CN103841960B

CN103841960B - 用于吸入的方法和制剂

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Publication number: CN103841960B
Application number: CN201180073937.6A
Authority: CN
Inventors: 米歇尔·麦金托什; 大卫·莫顿; 托马斯·苏; 利夫西·奥莱里勒; 理查德·普兰克尔德
Original assignee: Monash University
Current assignee: Monash University
Priority date: 2011-08-01
Filing date: 2011-11-07
Publication date: 2017-07-07
Anticipated expiration: 2031-11-07
Also published as: CY1121373T1; HRP20190080T1; LT2739268T; HUE041858T2; RS58456B1; ZA201401526B; SI2739268T1; EP2739268A1; EP2739268B1; TR201900670T4; US11065297B2; WO2013016754A1; AU2011374218A1; DK2739268T3; BR112014002646B1; BR112014002646A2; CA2879317C; ES2708218T3; BR112014002646A8; EP2739268A4

Abstract

本发明涉及药物递送，并且具体地，涉及用于吸入的干粉形式的生物活性剂的递送。本发明还涉及用于制备该类干粉制剂的方法和它们的使用方法。

Description

用于吸入的方法和制剂

每年，超过150000名妇女死于产后出血，其中大部分发生在发展中国家。在分娩第三期，通过子宫收缩药物的施用（如缩宫素），这种情况基本上是可预防的。世界卫生组织已认可缩宫素是产后出血治疗中最有效的疗法。在发展中国家，缩宫素的使用存在几个困难。缩宫素是在溶液中稳定性相对较差的肽。那么，这需要冷藏，例如，在2-8℃，这在发展中国家是成问题的。使用缩宫素的其它考虑是它需要灭菌针和注射器以及进行施用的受训练人员，这是发展中国家中难以保证的另外一个要求。因此，要解决的问题是开发在发展中国家中正确使用的有效且廉价的缩宫素递送系统，以避免在分娩中由于PPH的死亡。该问题的一个可能的解决方法可以是产生适合于缩宫素或其它生物活性肽或蛋白质有效且可负担的施用的干粉肺递送系统，其适合于在发展中国家的偏远和环境要求区域中使用。

肺递送已提议成为适合于生物制剂的全身途径，所述生物制剂如肽、蛋白质、疫苗和核酸基试剂。递送这些大分子的困难是相当大的，并且对于成功的可能性来说，导致了广泛和较大的不确定性与风险。困难首先是产生适合于有效和稳定深肺递送的适合剂量的气溶胶。如果可以实现这种适合的递送，则材料必须溶解或者以可以输送穿过生物膜及其它屏障（如表面活性剂和粘膜界面）的这种形式可用。溶解动力学将决定溶解的程度，并且预期这将受到疏水性制剂的阻碍并因此材料在全身性吸收之前经受肺部清除时间，如O'Donnel和Smythe在2011年由Springer出版的“药物肺部控制递送（Controlled PulmonaryDrug Delivery）”，ISBN978-1-4419-9744-9中所列的。在可以将大分子输送到体循环中之前，它必须能经受身体防御机制的攻击，包括来自黏膜纤毛活动梯、来自肽酶和来自巨噬细胞的攻击。在最近的专家教科书：2011年由Springer出版的“药物肺部控制递送（Controlled Pulmonary Drug Delivery）”，ISBN978-1-4419-9744-9中清楚地综述并列出了这些困难。例如，Olsson等人得到结论：“对于肽和蛋白质的全身靶标，困难似乎是以相对于清除机制速率的竞争性速率实现吸收，以确保足够的生物利用率”和“在每种具体情况下，构成最佳特征的内容以及如何可以从以我们目前的理解仍远不清楚的抽象性质中预测这些内容”。已提议相对于主要是亲水性的所选小分子（如小于781Da）的口服递送，肺递送作用快速发生。然而，对于分子量通常约1000Da及以上的大分子（如肽和蛋白质），作用的开始是高度不确定的并且可能受到对细胞间扩散机制的需要的阻碍。通过这类膜从肺上皮细胞移除至血液的半衰期是剧烈变化并且不确定的，但是通常似乎需要几分钟，甚至超过几百分钟，如Sakagami和Gumbleton在2011年由Springer出版的“药物肺部控制递送（Controlled Pulmonary Drug Delivery）”，ISBN978-1-4419-9744-9中所列出的。因此，明显地，从肺部递送的大分子，不会假设对于约l000Da和更大的肽会有约1或2分钟的快速药物动力学吸收和药效发生，并且这将会是令人吃惊的。如果肺递送系统包含需要溶解的粉末，则将是特别令人吃惊的，并且如果所述颗粒具有疏水表面，则更令人吃惊。

在这种背景中，其它困难包括产生在产生、储存和运输以及使用期间保持物理和化学稳定的产物。对于所述试剂，不导致支气管收缩也是重要的。导致子宫收缩的肽（如缩宫素）可以与肺系统中存在的受体相互作用并因此导致支气管收缩。对于所述试剂，在肺中不被代谢也是重要的。如果可以满足这些多个和非常显著的困难，则肺递送可以提供独特的优势，包括避免针的使用，避免通过口服途径的首过代谢以及粉末制剂所提供的额外的稳定性。

喷雾干燥已经在如食品、清洁剂和工业化学品的领域中广泛用于生产粉末产品多年。在多种情况下，产生了相对大的和自由流动的颗粒。在较小程度上，该技术已适应于产生精细和超细颗粒，并且无机材料行业，如工业陶瓷生产商（T.T.Kodas,Adv.Mater.,1989,6,180）领导了这种革新。通常从复杂溶液产生液滴以形成气溶胶，然后将这些液滴作为分离的单元干燥成颗粒的这种方法已被认可为提高了对颗粒形态、化学计量、纯度、尺寸以及结构的控制。可以将优势看作为颗粒工程的“自顶而下（top-down）”和“自底而上（bottom-up）”法之间的结合。然而，制药工业仅在相对近期才认识到这种方法工程制备精细颗粒的优势（R.Vehrig,Pharm Res.,2008,25(5),999），并且最近喷雾干燥的材料已在可商购的干粉吸入器系统中出现。该领域中大部分注意力都集中在形状、密度和褶皱对雾化的影响。

然而，将药物分子递送到呼吸道并且甚至是递送到下肺以提供治疗效果是困难的，特别是在施用温度下为固体的药物。在这方面，尽管干粉提供了有吸引力的药物递送方式，但是产生适合于高效雾化的微粒化颗粒仍是非常重大的技术挑战。

在吸入时，较大的雾化药物颗粒往往会通过挤压和重力沉降沉积在咽喉后部和上呼吸道，在此它们容易受到粘膜纤毛清除至胃肠道并随后被代谢。另外，由于细支气管的狭窄，较大的药物颗粒不能进入深至下肺。据信对于有效的局部气溶胶输送和递送至呼吸系统（包括气管、支气管和肺泡），空气动力学直径小于5μm的颗粒是优选的，而对于深肺部、细支气管和肺泡，小于3μm的颗粒是优选的——特别是对于全身吸收。

尽管吸入递送是所期望的方式，但是该方式的显著技术障碍仍是以实践和经济有效的形式工程制备适合于高效递送（例如，>50%剂量递送至治疗位点）、可重复递送（例如，具有<10%的剂量递送变异系数（CV%））和高有效负荷（例如，>1mg粉末递送至治疗位点）的气溶胶的实践性，所述形式包括装置和制剂。干粉递送提供了有吸引力的递送形式。然而，产生适合于高效雾化的微粒化颗粒仍是非常巨大的技术挑战。除了上述问题，任何实际的干粉吸入递送系统将需要避免或最大程度减少吸入时颗粒的结块，需要具有较低的由于流动性差或不一致结块所造成的递送剂量变化，和需要避免或最大程度减少由于粉末粘结至装置壁所造成的粉末从递送装置的移除不完全。

近年来，已提出了通常通过喷雾干燥形成的用于生物分子吸入的新一代“智能”粉末制剂。在多种情况下，这些制剂是通过经验设计的，并且包含已提出分别在固相中提供一种或多种功能性作用的赋形剂的混合物。在该背景中使用的那些赋形剂中的一种是氨基酸L-亮氨酸。Staniforth和Ganderton等人首先证明了通过加入L-亮氨酸，或者通过共研磨或通过凝聚/沉淀中的任一种所提供的可能的有利性质（参见，例如，WO96/23485和WO00/33811）。该工作表明这种氨基酸特殊的物理性质提供了其性能提高的表现。自此，几个研究小组已经研究了L-亮氨酸向粉末雾化所提供的益处，特别是当与活性剂和赋形剂共喷雾时，然而，这些系统中结构-性能关系的真实性质仍不清楚。更广泛地，还出现了在喷雾干燥的颗粒结构中某些肽/蛋白质（例如，白蛋白、异亮氨酸或三亮氨酸）也可以在使用时给予改善的雾化性能。作为另外一种选择，在这方面脂肪和脂肪酸材料也可以提供一些益处，如磷脂（例如，DPPC）、卵磷脂或脂肪酸盐（例如，硬脂酸钠或镁）。

现在，已惊奇地发现L-亮氨酸可用于在通过喷雾干燥制备用于吸入的干粉的工艺中提供益处，并且可以导致在不存在L-亮氨酸的情况下将完全不会形成适合的颗粒或者颗粒将会立即聚结或不可逆成块的环境中形成适合的干粉。

因此，在第一个方面，本发明提供了制备用于吸入的干粉的方法，其包括：

制备水溶液和/或悬浮液，所述水溶液和/或悬浮液包含生物活性蛋白或肽、一种或多种能够形成无定形玻璃基质的单糖、二糖或多糖和/或氨基酸、和L-亮氨酸；以及

将水溶液或悬浮液喷雾干燥以产生适合于吸入的干粉。

不希望受理论限制，据信L-亮氨酸可能由于其疏水性而在所形成的颗粒表面浓缩，以这样的方式使颗粒稳定并抑制了结块。还发现这样形成的颗粒受保护不被降解，降低了玻璃化转变温度和从大气或其它湿气的重结晶，从而使它们与当前的干粉制剂相同程度地不需要使用不含水的包装环境。这还使得本发明的干粉能够在发展中国家的偏远和环境要求区域中使用。在Exubera吸入式胰岛素产品不能成功上市后，已充分认识并广泛报道了制备含有适合于吸入的生物大分子的粉末的困难。尽管在开发Exubera产品时解决了一些技术困难，但是它必需提供非常复杂、昂贵且不实用的吸入器装置，另外粉末对湿度高度敏感，从而必需在极低湿度的环境中处理。多种其它因素促进了它的失败，其包括生物利用率和它在肺中去向的不确定性。该产品的失败已强调了在开发本文所提出问题的解决方法中的极端复杂性。

如本文所使用的，术语“无定形玻璃基质”是指其中分散了生物活性蛋白或肽的基质，它基本上是非结晶的或者不具有大量的结晶区域或规则重复结构分子序态区域。

溶液/分散体可以包括其它组分，所述组分包括其它氨基酸、白蛋白和氨基酸衍生物，如三亮氨酸，它们还可以帮助形成和稳定干粉制剂。基于制剂的最终使用，可以掺入其它药物，包括非肽药物。生物活性蛋白或肽、其它药物或其它组分可以处于溶液或悬浮液中，并且还可以包括其它赋形剂，如稳定剂、表面活性剂等。

因此，如本文所使用的，提及“溶液和/或悬浮液”或者“溶液/悬浮液”是指水和其它组分的混合物，其中一些组分可以是溶解的（即在溶液中）并且一些组分可以处于悬浮液中，或者处于纳米悬浮液、乳化液或微乳化液的形式。在一些实施方式中，水溶液可以包括其它共溶剂。

在一些实施方式中，水性液体可以包括其它共溶剂。将理解术语“水性”是指至少部分由水构成但是可以包括其它水可混溶液体的液体，所述水可混溶液体如醇（例如，乙醇、异丙醇）。根据本发明的方法，在任何情况下，技术人员将认识到水溶液必须适合于喷雾干燥。

基于掺入到制剂中的生物活性肽或蛋白，本发明的干粉制剂可以用于疾病或病况的治疗或预防。当生物活性肽或蛋白是抗原时，干粉制剂可以用作疫苗。

生物活性剂可以是任何蛋白质或肽或它们的组合。本发明特别适合于肽、缩宫素、其衍生物（包括类似物和激动剂）以及其它类似试剂（如加压素和去氨加压素）的制剂。含有缩宫素和/或其衍生物的制剂可以在产后出血（PPH）的治疗或预防中使用。在这些情况下，制剂还可以包含适合于治疗或预防PPH的其它组分，如麦角新碱和相关药物。含有缩宫素和/或其衍生物的制剂还可以在治疗焦虑和孤独症以及引起行为矫正中有用。例如，精神病学疾病或病况，包括孤独症、精神分裂症、焦虑、紧张和抑郁，包括产后抑郁；癌症，包括乳腺癌、卵巢癌和子宫内膜癌，作为涉及信任、联系以及治疗性功能障碍的生活方式药物，在疼痛（如慢性头痛）的治疗中，在泌乳和在生育力，雄性或雌性的治疗中。

在最终喷雾干燥粉末中用于形成无定形玻璃基质的组分可以是任何适合的单糖、二糖或多糖和/或氨基酸。例如，该组分可以包含D-甘露醇和甘氨酸。这些组分一般将溶解在水性溶液/悬浮液的水中。

在另一个实施方式中，该组分可以包括海藻糖或菊粉。本领域技术人员将熟知适合于该目的的糖类和/或氨基酸。例如，糖醇可以包括木糖醇和山梨糖醇。例如，单糖可以包括（但不限于）葡萄糖（glucose）（右旋糖（dextrose））、果糖（fructose）（左旋糖（levulose））、半乳糖、木糖和核糖，并且可以包括立体异构体的任意组合。例如，二糖可以包括（但不限于）乳糖、蔗糖、海藻糖、麦芽糖。作为另外一种选择，它可以包括三糖如蜜三糖，四糖如水苏四糖，和五糖如毛蕊花糖。

任选地含有一种或多种其它生理学活性剂的微粒化颗粒还可以包含一种或多种药物可用的载体、稀释剂或赋形剂。其它赋形剂可以包括（但不限于）膨胀剂、缓冲剂和稳定剂如柠檬酸钠、吸收促进剂、蛋白酶和肽酶抑制剂、味道或气味调节剂、粘结改性剂、流动活性剂、溶解改性剂或粘液溶解剂。

另外可以通过与任何已知的载体颗粒或其它添加剂赋形剂（如风味、气味或感官感觉调节剂）合并来配置粉末。还可以通过将粉末造粒成粉末流动性改善的柔软小粒并相应地适当选择干粉吸入器来实现一些改善。

通常，干粉制剂颗粒的质量中值空气动力学直径小于10微米，更优选地小于5μm并且最优选地小于3μm。优选地，L-亮氨酸将占制剂干燥组分的5至50wt%。更优选地，L-亮氨酸将占制剂干燥组分的10至40wt%。

如本文所使用的，术语“空气动力学直径”（D_ae）定义为与所讨论的真实颗粒具有相同终端沉降速度的单位密度的当量体积球体的直径。药物粉末的肺沉积一般用颗粒的空气动力学性能表示。受重力影响的颗粒将以特定速度沉降至地面。在空气动力学直径中，认为速度是可以测量的，并且考虑了颗粒的单位密度（ρ₀）、颗粒密度（ρ_p）、当量球体的单位密度（D_eq）、动态形状因子（X）。对于大于约1μm的颗粒，以下方程适用于关联空气动力学直径和单位密度的当量体积球体。

术语“质量中值空气动力学直径”（“MMAD”）是根据空气动力学直径分级的颗粒尺寸分布的统计表示，在本文中定义为基于质量表示的中值空气动力学直径，并且是气溶胶科学家所使用的广泛接受的参数。可以通过如美国药典所定义的药典冲击器法，通过使用安得生级联碰撞计，或通过下一代冲击器（NGI）来测量质量中值空气动力学直径（MMAD）。在这方面，为了使干粉是高度可雾化的，颗粒的质量中值空气动力学直径一般将小于10μm，但是优选地小于6μm，优选地小于5μm，更优选地小于3.5μm或最优选地小于2μm。

喷射剂量（ED）是动作后从装置中发出的活性剂的总质量。它不包括留在装置内或外表面上的材料，或留在计量系统（包括，例如，胶囊或泡囊）中的材料。通过采集从装置发出的总质量来测量ED。它可以在经常被称为剂量一致性取样装置（dose uniformitysampling apparatus，DUSA）的装置中，并通过已验证的定量湿法化学测定（重量法是可能的，但是精度较低）回收来进行。作为另外一种选择，当使用冲击器或碰撞取样器时，则通过将在各个冲击器或碰撞取样器系统的所有阶段收集的剂量合并来测量ED。

细粒剂量（FPD）是在动作后从装置发出的以小于规定限度的空气动力学粒径存在的活性剂的总质量。如果未明确说明采用替代限制，如3μm、2μm或1μm等，则该限制一般采取5μm。使用冲击器或碰撞取样器，如两级碰撞取样器（TSI）、多级碰撞取样器（MSI）、安得生级联碰撞计（ACI）或下一代冲击器（NGI）测量FPD。当使用TSI时，FPD一般采取6.4μm，这是因为该碰撞取样器仅具有一个估计为该值的截断点（cut point）。每个冲击器或碰撞取样器对每级均具有预先确定的空气动力学粒径采集截断点。然后，通过逐级整理活性剂回收数据获得了FPD值，所述回收数据是通过已验证的定量湿法化学测定（重量法是可能的，但是精度较低）定量的，其中使用简单的级截断来确定FPD或使用了逐级沉积的更复杂的数学内插法。

细粒分数（FPF）通常定义为FPD除以ED并表示为百分比。在本文中，ED的FPF表示为FPF（ED）并根据FPF（ED）=（FPD/ED）×100%来计算。

细粒分数（FPF）还可以定义为FPD除以MD并表示为百分比。

可以使用本领域技术人员熟知的喷雾干燥设备进行喷雾干燥。现已发现在喷雾干燥溶液中使用L-亮氨酸使得能够在比喷雾干燥一般所需温度低的温度下实现喷雾干燥。由于喷雾干燥过程中使用的温度可以导致活性剂分解，因此，这是本发明特别的优势。例如，本发明的溶液/悬浮液的喷雾干燥可以在低于80℃，优选地低于60℃，更优选地低于40℃，并且最优选地低于30℃或者在环境温度下实现。基于喷雾干燥器的构造，这些温度可以表示干燥器的入口温度或出口温度，但是优选地将表示干燥液滴所经历的温度，由于蒸发冷却作用，这通常是系统的出口温度。

通过本发明制备的干粉是新型的并且表现了本发明的其它方面。根据这方面，提供了干粉制剂，其包含：

生物活性蛋白质或肽，

无定形玻璃基质，其包含一种或多种单糖、二糖或多糖和/或氨基酸，以及

L-亮氨酸。

在优选的实施方式中，无定形玻璃基质包含D-甘露醇和甘氨酸、海藻糖和/或菊粉。作为另外一种选择，它可以包含聚合物，如葡聚糖、或PVA或PVP、或任何已知的玻璃形成材料，如在冷冻干燥冻干中已知的那些。

干粉制剂的颗粒将具有位于表面上的至少部分的L-亮氨酸。在优选的实施方式中，表面将包含通过L-亮氨酸的至少50%的覆盖度，更优选地多于75%并且最优选地多于90%的覆盖度。可以直接使用如ToFSIMS（飞行时间二级离子质谱）或XPS（X射线光电子光谱）的技术测量在表面上存在的L-亮氨酸的评价。作为另外一种选择，可以通过反相气相色谱法评价。优选的评价方法是以下所列出的通过粉末内聚力（cohesion）测量的间接方法。

如上所述，据信表面上L-亮氨酸的浓度起作用以保护干燥颗粒不会发生结块和湿度进入。

可以使用本领域中已知的设备和技术施用本发明的干粉。在这点上，出于使患者能够吸入干粉的目的在本领域中描述了多种吸入装置，并且该设备可以用于本发明干粉的施用。

干粉吸入器装置（DPI）在本领域中是熟知的并且有多种不同类型。一般地，干粉储存在装置内并且当活动（使用，actuation）时则从装置的储存处提取，于是粉末以一股粉末的形式从装置中喷出并被受试者吸入。在大多数DPI中，粉末以单元方式储存在（例如）含有预先确定量的干粉制剂的泡囊或胶囊中。

一些DPI具有粉末贮器并且在装置内测量出粉末的剂量。在治疗可能是单独治疗中的一个或少量剂量时，这些贮器装置可能是不太有利的。

干粉吸入器可以是被动的或主动的。被动吸入器是其中使用通过患者吸气吸入通过装置的气流使粉末雾化的那些吸入器，而主动装置是其中通过独立的能量来源使粉末雾化的那些吸入器，所述能量来源可以是（例如）压缩气体源，如Nektar Exubera装置或Vectura Aspirar装置，或者是机械能形式，如振动（如微剂量装置）或挤压。

适合在本发明中使用的干粉吸入器装置包括“单一剂量”装置，例如，Rotahaler（商标）、Spinhaler（商标）和Diskhaler（商标），其中以，例如，单一剂量的胶囊或泡囊将单个剂量的粉末组合物引入到装置中。装置可以作为具有（例如）在泡囊带中的粉末的预计量装置出现（如GS Diskus装置），其中预计量形式包括多个剂量或其中患者插入预计量的外部剂量形式，如含有药物的胶囊（例如，Boehringer Ingelheim Handihaler或MiatMonodose）。

作为另外一种选择，装置可以是贮器装置，其中在患者手握期间在装置内从粉末贮器中计量粉末剂量（例如，Astra Turbuhaler）。可以使用任何这些吸入器装置类型。

装置可以优选地是单一用途装置，或者是设计用于少量剂量的装置，并且可以是一次性的。例如，Twincer装置、Direct Haler装置、TwinCaps装置或Puff-haler。这些装置的优势是它们的简单性，组件数目少并且成本低。优选地，具有少于10个独立组分的装置是优选的。更优选地，5个或更少，最优选地，3个或更少。

多种因素与递送装置有关，它们将影响所实现的剂量施用效力。首先，提取剂量。另外，所产生的粉末羽流的动态也将影响剂量递送。优选地，装置将允许高喷射剂量和高效解聚集。高效解聚集通常与动作时高水平的粉末压实有关。装置可以具有低、中或高气流阻力。

应理解本发明的组合物可以通过被动或主动吸入器装置施用。

当与肺粘膜接触并随后释放和吸收蛋白质或肽时，使用可吸入干粉制剂在肺途径中递送生物活性蛋白质和肽需要使颗粒溶解。尽管认为L-亮氨酸为喷雾干燥的颗粒提供了足以提供改善的稳定性和货架期的疏水性涂层形式，但是具体地，在温暖且潮湿的环境中，已意外地发现这不会干扰粉末释放用于在肺部吸收的蛋白质和肽的能力。先前，已表明用疏水性赋形剂涂覆颗粒可以将溶解延缓显著的一段时间，如在WO01/76575中所述。事实上，对于包含氧化毒素（oxytoxin）的喷雾干燥制剂，已发现氧化毒素的吸收和作用发生时间是特别快的，并且比当前用于在分娩期间施用氧化毒素的方法和制剂要明显更快。因此，已意外地发现通过吸入将氧化毒素递送至肺提供了比现有施用途径显著的优势。

因此，在本发明的其它方面，提供了用于吸入的干粉，其包含氧化毒素和/或其衍生物，和肺可接受的载体，如用于氧化毒素的无定形玻璃基质，其中吸入时大于40%，优选地大于50%，更优选地大于60%并且最优选地大于65%的干粉颗粒的空气动力学直径小于5μm，更优选地小于3μm。优选地，所产生的气溶胶云的质量中值空气动力学直径（MMAD）小于5μm，更优选地小于3μm，更优选地小于2.5μm，并且最优选地小于2μm。

根据本发明的这个方面的干粉制剂特别适用于在产后出血（PPH）的治疗或预防中使用。本发明还提供了缩宫素和/或缩宫素衍生物在生产用于PPH治疗或预防的吸入干粉中的使用。本发明还提供了用于PPH的治疗或预防的方法，其包括通过吸入向对其有需要的受试者施用有效量的包含缩宫素或缩宫素衍生物的干粉。优选地，干粉制剂处于如上所述的形式。

在本发明这方面的优选实施方式中，无定形玻璃基质包含一种或多种单糖、二糖或多糖和/或氨基酸，并且最优选地所述基质将包含L-亮氨酸，优选地以如上所述的量和比例包含。然而，在其它实施方式中，所述无定形玻璃基质包含适合于肺递送的惰性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮或聚乙烯醇或聚乙二醇聚合物或者丙二醇或共聚物。由这些聚合物组成的基质还可以包含组分（如亮氨酸、异亮氨酸或三亮氨酸）以改善颗粒的稳定性并确保它们具有适当的空气动力学直径。

根据该实施方式，干粉还可以包含一种或多种其它生理学活性剂，并且还包含一种或多种药物可用的并且肺可接受的组分，如先前所述的那些。在优选的实施方式中，肺可接受的载体包括柠檬酸钠，或缩宫素组分的稳定剂。

根据本发明该方面的微粒化颗粒通常是在技术人员可以确定的适合条件下通过如上所述的喷雾干燥制备的。术语“喷雾干燥”旨在涵盖其中在液体中形成一种或多种溶质的溶液或者悬浮液的任何方法，从而所述液体物理地雾化到单个液滴中，然后干燥以形成干燥颗粒粉末。它可以涵盖任何形式的液滴转化为颗粒的形成方法，并且可以涵盖相关方法，如喷雾冷冻干燥、喷雾激冷和喷雾闪速干燥。可以通过任何已知的雾化法形成液滴，所述雾化法包括（但不限于）压力雾化、流体雾化、两个或多个流体雾化、转盘雾化、电流体雾化、超声波雾化和这些雾化方法的任何改变形式。雾化可以从一个喷雾源或多个源发生。液体载体喷雾可以或可以不是水性的并且可以任选地包含共溶剂和溶解或悬浮的其它组合。所述液体可以包括在环境条件下是气体或固体但是在所选的工艺条件下作为液体存在的材料。可以通过应用加热干燥气体形式的热来干燥所形成的液滴，或者可以以其它方式应用热，例如，从干燥室的壁通过辐射应用或作为微波应用。当从该干燥过程中收集时，则所述颗粒还可以通过如真空干燥或冷冻干燥的工艺进一步干燥或调节至控制的湿度水平。作为另外一种选择，可以通过冷冻，然后干燥或施加真空来实现干燥。

将认识到在本文中还考虑了获得这些颗粒的任何其它方式，例如，超临界流体合成，从乳化液合成和形成基本上球形颗粒的任何其它形式的控制沉淀。作为另外一种选择，可以使用任何形式的粉碎、磨碎、碾磨和共碾磨来获得适合尺寸的颗粒。

可以获得颗粒并工程设计成任何已知的颗粒工程系统，如（但不限于）：Nektar开发的Pulmosphere^TM或Pulmosol^TM技术、Alkermes开发的AIR^TM多孔颗粒技术、Mannkind开发的Technosphere^TM技术、Vectura开发的Powderhale^TM技术、通过Prosonix超声结晶法产生的颗粒、通过（例如）Elan、Hovione或Savara开发的湿法或干法纳米磨碾技术产生的颗粒。

用于吸入的干粉微粒化颗粒具有适用于雾化和吸入的尺寸，其物理尺寸小于15μm，如小于10μm，或小于6μm，或小于5μm，或小于3μm或小于2μm。根据该实施方式的颗粒将具有小于10μm的质量中值空气动力学直径，但是优选地小于5μm，或小于3μm。

通常，除以上所讨论的相当的尺寸之外，按体积计90%的颗粒可以具有小于10μm，小于8μm，或小于6μm或小于5μm或小于3μm的空气动力学直径。可以通过如美国药典所定义的药典冲击器法，通过使用安得生级联碰撞计，或通过下一代冲击器（NGI）来测量质量中值空气动力学直径。根据该实施方式的颗粒可以具有小于5μm或小于3μm的质量中值直径，所述直径可以如使用Malvern Mastersizer2000型仪器通过激光散射法测量。

为了在雾化中获得高效率，颗粒显示出低内聚力水平也是有利的。通常，可以使用粉末剪切槽试验测量内聚力，如Freeman FT4粉末流变仪的剪切槽。有利地，粉末将显示出小于2的平均内聚力值，更优选地小于1.5并且最优选地小于1。

在其它实施方式中，缩宫素和/或其衍生物的呼吸递送还可以包括经鼻递送。经鼻递送包括通过鼻吸气，但是其中粉末主要收集在鼻腔和鼻甲，并且其中还发生了进入体循环的吸收。由于提供了向体循环的无创递送途径，因此经鼻吸入类似于肺施用。经鼻递送避免了针并且允许从单一装置中重复施用。

可以容易地计算剂量范围并且施用不用担心液体体积（非体积依赖的）。用于粉末经鼻递送的递送装置可以不同于经肺递送所需的那些。实例包括来自Optinose的装置、ViaNase（Kurve）、Direct-Haler、Monopowder（Valois）或来自Bespack的鼻粉末系统。用于经鼻递送的质量中值粒度优选地大于5μm，并且更优选地大于10μm，这是因为这减少了通过鼻腔的材料并且使其在鼻甲中的沉积最大。鼻制剂将包括鼻可用的载体并且可以包括另外的赋形剂，如生物粘结聚合物和渗透增强剂，例如，壳聚糖、HPMC或聚羧乙烯。特别优选的实施方式是可以将缩宫素或者其类似物或衍生物中的一种以大于10μm的质量中值粒度作为包含玻璃基质的配制粉末通过鼻递送以用于治疗PPH，或其它相关的母亲病况，如产后抑郁，并且优选地具有快速发生的作用。制备用于经肺递送的干粉还可以通过鼻部通道吸入到肺系统中，例如，当患者难以通过口腔吸入粉末时，尽管这不是这类粉末优选的递送形式。

由于缩宫素快速发生作用、副作用谱最小以及缺乏禁忌症，因此根据世界卫生组织，缩宫素是在分娩第三期的积极控制中使用的首选子宫收缩剂。根据皇家妇女医院（Royal Women's Hospital,Melbourne,Aus）的临床实践方针，预防性缩宫素应施用于前肩娩出妇女，或者在婴儿娩出后1至2分钟内施用。施用时机在预防子宫弛缓中是重要的，并且明显的益处是在这种分娩后提供具有最快速作用发生的递送形式以降低正在发生的失血的风险。

除了PPH的预防之外，缩宫素以30-40IU的剂量通过静脉内输注用于PPH的治疗。在良好控制的临床环境中，低剂量缩宫素（0.5-1mU/mL IV输注）表明子宫收缩的开始或改善，其中这是所期望的并且出于对胎儿或母亲考虑的原因认为是适合的以实现阴道分娩。

最近，科学和医学文献已报道了低内源缩宫素水平和产后抑郁之间的联系，并且开发在指定的该区域中或周围用于全身递送的实际、经济合算并且无创形式的缩宫素或其治疗有效性衍生物可能是具有优势的。

在发展中国家，缩宫素肠胃外施用的用法面临多种障碍，其包括需要冷链储存以防止化学降解，需要受过培训的医务人员进行IV或IM注射施用，重复使用注射器的可能以降低成本（这提高了血液传播病毒传播的可能性），和普遍缺乏获得用于PPH的预防和/或治疗的高质量缩宫素产品的途径。为了提高获得缩宫素的途径，在一些国家培训了熟练的接生人员以施用IM注射的缩宫素，然而，有多个有关用于催产的肠胃外产品不当使用的报道。吸入式缩宫素制剂将克服与肠胃外制剂有关的多种限制。单一单位剂量形式系统将消除在催产中使用的可能性，这是因为它将不可能递送所需的低剂量。考虑到没有液体或气体载体并且缺少体积依赖性，以可吸入干粉形成提供缩宫素还提供了更灵活的剂量施用。它还避免了对针的需要，最大程度降低了污染风险，并且允许从单一装置重复施用的灵活性。

通过本发明的干粉制剂实现的作用快速发生提供了在PPH治疗期间快速滴定剂量的能力，其中通常的治疗剂量在30-40IU之间。助产士/接生人员通常将感受子宫以评价收缩幅度足以控制PPH的时机。快速吸收和作用发生（如在绵羊模型中所表明的）表明对于多次吸入的剂量，将有可能施用以实现有效子宫收缩所需的必要血浆水平。缩宫素的宽治疗指数对吸入疗法也是有益的，这是因为递送效力或吸收的差异不会在患者中导致严重的副作用。

根据本发明，包含缩宫素和/或缩宫素衍生物的干粉吸入到肺系统中之后，可以在吸入200秒，优选地在吸入150秒，更优选地在吸入100秒并且最优选地在吸入60秒内实现如通过子宫收缩所测量的作用发生。优选地，与缩宫素和/或缩宫素衍生物的溶液的I.M.注射后的作用发生相比，根据本发明的干粉制剂的肺施用和子宫收缩发生之间的时间小于80%，优选地小于60%并且最优选地小于40%的I.M.注射和子宫收缩发生之间的时间。

根据本发明，可以配制广泛的肽和蛋白质。本发明特别适合于施用缩宫素或衍生物，和类似的肽，如加压素和去氨加压素。缩宫素衍生物的实例包括去氨缩宫素，Endocrinologica Experimentalis Vol14,p151,1980中所述的那些，和缩宫素的激动剂，如具有与缩宫素类似用途的卡贝缩官素，其针对产后出血的控制。其它缩宫素衍生物包括去氨基-1-单甲酸-(2-O-甲基酪氨酸)-缩宫素、syntometrine和阿托西班[d(CUMOT)]。然而，本发明还可以用于提供其它蛋白质的干粉制剂，所述蛋白质包括胰岛素和疫苗，如流行性感冒疫苗。就疫苗来说，所述制剂还可能需要其它免疫刺激组分。可以根据本发明配制并通过肺途径递送的蛋白质和肽的实例包括细胞因子、激素、凝血因子、疫苗和单克隆抗体。

以下是可以在根据本发明的组合物和方法中用作活性剂的蛋白质的列表。降钙素、促红细胞生成素（EPO）、因子IX、粒细胞集落刺激因子（G-CSF）、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、生长激素、I型胰岛素、干扰素α、干扰素β、干扰素γ、白介素-2、促黄体素释放激素（LHRH）、生长抑素类似物、加压素类似物、促卵泡激素（FSH）、糊精、睫状神经营养因子、生长激素释放因子（GRF）、胰岛素样生长因子、胰岛素调理素、白介素-1受体拮抗剂、白介素-3、白介素-4、白介素-6、巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）、神经生长因子、甲状旁腺激素、生长抑素类似物、胸腺素α1、IIb/IIIa抑制剂、α-抗胰蛋白酶、松弛素、抗RSV抗体、囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）、脱氧核糖核酸酶（DNase）、杀菌/渗透性增强蛋白（BPI）、抗CMV抗体和白介素-1受体。

本发明现将参考一些具体的实施例和附图进行说明。然而，应理解下列说明的特殊性不代替如上所述的本发明的一般性。

关于附图：

图1是用于喷雾干燥的装置的示意图。

图2是用于测量干粉体外气溶胶沉积的Twin Stage碰撞取样器的示意图。

图3提供了未加工的海藻糖Trehalose（raw）和在特定条件下喷雾干燥后的喷雾干燥的海藻糖（SD）的X射线衍射图。

图4提供了在特定条件下喷雾干燥后的喷雾干燥的海藻糖和与10%和20%（w/w）的亮氨酸喷雾干燥的海藻糖的X射线衍射图。

图5是在特定条件下喷雾干燥后的海藻糖的扫描电子显微镜图像。

图6提供了在特定条件下喷雾干燥后的海藻糖与亮氨酸10%w/w（左侧）和20%w/w（右侧）的扫描电子显微镜图像。

图7是显示缩宫素吸入后子宫收缩的EMG迹线。箭头表示施用和收缩之间的延迟。初始爆发用虚线圈出。黑线表示三十分钟的缩宫素诱导的活动的随机样本。短划线表示在回到基线之前缩宫素诱导的子宫活动所持续的总时间。

图8是在即刻产后期期间和肺内（IP）和肌内（IM）缩宫素递送后提供子宫EMG行为分析的一系列图，（a）缩宫素施用和EMG响应之间的延迟；（b）第一次EMG爆发的长度；（c）第一个30分钟内EMG爆发的次数；（d）EMG活动的总持续时间。数据表示为平均值±SEM。P>0.05RM ANOVA；n=5。绿色条代表产后即刻的子宫活动，蓝色条代表干粉递送后的子宫活动，红色条代表肌内施用后的子宫活动。

图9显示粉末递送之前（a）和之后（b）绵羊气管的支气管镜视频图像。

图10显示了反相气相色谱法中有限稀释的非极性表面能分布。

图11显示了反相气相色谱法中有限稀释的极性表面能分布。

图12显示了反相气相色谱法中有限稀释的总表面能分布。

图13显示了反相气相色谱法中以有限稀释确定的内聚功表面能分布。

图14显示了反相气相色谱法中无限稀释的表面能。

图15a是显示在通过含有相等量的甘露糖醇、甘氨酸和亮氨酸的实施例10制剂1递送的缩宫素吸入后子宫收缩的EMG迹线。短划线显示了制剂递送的时间，实线显示了子宫收缩的发生。x轴以hh:mm:ss表示，y轴以mV表示。

图15b是显示在通过含有90%海藻糖和10%亮氨酸的实施例10制剂2递送的缩宫素吸入后子宫收缩的EMG迹线。短划线显示了制剂递送的时间，实线显示了子宫收缩的发生。x轴以hh:mm:ss表示，y轴以mV表示。

图16a是显示在通过含有90%PVP（30）和10%亮氨酸的实施例10制剂3递送的缩宫素吸入后子宫收缩的EMG迹线。短划线显示了制剂递送的时间，实线显示了子宫收缩的发生。x轴以hh:mm:ss表示，y轴以mV表示。

图16b是在缩宫素肌内递送（实施例10制剂4）后显示子宫收缩的EMG迹线。短划线显示了制剂递送的时间，实线显示了子宫收缩的发生。x轴以hh:mm:ss表示，y轴以mV表示。

实施例

实施例1

喷雾干燥

喷雾干燥是包括从所需溶解材料的起始溶液中形成粉末的一步方法。根据定义，它是通过将液体进料喷雾到热干燥介质中将来自流态的进料向干燥形式的转化。喷雾干燥法中的四个重要阶段是：（i）进料通过喷嘴雾化，（ii）液滴和干燥气体之间的喷雾-空气接触，（iii）通过液体蒸发的颗粒干燥，和（iv）最终粉末的收集。

参考图1中的示意图，在测量入口温度3之前，将空气带入到系统1中并通过供给的加热器2加热。将液体进料单独抽入喷嘴4中，在此形成液滴并分散到干燥室5中与热空气混合。此时，形成干燥颗粒。当颗粒移动到粉末与空气分离的旋风分离器7中时，测量出口温度6。粉末截留在收集器8中以进行回收，而在袋式过滤器9中，空气与可能仍保留在气流中的所有微粒过滤分开。通过抽风机10的工作，空气在喷雾干燥中继续循环。

雾化是限定液滴，以及由此的后续粒径和分布中的非常重要的部分。它包括当进料泵出通过喷嘴中的小孔时，从整个液体形成的液滴喷雾。就二流喷嘴来说，所供给的气体以高速挤压喷嘴中的液体。这种高速气体相对于液体表面产生了高摩擦力，从而导致液体破碎并形成喷雾液滴，并喷入干燥室中。

溶解材料的性质和干燥条件将影响最终的粉末特征。随着液体溶剂从液滴表面（在这种情况下是水）的蒸发，发生溶质沉淀。经常，当形成颗粒时，外壳可以形成并且外壳可以是多孔的、半多孔的或者无孔的，从而允许湿气以不同速率除去并具有不同的效果。因此，可以形成不同形态的颗粒。因此，干燥条件的控制是重要因素。

根据所进行的实验，粉末制剂及其喷雾干燥参数是不同的。在所有粉末制剂中，甘露糖醇用作基线材料，并加入不同的氨基酸。在整个过程中保持恒定的喷雾干燥参数是抽风机设定，其设置为完全流量，和雾化器空气流量（800L/小时）。

对于每种制剂，以固定量的甘露糖醇、甘氨酸和缩宫素和不同量的亮氨酸喷雾干燥。喷雾干燥条件是固定的，出口温度设定在70℃。

所使用的参数如下表1中所示。所示氨基酸的百分比计算为仅是甘露糖醇量的百分比，而不是整个粉末含量的百分比。所示缩宫素的百分比是整个粉末含量的百分比。

表1

称量出粉末并溶解在适量的Milli-Q水中以实现所需的进料浓度。然后，使用Buchi190微型喷雾干燥器（Buchi,Switzerland）将溶液喷雾干燥以产生干粉。

实施例2

体外气溶胶沉积

使用Twin Stage碰撞取样器（TSI）（Copley Scientific Ltd., Nottingham,UK）测量粉末的体外气溶胶沉积。根据英国药典2011，实施TSI方法和装置，如图2中所示。在TSI的组装期间，在玻璃制品部分D和部分H中分别加入7mL和30mL水。

TSI是呼吸道的简单模型；其中上（阶段1）和下（阶段2）室分别代表上和下气道。第一阶段的切断空气动力学直径是6.4μm。理想地，应将大于6.4μm的颗粒收集在所述7mL液体中；未收集的较小的颗粒（<6.4μm）将继续至含有30mL液体的下阶段。由于过量的液体，大部分颗粒将在所述下阶段中收集，然而，如果粒径对于所述下阶段中的收集来说过小，则它们将在出口处放出。

每个粉末样品的测量在四次重复实验中进行。对于每个重复实验，在5个3号HPMC胶囊中手动填充20.4±0.24mg的样品粉末并将其放置在5个Monodose吸入器（Miat,Italy）中。将真空泵连接到部分F，并将空气流量校准至60L/min并设置为5秒。在装置中刺穿胶囊，并放置在准备好通过真空泵激活的接头（部分A）上。当将泵打开时，从吸入装置将粉末携带到TSI装置中。

将所有5个胶囊激活至相同的TSI中。然后，将所使用的胶囊和吸入器用Milli-Q水清洗至100mL容量瓶中并补偿体积。这称为“剩余”阶段。用Milli-Q水将构成阶段1（部分A、B、C和D）的部分清洗到200mL容量瓶中并且将构成阶段2的部分（部分E、F、G和H）清洗到50mL容量瓶中，并且将它们分别称为“阶段1”和“阶段2”。通过LC/MS测定确定TSI每个阶段中缩宫素的量。将细粒部份（FPF）计算为已达到TSI装置阶段2的粉末的量除以测定药物的总量。该测试是最重要的测量，这是因为它可以确定含有缩宫素的粉末是否可以配制成具有适合的气溶胶沉积和后续的肺吸收。

表2

试验编号	细粒分数（%）
		1	57
2	70
		3	67
4	73
		5	64

通过TSI装置下部分（即阶段2）的颗粒被认为是可吸入的，因此细粒部分（FPF）越大，则药物到达肺泡并且被吸收到血流中的机会越大，这在DPI中是理想的。与常规载体制剂粉末的平均FPF相比，如2表中所示的5次试验的FPF较高（～10-20%）。

结果显示FPF可以达到55至75%之间，这意味着实现了非常有效的雾化水平并且递送了制剂中大量的缩宫素作为所需的治疗活性剂量。

缩宫素稳定性

由于极端的热，潜在地，肽可以变性。根据本研究中所进行的测试，与缩宫素稳定性有关的唯一指示是TSI实验后LC/MS的测定含量。当测定了TSI装置的所有阶段、胶囊和吸入装置的缩宫素含量时，回收了平均90.23±5.41%的初始胶囊剂量，这表明缩宫素在喷雾干燥过程或手握过程中使用的温度下不会降解。

实施例3

海藻糖/亮氨酸

海藻糖是具有117℃的高玻璃化转变温度（T_g）的非还原糖，它已在多种研究中用作稳定干固体状况制剂中蛋白质的赋形剂。在该背景下，糖分子一般用作稳定赋形剂，这是因为它们含有能够与所关心的蛋白形成氢键的羧基并因此通过干固体状况中的氢键置换来稳定生物大分子。喷雾干燥已经在生产可吸入干粉制剂的多种研究中成功使用，这是因为该方法能够产生粒度范围适合于经肺递送的微粒。

为了配制用于经肺递送的可吸入蛋白质药物，在70℃的相对低的出口温度下产生了喷雾干燥的海藻糖以最大程度降低热胁迫对有关蛋白的处理稳定性的影响。否则，条件与对甘露糖醇和氨基酸所述的实施例相同。

尽管作为原料海藻糖是相对结晶的，但是在指定的喷雾干燥条件下喷雾干燥的海藻糖似乎是完全无定形的（参见图3）。这种所得的制剂还可以通过提供降低制剂中生物大分子的分子运动的无定形基质来稳定具有玻璃态稳定的所关心的蛋白。

然而，所得的海藻糖制剂仅由具有不可能适合于经肺递送的大粒径的融合的初级结构组成（图5）。从浓度10%w/w开始的亮氨酸在制剂中的掺入显著改善了指定条件下喷雾干燥的制剂的粒径和形态（图6）。由此，亮氨酸的掺入似乎能够阻止高度吸湿的海藻糖的初级颗粒结构在喷雾干燥过程中融合，并因此保留了适合于经肺递送的细粒径范围。另外，通过提供喷雾干燥的海藻糖制剂的内部无定形基质的防潮性，亮氨酸的存在还能够改善长期储存中这些颗粒的性质（图4）。

实施例4

材料

D-甘露醇得自VWR International Ltd.（Poole,BH15,1TD,England）。L-亮氨酸（LEU）、甘氨酸（GLY）和L-丙氨酸（ALA）得自Sigma-Alrich Chemicals（Castle Hill,NSW,Australia）。

喷雾干燥的粉末的制备

在如表1所示的多种组合物中，含有甘露糖醇和所选氨基酸（LEU、GLY、ALA）的水溶液溶解在200ml Milli-Q水中。将少量亚甲基蓝（10mg）引入到每个制剂中以允许通过如下所述的UV-VIS分光光度分析对粉末简单定量。随后，使用下列标准操作条件：空气流量，800L/h；泵设置，5（6.67mL/min）；抽风机设置，20；出口温度，75℃，使用具有0.5mm二流喷嘴的Buchi190微型喷雾干燥器将所制备的制剂喷雾干燥。

粒径分布分析

使用配备有Scirocco槽和Scirocco2000干粉分散单元的MalvernMastersizer2000（Malvern Instruments Ltd,Worcestershire,UK）通过激光-光散射，确定粉末的粒径分布。以3.0至4.0巴的剪切压力将粉末分散在空气中，选择所述剪切压力以实现适合的解聚集。对于每个样品，在三个重复实验中测量平均粒度。使用内装软件，从衍射数据获得每个样品的体积中值直径（D₅₀）。

体外粉末雾化和颗粒沉积

使用具有单剂量吸入器（Miat S.p.A.,Milan,Italy）作为气雾剂分散装置的两级碰撞取样器（TSI，装置，A；British Pharmacopoeia.2000）来评价体外粉末雾化性能和颗粒沉积。使用TPK2000型临界流量控制器和DFM2000型流量计（Copley Scientific Limited,Nottingham.UK），将流速调节至60升/分。将约20mg的每种粉末装填到3号HPMC胶囊（Capsugel.Peapack,NJ,USA）中以用于在空调实验室（20±2℃，50±5%相对湿度）中进行的测试。对于每次测量（n=5），在4秒内从吸入器启动每个胶囊。如下所述，使用UV-VIS光分光光度计确定不同阶段沉积的粉末的量。60升/分时，TSI的截留直径为约6.3μm（Hallworth and Westmoreland.1987）。

在吸入器、阶段1（S₁）和阶段2（S₂）中沉积的粉末总量为回收剂量（RD）。在阶段1和2中沉积的粉末量是喷射剂量（ED），并且将其计算为RD的百分比（方程1）。细粒部份（FPF）定义为阶段2中沉积的RD的百分比（方程2）。

扫描电子显微镜（SEM）

在扫描电子显微镜（Phenom^TM,FEI company,USA）下目视观察了颗粒形态。将粉末样品轻轻地倒在固定在试样夹上的双面碳胶带上以用于在SEM下检查。除去过量的粉末以留下位于胶带表面上的颗粒细层。使用25mA，2.0kV电势，用金通过溅射涂布机（K550X,EMITKCH）溅射涂布样品6分钟。使用内置图像采集软件采集SEM图像。

结果

在表4中列出了使用Mastersizer2000测量的所有制剂的体积中值粒度（D₅₀）。喷雾干燥的甘露糖醇仅产生D₅₀为1.87μm的小颗粒。然而，该粉末完全结晶并且不具有稳定生物分子所需的无定形玻璃结构。

亮氨酸是可用于改善喷雾干燥颗粒雾化的赋形剂，并且亮氨酸还帮助形成适合的小尺寸颗粒。然而，甘氨酸和丙氨酸尽管在结构上类似于亮氨酸，但是它们不能达到类似的效果，因为它们显著提高了制剂的粒径。值得注意的是尽管进料溶液中的初始浓度是已知的粒径决定因素，但是研究设计空间内所使用的固体负载范围似乎对颗粒的几何尺寸不具有强烈影响，如通过激光衍射法所测量的。在本研究中，进料溶液中的总固体负载在2.50%至3.72%的范围内。据提议与制剂赋形剂对内聚力和形状的影响相比，固体负载的这种相对小范围内的粒径变化是可以忽略的。此外，考虑到由混合的氨基酸所产生的颗粒尺寸，有可能的是与单独亮氨酸所实现的相比，这些氨基酸与适当浓度的亮氨酸的组合使用也可以影响粒径。

粉末的可分散性和解聚集

喷雾干燥的甘露糖醇产生了D₅₀为2.83μm的颗粒，其似乎对于可吸入干粉制剂显示出令人满意的可分散性，同时它还产生了最低的喷射剂量（ED）。实验后，粉末在装置中的保留是肉眼明显可见的，并且表明是比本文中其它制剂更具内聚力的粉末。所有组合中氨基酸的存在导致ED改善（表4）。对于补偿其它两种氨基酸对D₅₀的作用以及改善解聚集和ED两者的作用的能力，亮氨酸的有益效果是明显的。

体外雾化和颗粒沉积

将TS1用作对该范围制剂的初始筛选以提供空气动力学雾化信息。

细粒部份（FPF）的结果表明D₅₀小于5μm的含有亮氨酸的制剂显示出大于68%的最高的FPF（表4）。D₅₀大于5μm的含有氨基酸但不含亮氨酸的粉末显示出显著较低的FPF，如通过含有甘氨酸/丙氨酸（30/30%）、丙氨酸（30%）和甘氨酸（30%）的制剂所显示的，其中FPF分别为2.96%、9.11%和34.62%。FPF制剂。尽管单独的甘露糖醇显示出适当的FPF（66.20%），但是该制剂还显示出最低的ED。以15%混合的氨基酸对于改善FPF来说更有效（表4）。这些结果表明包含甘氨酸和丙氨酸以及适当浓度的亮氨酸可以改善制剂雾化性能。

表面形态

观察了单独作为基础材料的喷雾干燥的甘露糖醇形成大量结块的小球形微粒。该结果与来自Mastersizer的粒径分布数据一致。当加入氨基酸时，不考虑甘氨酸和/或丙氨酸的存在，在所有含有亮氨酸的制剂中维持球形颗粒。其它含有甘氨酸和/或丙氨酸而未加入亮氨酸的制剂形成了大得多的不规则形状的颗粒，其表面粗糙。

结果表明亮氨酸的存在通过涂覆干燥颗粒表面而有助于球形颗粒的形成，并且因此提供了在收集时保持各个颗粒的保护壳，防止了任何融合，而甘氨酸和丙氨酸的存在不能防止这种作用。上述结果表明相对高浓度的亮氨酸（即>5%w/w）往往会导致产生褶皱颗粒。在本研究中，含有亮氨酸的颗粒的形态似乎具有不同的表现。在研究设计空间内所使用的亮氨酸浓度（15至30摩尔%）大致对应于10至18%（w/w），其不会形成褶皱颗粒。因此，推测甘氨酸和/或丙氨酸的存在改变了球形干燥颗粒的核心结构，而亮氨酸往往保留在颗粒表面，从而提供了涂层以减少表面内聚性并防止干燥过程中的融合。

在本研究中，亮氨酸能够提高甘露糖醇制剂的雾化性能，而不需要形成褶皱颗粒。此外，FPF结果表明这可以是有利的。

表3

缩写：ED，喷射剂量；SD，喷雾干燥；TSI，Twin Stage碰撞取样器

表4

^°表示设计中心缩写n/a，不可用

实施例5

体内测试

将135天胎龄的怀孕母羊（n=5）用硫喷妥钠麻醉以准备用于手术。将异氟烷（氧气中2.5%）用于维持麻醉，并且施用达托霉素（depomycin）、普鲁卡因青霉素和双氢链霉素以减轻疼痛和降低感染风险。将每只母羊剃毛，并且在脐下中线位置处在腹部皮肤上切开10cm的切口以暴露子宫壁，小心避开大动脉。

用于测量肌电图（HMG）活动的三种无菌不锈钢线（0.07mm直径，位于2mm导管内部）置于围绕子宫的子宫肌层的平滑肌层中并通过缝合两针保持。将电极穿过导管，并通过右侧的小切口（2cm）从母羊中引出。将导管插入到右颈部以允许对血液采样并引起分娩。将母羊返回至代谢笼中，并饲养3-5天以从手术中恢复。

用相隔24小时的两次5ml地塞米松静脉注射（由5mg地塞米松磷酸盐和10mg地塞米松苯丙酸盐组成）来引起分娩。在第一次地塞米松注射后54±2小时发生分娩。

如以上详细说明的，在分娩15小时内施用缩宫素。每只绵羊接受干粉缩宫素制剂的气管内剂量、缩宫素溶液的气管内滴注和缩宫素的肌肉注射。在每次治疗之间，有至少一个半小时的清除期。

对于气管内施用，将内窥镜穿过鼻部通道进入气管并布置在靠近第一支气管分叉处，在此释放1mL缩宫素溶液等份（10IU）或通过改装的PennCentury粉末递送装置递送10mg（平均）干粉。

干粉制剂包含喷雾干燥的组合物，如实施例1中所述。按质量计，每毫克这种粉末含有13单位的缩宫素，并且它与按质量计等比例的甘露糖醇、甘氨酸和亮氨酸共同喷雾干燥。

在该程序期间，使用连接到内窥镜（Pentax FG-16X）上的Linvatec IM3301Pal摄像机采集支气管镜视频图像，并使用视频采集软件将这些视频图像作为数字文件保存在计算机上。图9a和9b提供了图像的实例。图9a中的图像显示了粉末递送前绵羊的气管，而图9b显示了递送后约30秒的图像。由于在递送前不存在白色斑块，图9b显示了白色不溶解粉末的明显迹象，表明在肺系统内未发生快速溶解。

将cyberamp380与MACLAB硬件（400Hz采样速率）和Chart4软件（10V输入范围）用于显示和记录来源于子宫内平滑肌细胞的动作电位。cyberamp380使用A1401探针，其正极输入设置为AC，负极输入设置为接地。AC截断为10Hz，预过滤器增益设置为100mV。低通滤波器设置为300Hz，陷波滤波器设置为关闭，输出增益设置为5，而总增益保留为500。进行双因素重复测量ANOVA以确定我们数据的统计显著性。参见图7。

分析了所记录的EMG活动的多种性质。至于从缩宫素递送至EMG活动的初始爆发所经过的时间（延迟），与IM递送相反，通过肺的递送导致对于第一次收缩来说更短的发生时间（图8a）。对于EMG活动初始爆发的长度，未观察到差异（图8b），并且在活动初始爆发后，在第一个30分钟内发生的爆发次数也没有差别（图8）。然而，与气道递送相比，对于缩宫素的IM来说，EMG活动的总持续时间显著更长，并且在分娩后立即观察到正常活动（图8）。

这些体内测试表明平均在约120秒后发生了子宫对通过经肺递送施用的缩宫素的可收缩反应，这与平均在约250秒后发生的IM递送相反。意外地，相比于肌内递送，粉末经肺递送造成的动作发生显著更快，并且还与血浆相对于时间的谱图一致。平均动作发生比对于IM来说小约50%。尽管事实上干粉颗粒含有作为难溶性和疏水性氨基酸的约30%的亮氨酸，但是可以预期延迟溶解。此外，可以预期相当大比例的亮氨酸将存在于粉末表面上。图9b支持了这种概念：在该环境中不预期这种粉末的快速溶解。数据还表明子宫对肺干粉缩宫素的可收缩反应模拟了产后期立即自然观察到的活动，如通过子宫活动的初始爆发长度以及在随后30分钟内记录的EMG活动爆发总数所观察到的。

实施例6

干粉流感抗原制剂

首先将流感抗原血细胞凝集素（HA）的粉末样品与其它赋形剂（即甘露糖醇45%w/w，甘氨酸45%w/w和亮氨酸10%w/w）一起溶解到水溶液中以产生抗原负荷为5μg HA/mg粉末的最终制剂。然后，在下列喷雾干燥条件：泵设置6.7mL/min；抽风机，20（100%）；气流，800l/hr下，将该溶液在Buchi190实验室喷雾干燥器中以相对低温（即70摄氏度的出口温度以最大程度降低热胁迫对抗原完整性的影响）喷雾干燥。然后，从用于储存的收集槽中收集喷雾干燥的流感抗原制剂。

实施例7

用于测试干粉流感抗原制剂的生物活性的方法

以下描述了用于测试喷雾干燥的含有血细胞凝集素（HA）作为活性蛋白质的干粉流感抗原制剂的生物活性的方法。将血细胞凝集测定（HA测定）用于测试干粉制剂中HA蛋白的完整性。首先，在测试前立即用磷酸盐缓冲盐水（PBS）将所关心的干粉流感抗原制剂复原成标准HA蛋白浓度的溶液。然后，将少量这种复原的溶液放置在96孔板的第一列。然后，通过连续稀释对整个96孔板用PBS1:2稀释所述溶液。然后，将具有标准红细胞浓度（即1%）的标准量的鸡红细胞溶液加入到所述板的每个孔中。在加入红细胞后，立即将板在室温培育30分钟。由于完整的HA蛋白将导致红细胞的血细胞凝集，因此在不再能够在30分钟导致血细胞凝集之前，含有HA的溶液能够维持的稀释水平将指示制剂中完整HA蛋白的量。发现抗原超过95%的活性，这在该程序的限度内。

实施例8

颗粒的内聚力测量和优选的内聚力值

装置和材料

所使用的装置为1mL剪切池模块，和作为FT4FREEMAN流变仪单元（FreemanTechnology,UK）一部分的排气活塞，和计算机用户界面和1mL剪切池调节模块。所使用的材料为1:99%w/w的亮氨酸/甘露糖醇、3:97%w/w的亮氨酸/甘露糖醇、5:95%w/w的亮氨酸/甘露糖醇和10:90%w/w的亮氨酸/甘露糖醇的喷雾干燥粉末。这些粉末是按照以上实施例1的条件产生的。

将粉末样品加载到所述池中并调节。在调节期间，当移动通过整个样品时，使用1mL剪切池调节模块来轻轻扰动粉末。其目的是通过除去过量空气和分离的预压实粉末颗粒来使粉末均匀。调节后，压缩粉末。这是通过平面排气活塞进行的，以确保均匀的颗粒-颗粒相互作用。挤压后是剪切。在剪切期间，使用了24mm剪切池（单元组成为：基底、滑片、断裂垫片和剪切池模块）。剪切器头包括18个刀片，其垂直向下移动从而引起了垂直剪切应力，而剪切器头的刀片刺穿粉末表面。然后，测量剪切应力并且当粉末不能抵抗该剪切应力时为最大。通过FT4FREEMAN集成软件产生了剪切应力对垂直应力的图。根据该图，外推的Y轴截距提供了粉末在零固结时的粉末内聚性。还记录了ffc[第一主应力（固结应力）σ1与无约束屈服强度σc的比值]数据。

表5

样品	平均内聚力(kpa)	可流动性(ffc)
			1％亮氨酸	3.4	1.4
3％亮氨酸	2.3	2
			5％亮氨酸	2.3	2
10％亮氨酸	1.4	2.9

从1至10%的亮氨酸含量，亮氨酸含量的增加降低了内聚力并且改善了流动性参数（ffc）。

然后，使用在相似条件下产生和测试的喷雾干燥的亮氨酸和PVP重复该实验。结果如下所示：

表6

样品	平均内聚力(kpa)
		0％亮氨酸	4.0
2％亮氨酸	3.5
		4％亮氨酸	3.4
8％亮氨酸	1.2
		10％亮氨酸	1.2
20％亮氨酸	0.7

实施例9

表面能测量

样品

使用如实施例1所述的条件，将两批次粉末从水中喷雾干燥，但其中所述粉末包括纯甘露糖醇或者具有所加入的10%w/w L-亮氨酸的甘露糖醇的组合物。

通过反相气相色谱法的表面能确定

使用反相气相色谱法（IGC,Surface Measurement Systems Ltd,and London,UK）确定这些粉末的表面能。将约0.33g的每种粉末装填到预硅烷化的玻璃柱中（300mm×3mm内径），其两端用硅烷化的玻璃棉松散封堵。在每次测量前，在303K将粉末装填柱调节2h以除去表面杂质。以10sccm（标准立方厘米每分钟）的气体流速通过氦气将探针携带到柱中，并通过火焰离子化检测器检测停留时间。根据以0.1p/p°（其中p表示分压，p°表示蒸气压）的浓度运行的甲烷的洗脱时间计算死体积。

无限稀释时的表面能确定：

以0.03p/p°的浓度，使用了用于非极性表面能（γ^NP）的GC级己烷、庚烷、辛烷、壬烷和癸烷（全部来自Sigma-Aldrich GmbH,Steinheim,Germany）和用于极性表面能（γ^P）的两个极性探针（即二氯甲烷和乙酸乙酯）。在其它地方描述了γ^P计算的详细内容（Thielmann等人,Investigation of the acid-base properties of an MCM-supported rutheniumoxide catalyst by inverse gas chromatography and dynamic vapoursorption.Jackson.S.D.,Hargreaves,J.S.J.,Lennon,D.主编，Catalysis inapplication Great Britain,Royal Soc.Chem.,p237(2003)和Traini等人,DrugDevelopment and Industrial Pharmacy34:992-1001(2008)。图1显示了无限稀释时的表面能贡献：

总表面能（γ^T）是非极性（γ^ΝP）和极性分布（γ^P）相加的结果（Grimsey等人,Journal of Pharmaceutical Sciences91:571-583(2002)）。计算了内聚功（W_co）（参见Vanoss等人,Langmuir4:884-891(1988)和Tay等人,International Journal ofPharmaceutics(Kidlington)383:62-69(2010)）。这些实验重复进行三次。

有限稀释时的表面能分布和表面积确定：

根据在其它地方所述的方法，确定了非极性表面能的分布谱图（γ^ΝΡ谱图）（F.Thielmann等人,Drug Development and Industrial Pharmacy33:1240-1253(2007)和Yla-Maihaniemi等人,Langmuir24:9551-9557(2008)）。这在图10中显示。对于含有亮氨酸的粉末，在所有覆盖度下非极性表面能明显降低，并且在这种情况下显示在1%覆盖度水平下，减小了超过30%。图11中显示了极性表面能分布。

根据己烷吸附等温线计算了Brunauer-Emmet-Teller（BET）表面积。将所吸附的量（n）除以单层吸附能力（n_m，对于单层覆盖度所吸附的探针的摩尔数），计算了表面覆盖度（n/n_m）。在每种表面覆盖度，对每种探针计算了净保留体积（V_N）。根据RTlnV_N对烷烃√γ^NP的图的斜率（2ΝA√γ^NP）计算了非极性表面能（γ^ΝΡ）。计算了每种表面覆盖度的γ^Ρ和γ^T，然后构建了它们的分布谱图（如Das等人,Langmuir27:521-523(201la)中所述）。

图12和13显示在加入亮氨酸的情况下，所计算的总表面能分布和内聚功也显著降低，例如，在约1%的表面覆盖度，降低了20%或以上。

实施例10

其它制剂的体内测试

根据实施例5，通过手术准备单个怀孕母牛以植入EMG电极和导管以允许血液采集。在与手术同一天开始的分娩诱导也是根据实施例5中所述的方法进行的。在诱导阶段开始后2天，发生了分娩和递送。

如以下详细说明的，在递送22小时内开始施用缩宫素。在每次治疗之间，有一个半小时的清除期。

对于气管内施用，将内窥镜穿过鼻部通道进入气管并布置在靠近第一支气管分叉处，在此通过改装的PennCentury粉末递送装置递送1个剂量的干粉（如以下详细说明的）。除了向肺部进行干粉递送外，还递送了肌肉注射的缩宫素（根据实施例5）。

干粉制剂包含如实施例1所述制备的喷雾干燥组合物。表7中显示了这些粉末的组成以及标称递送剂量。表7中还显示了从缩宫素递送至EMG活动的初始爆发所经过的时间（延迟）。图15和16中显示了这四种剂量的HMG迹线。

表7

意外地，相比于肌内递送，粉末经肺递送造成的动作发生显著更快，并且还与血浆相对于时间的谱图一致。数据还显示通过使用一定范围内的赋形剂（如多元醇糖、氨基酸和聚合物）所制备的干粉制剂可以实现快速响应。尽管事实上干粉颗粒含有作为难溶性和疏水性氨基酸的10-30%之间的亮氨酸，但是可以预期延迟溶解。此外，可以预期相当大比例的亮氨酸将存在于粉末表面上。

已经仅通过非限制性实例描述了本发明，并且在不背离本发明所述的精神和范围的前提下，可以对其做出多种修改和改变。

在整个说明书及其所附的权利要求中，除非上下文中另外要求，否则单词“包含”及其变化形式将理解为包含所说明的整数或步骤或者整数或步骤的组，但不排除任何其它整数或步骤或者整数或步骤的组。

在本说明书中，对任何在先出版物（或者来源于该出版物的信息），或对任何已知事物的参考不是也不应认为是对在先出版物（或者来源于该出版物的信息）或已知事物构成本说明书所涉及的领域中一般常识的一部分的承认或许可或任何形式的建议。

Claims

1.一种可吸入干粉，用于在治疗或预防产后出血中使用，其中，所述干粉包括包含以下的喷雾干燥的颗粒：

缩宫素和/或其衍生物，

L-亮氨酸，

其中，所述L-亮氨酸以基于所述可吸入干粉的干重的按重量计5％至50％的量存在。

2.根据权利要求1所述的可吸入干粉，其中，所述可吸入干粉用于通过口吸入到肺系统中。

3.根据权利要求1所述的可吸入干粉，其中，所述可吸入干粉用于经鼻施用。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的可吸入干粉，其中，至少部分所述L-亮氨酸位于所述干粉的所述颗粒的表面上。

5.根据权利要求1-3中任一项所述的可吸入干粉，其中，在吸入时，大于40％的所述干粉的所述颗粒具有小于5μm的空气动力学直径。

6.根据权利要求1-3中任一项所述的可吸入干粉，其中，所述可吸入干粉通过包括以下的方法制备：

制备水溶液/悬浮液，所述水溶液/悬浮液包含生物学活性蛋白或肽，一种或多种能够形成无定形玻璃基质的单糖、二糖或多糖和/或氨基酸，和L-亮氨酸；以及

将所述水溶液/悬浮液喷雾干燥以产生所述可吸入干粉。

7.根据权利要求1-3中任一项所述的可吸入干粉，其中，所述L-亮氨酸以按重量计10％至40％的量存在。

8.根据权利要求1-3中任一项所述的可吸入干粉，其中，能够形成无定形玻璃基质的所述一种或多种单糖、二糖或多糖和/或氨基酸包括D-甘露醇和甘氨酸。

9.根据权利要求1-3中任一项所述的可吸入干粉，其中，所述喷雾干燥在低于80℃的温度下进行。

10.根据权利要求1-3中任一项所述的可吸入干粉，其中，所述干粉包括海藻糖。

11.根据权利要求1-3中任一项所述的可吸入干粉，其中，在吸入所述干粉之后，在吸入200秒内实现通过子宫收缩所测量的作用发生。

12.根据权利要求11所述的可吸入干粉，其中，在吸入150秒内实现所述作用发生。

13.根据权利要求11所述的可吸入干粉，其中，在吸入100秒内实现所述作用发生。

14.根据权利要求1-3中任一项所述的可吸入干粉，其中，所述可吸入干粉还包括稳定剂。