其特征在于：所述离焦测量装置所包含的比较元件是一个对光电转换输出的两个模拟信号进行相减的差分元件，或者是对一个对光电转换输出的两个模拟信号首先数字转换之后对其进行数字运算的数字计算元件甚至计算机，该计算机为单独的计算机或者是显微成像系统的计算机共用，比较元件与实时对焦装置的离焦运动控制装置电相连。 

11.根据权利要求1所述的具有实时聚焦的显微切片快速数字扫描装置，其特征在于：所述离焦运动控制装置与驱动物镜运动的电机相连，离焦运动控制装置驱动物镜在光轴方向移动，移动距离由比较元件所测定的样品离焦距离而定，实现样品待测表面与焦面的重合即对焦。 

12.根据权利要求1所述的具有实时聚焦的显微切片快速数字扫描装置，其特征在于：所述离焦运动控制装置与载物台控制装置相连，离焦运动控制装置通过载物台控制装置驱动载物台带动样品在光轴方向移动，移动距离由比较元件所测定的样品离焦距离而定，实现样品待测表面与焦面的重合即对焦。 

13.根据权利要求1所述的具有实时聚焦的显微切片快速数字扫描装置，其特征在于：所述图像探测装置是面阵CCD/CMOS相机，或CCD/CMOS摄像头。 

14.一种具有实时聚焦的显微切片快速数字扫描方法，其特征在于：包含如下步骤： 

第一步：将待扫描的显微切片放置在载物台上，利用载物台片夹装置将待扫描显微切片位置固定，首先获取待测切片的需要进行数字扫描并获取数字图像的区域，接着将待测切片需要数字化区域分成N个长方形条带，其中N为自然数字，每个条带的 宽度由图像探测装置所观测到的样品的视场区域决定，每个条带在长度方向上包含M个图像探测装置的扫描视场，每个条带长度方向与载物台运动的X、Y的其中一个方向一致； 

第二步：控制载物台带动放置在上面的显微切片沿着长方形条带的长度方向均匀移动，使当前扫描条带匀速地进入显微成像系统的物方视场，在当前扫描条带第L视场进入显微成像系统物方视场过程中，物镜观察到的样品区域部分属于前一扫描视场L-1的后部分区域，部分属于当前视场L的待测区域；在这一个移动过程中，离焦测量装置的光信号探测元件所分别输出的信号到比较元件，比较元件确定当前扫描视场L离焦距离并将该参数送到离焦运动控制装置； 

第三步：在载物台匀速运动将样品的第L视场送入到物方视场的过程中，离焦运动控制装置根据比较元件所确定的样品当前视场L离开焦面距离，驱动样品或者物镜沿着光路方向Z移动并使得样品待测表面与物镜的焦面重合，待样品的当前扫描视场L基本上进入物镜物方视场时，计算机控制图像探测装置开始图像采集的曝光，在图像采集的曝光过程中，样品仍然沿着长方形条带方向匀速运动；曝光时间与载物台运动速度匹配，使得图像质量因为样本运动所造成的运动模糊没有或者微小到可以忽略； 

第四步：等待图像探测装置对当前视场L曝光完成，将所获得的图形数据输运到与图像探测装置相连接的计算机，计算机进行该视场L图像与先前采集的图像的拼接合并工作之后将图像存储； 

第五步：重复上面第二到第四步，完成当前扫描条带所有M个扫描区域的扫描； 

第六步：控制载物台带动待测样品移动，开始扫描紧邻的下一个扫描条带；重复上述第二到第五步动作；完成该长方形扫描条带的扫描； 

第七步：重复上述第六步动作，完成待测样本的所有长方形条带的数字扫描，获得整张切片的已经拼接好的数字图像。 

15.根据权利要求14所述的具有实时聚焦的显微切片快速数字扫描方法，其特征在于：在所述第三步骤、第四步骤、第五步骤当中，载物台带动待测样品沿着扫描 条带扫描方向即X方向匀速运动。 

16.根据权利要求14所述的具有实时聚焦的显微切片快速数字扫描方法，其特征在于：在所述第三步骤、第四步骤、第五步骤当中，在完成前一个扫描区域之后而在载物台完全移动样品紧邻的下一个扫描区域到物镜视场之前，实时对焦装置完成测量样品的离焦量并完成驱动物镜焦面与样品待测面重合。 

17.根据权利要求14所述的具有实时聚焦的显微切片快速数字扫描方法，其特征在于：在所述的第一步骤中，每个条带长度方向与载物台运动的X方向一致；所述的第六步骤中，控制载物台带动待测样品沿着Y轴方向移动，移动样品的紧邻的下一个扫描条带的最后一个扫描视场如物镜的物方视场，控制载物台沿着-X方向移动，使得该条带的第一个扫描区域为该长方形条带的第一个扫描视场；重复上述第二步骤至第五步骤动作；完成该长方形扫描条带的扫描。 

18.根据权利要求14所述的具有实时聚焦的显微切片快速数字扫描方法，其特征在于：所述的长方形条带与长方形条带之间有0～20%之间的重叠量，所述图像探测装置视场即紧邻的扫描视场之间有0～20%之间重叠量。 

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