CN103834691A - 靶向il-33基因rna干扰重组慢病毒载体的构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明针对IL-33基因，设计合成双链DNA片段，连接到慢病毒载体中，制备出重组慢病毒质粒载体，然后将重组慢病毒质粒载体与病毒包装成所需的3个辅助载体共转染到293T细胞中，获得靶向IL-33基因RNA干扰的重组慢病毒载体，为IL-33的进一步研究奠定了良好的基础。由于慢病毒载体免疫原性低，能感染分裂相和非分裂相细胞，将自身携带片断整合入宿主细胞基因组，并在哺乳动物各类细胞稳定表达siRNA，长期抑制基因表达。与质粒载体及其他病毒载体相比，慢病毒介导的RNA干扰具有高效、稳定、特异性强的特点。本发明为体内基因治疗及IL-33基因功能的研究提供了一种新思路。

Description

靶向IL-33基因RNA干扰重组慢病毒载体的构建方法
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种靶向IL-33基因RNA干扰重组慢病毒载体的构建方法。
背景技术
白细胞介素-33即interleukin-33，简称IL-33，是Schmitz等通过计算机辅助手段发现的IL-1家族的第11个成员，又被称为IL-1F11。人IL-33基因位于染色体9p24.1，小鼠与之相对应的基因则位于染色体19qC1。在人和小鼠中，IL-33基因分别编码270和266个氨基酸残基形成的多肽，相应的全长蛋白质分子量分别为30kD和29.9kD。IL-33广泛分布于身体的各器官系统中，主要在非造血细胞中表达，包括成纤维细胞、脂肪细胞、平滑肌细胞、内皮细胞、支气管和肠上皮细胞等。但是它也于造血细胞中表达，如激活的树突细胞和巨噬细胞低水平表达IL-33。IL-33蛋白具有双重功能，它不仅作为细胞因子参与信号通路的转导，还作为核内转录因子参与基因表达的调节。IL-33通过结合其受体IL-1受体样1(IL-1receptor-like1,IL1RL1)，也称为ST2，发挥它的生物学功能。当IL-33与ST2形成复合物后，募集IL-1受体辅助蛋白(IL-1receptor accessory protein,IL-1RAcP)，与其结合形成三聚体，并通过丝裂原激活蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)和NF-κB进行信号传导。
研究表明IL-33可以加剧气道炎症、过敏反应和类风湿性关节炎等疾病的发生。参见Kurowska-Stolarska M,Stolarski B,Kewin P,et al.IL-33amplifies the polarization of alternativelyactivated macrophages that contribute to airway inflammation[J].J Immunol,2009,183(10):6469-6477.Matsuba-Kitamura S,Yoshimoto T,Yasuda K,et al.Contribution of IL-33to inductionand augmentation of experimental allergic conjunctivitis[J].Int Immunol,2010,22(6):479-489.及Xu D,Jiang HR,Kewin P,et al.IL-33exacerbates antigen-induced arthritis by activating mastcells[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2008,105(31):10913-10918.同时IL-33在纤维化疾病中也发挥着重要作用。它会促进肺纤维化、肝纤维化、皮肤纤维化和肾脏纤维化的发生。参见LuzinaI G,Kopach P,Lockatell V,et al.Interleukin-33Potentiates Bleomycin-induced Lung Injury[J].Am J Respir Cell Mol Biol,2013,49(6):999-1008.Marvie P,Lisbonne M,L'Helgoualc'h A,et al.Interleukin-33overexpression is associated with liver fibrosis in mice and humans[J].J Cell MolMed,2010,14(6B):1726-1739.Rankin AL,Mumm JB,Murphy E,et al.IL-33inducesIL-13-dependent cutaneous fibrosis[J].J Immunol,2010,184(3):1526-1535.及Manetti M,Ibba-Manneschi L,Liakouli V,et al.The IL1-like cytokine IL33and its receptor ST2areabnormally expressed in the affected skin and visceral organs of patients with systemic sclerosis[J].Ann Rheum Dis,2010,69(3):598-605.因此，针对靶向抑制IL-33的治疗或许会对上述疾病带来希望。
RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术能够特异性地降解目的基因的mRNA，从而使靶基因沉默，在转录后水平抑制基因的表达，因此可以用它来进行基因功能和药物靶点的研究。慢病毒载体是目前常用的病毒载体之一，它能够将外源基因整合到宿主细胞的基因组上，同时它还具有免疫原性低，对分裂细胞和非分裂细胞均具有干扰能力等优点。它能够在哺乳动物各类细胞中稳定表达siRNA，长期抑制目的基因表达。因此将慢病毒载体介导的RNA干扰技术的高效、稳定及特异性强等特点应用于基因功能的研究，在疾病的基因治疗上具有良好的前景。但是目前慢病毒载体介导的IL-33RNA干扰技术还没有相关报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：针对现有技术的不足，提供一种靶向IL-33基因RNA干扰重组慢病毒载体的构建方法。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：靶向IL-33基因RNA干扰重组慢病毒载体的构建方法，包括以下步骤：
a.根据IL-33mRNA序列，设计合成双链DNA片段；
b.将合成的双链DNA片段连接到pLVX-shRNA2载体的多克隆位点中构建成pLVX-IL-33-shRNA2重组载体；
c.将构建得到的pLVX-IL-33-shRNA2重组载体与pMDLg pRRE载体、pRSV-rev载体及pCMV-VSV-G载体共转染到293T细胞培养，即得到靶向IL-33基因RNA干扰重组慢病毒载体。
所述的双链DNA片段为以下四种序列中的一种：
(1)mus-IL-33寡核苷酸序列1：
正义链：5'-gatccACGGGATTCTAGGAAGAGATTCAAGAGATCTCTTCCTAGAATCCCGTTTTTTTACGCGTg-3'，
反义链：5'-aattcACGCGTAAAAAAACGGGATTCTAGGAAGAGATCTCTTGAATCTCTTCCTAGAATCCCGTg-3'；
(2)mus-IL-33寡核苷酸序列2：
正义链：5'-gatccGTGCTACTACGCTACTATGTTCAAGAGACATAGTAGCGTAGTAGCACTTTTTTACGCGTg-3'，
反义链：5'-aattcACGCGTAAAAAAGTGCTACTACGCTACTATGTCTCTTGAACATAGTAGCGTAGTAGCACg-3'；
(3)mus-IL-33寡核苷酸序列3：
正义链：5'-gatccGCCATAAGAAAGGAGACTAGTTCAAGAGACTAGTCTCCTTTCTTATGGTTTTTTACGCGTg-3'，
反义链：5'-aattcACGCGTAAAAAACCATAAGAAAGGAGACTAGTCTCTTGAACTAGTCTCCTTTCTTATGGCg-3'；
(4)mus-IL-33寡核苷酸序列4：
正义链：5'-gatccGCCCTGAGTACATACAATGATTCAAGAGATCATTGTATGTACTCAGGGTTTTTTACGCGTg-3'，
反义链：5'-aattcACGCGTAAAAAACCCTGAGTACATACAATGATCTCTTGAATCATTGTATGTACTCAGGGCg-3'。
步骤b中，所述的pLVX-shRNA2载体的多克隆位点连接双链DNA片段的酶切位点为BamH I和EcoR I。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明针对IL-33基因，设计合成双链DNA片段，连接到慢病毒载体中，制备出重组慢病毒质粒载体，然后将重组慢病毒质粒载体与病毒包装成所需的3个辅助载体共转染到293T细胞中，获得靶向IL-33基因RNA干扰的重组慢病毒载体，该载体是复制缺陷自我失活的第三代慢病毒载体，为IL-33的进一步研究奠定了良好的基础。由于慢病毒载体免疫原性低，能感染分裂相和非分裂相细胞，将自身携带片断整合入宿主细胞基因组，并在哺乳动物各类细胞稳定表达siRNA，长期抑制基因表达。与质粒载体及其他病毒载体相比，慢病毒介导的RNA干扰具有高效、稳定、特异性强的特点。本发明为体内基因治疗及IL-33基因功能的研究提供了一种新思路。
附图说明
图1为重组慢病毒质粒载体pLVX-IL-33-shRNA2结构示意图；
图2为四种重组质粒的琼脂糖电泳图；
图3为四种重组质粒Mlu I酶切验证结果；
图4为插入片段基因测序结果；
图5为靶向IL-33基因RNA干扰的重组质粒对IL-33基因抑制效果。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
设计了4个靶向IL-33基因RNA干扰重组慢病毒载体的构建方法的实施例，各实施例的构建方法包括以下步骤：
1.寡核苷酸的设计及合成
应用Clontech公司的RNAi Target Sequence Selector软件并通过Blast同源比对，设计靶向IL-33基因mRNA序列(NM-001164724.1)的4个干扰靶序列，分别对应实施例1、实施例2、实施例3和实施例4，具体参见下表1，并合成相应的双链DNA。
表1实施例1～4的双链DNA序列名称及靶序列
序列名称 靶序列
实施例1 mus-IL-33寡核苷酸序列1 ACGGGATTCTAGGAAGAGA
实施例2 mus-IL-33寡核苷酸序列2 GTGCTACTACGCTACTATG
实施例3 mus-IL-33寡核苷酸序列3 CCATAAGAAAGGAGACTAG
实施例4 mus-IL-33寡核苷酸序列4 CCCTGAGTACATACAATGA
在合成的双链DNA片段正义链5’端引入BamH I酶切位点和反义链的5’端引入EcoR I酶切位点；如果靶序列不是以嘌呤碱基开始，正义链的5’端必须加上一个G，为RNA聚合酶III提供一个合适的转录起始位点；靶序列长度为19bp；发卡环序列为TTCAAGAGA；靶序列的反义链为19bp；RNA聚合酶III的终止序列包含6个多聚T碱基；为了方便鉴定重组质粒在终止子序列后面加了一个Mlu I酶切位点(ACGCGT)，重组载体经该酶酶切后会产生一个约1.3kb的片段；3’端含有一个G碱基保证下游EcoR I克隆位点完成。
实施例1～4中双链DNA合成片段信息如下：
(1)实施例1中mus-IL-33寡核苷酸序列1：
正义链：5'-gatccACGGGATTCTAGGAAGAGATTCAAGAGATCTCTTCCTAGAATCCCGTTTTTTTACGCGTg-3'，
反义链：5'-aattcACGCGTAAAAAAACGGGATTCTAGGAAGAGATCTCTTGAATCTCTTCCTAGAATCCCGTg-3'；
(2)实施例2中mus-IL-33寡核苷酸序列2：
正义链：5'-gatccGTGCTACTACGCTACTATGTTCAAGAGACATAGTAGCGTAGTAGCACTTTTTTACGCGTg-3'，
反义链：5'-aattcACGCGTAAAAAAGTGCTACTACGCTACTATGTCTCTTGAACATAGTAGCGTAGTAGCACg-3'；
(3)实施例3中mus-IL-33寡核苷酸序列3：
正义链：5'-gatccGCCATAAGAAAGGAGACTAGTTCAAGAGACTAGTCTCCTTTCTTATGGTTTTTTACGCGTg-3'，
反义链：5'-aattcACGCGTAAAAAACCATAAGAAAGGAGACTAGTCTCTTGAACTAGTCTCCTTTCTTATGGCg-3'；
(4)实施例4中mus-IL-33寡核苷酸序列4：
正义链：5'-gatccGCCCTGAGTACATACAATGATTCAAGAGATCATTGTATGTACTCAGGGTTTTTTACGCGTg-3'，
正义链：5'-aattcACGCGTAAAAAACCCTGAGTACATACAATGATCTCTTGAATCATTGTATGTACTCAGGGCg-3'。
2.pLVX-IL-33-shRNA2重组载体的构建
(1)Lentivirus-shRNA引物退火
将各实施例中合成的双链DNA片段分别用TE buffer(pH8.0)溶解，浓度为100μM。取相应的正义链和反义链寡聚物溶液各2μL，在PCR仪上进行退火反应。程序如下：95℃30s；72℃2min；37℃2min；25℃2min；4℃保存。退火处理后得到浓度为50μM的shRNA模板。将所得模板溶液稀释100倍，终浓度为500nM，用于连接反应。
(2)pLVX-shRNA2载体的线性化
提取pLVX-shRNA2质粒，核酸测定仪Nanodrop2000测定浓度及纯度后，然后取1μg质粒按照如下体系进行酶切反应：
组分 体积(μL)
10×K Buffer 2
BamH I 0.5
EcoR I 0.5
pLVX-shRNA2 1μg
双蒸水 至20
总体系 20
37℃酶切4h，琼脂糖电泳后用DNA回收试剂盒回收，核酸测定仪测定其浓度为20ng/μL，A260/A280=1.8，A260/A230=2.03，其纯度较高。
(3)pLVX-IL-33-shRNA2重组载体的构建
按照如下体系连接反应：
组分 体积(μL)
Solution I 5
pLVX-shRNA2(BamH I+EcoR I) 2.5
shRNA模板 1
双蒸水 1.5
总体系 10
16℃连接6h，转化到DH5α感受态细胞。
每个连接反应挑取4个菌落，接种到5mL含100μg/mL氨苄抗生素的LB液体培养基中，37℃200r/min震荡16h左右，提取质粒进行琼脂糖电泳；然后用Mlu I进行酶切验证，再将酶切正确的菌液送到上海桑尼生物科技有限公司进行测序鉴定。由于质粒较多，琼脂糖电泳、酶切及测序结果中每个序列只选择一个克隆的图片。琼脂糖电泳如图2所示，条带基本一致；酶切验证结果如图3所示，1,3,5为对照质粒，2,4,6,7为四种质粒酶切，都有约1.3kb的条带；测序结果如图4所示，与设计的序列完全相同。
3.靶向IL-33基因RNA干扰的重组质粒对IL-33基因抑制效果的鉴定
先用无内毒素质粒大提试剂盒提取构建4个pLVX-IL-33-shRNA2重组质粒、pLVX-shRNA2及pcDNA3.1(+)-mIL-33，构建的pLVX-IL-33-shRNA2重组慢病毒质粒载体质粒的结构示意图如图1所示；然后将状态良好，处于对数期的293T细胞用0.25%胰酶消化，用完全培养基悬浮成单细胞悬液，细胞计数后，按照每孔6×105个细胞接种于6孔板中，18～24h细胞融合度达到70%左右时，换成DMEM完全培养基；2h后分别用200μL DMEM培养基稀释1μg四种干扰重组质粒及阴性对照质粒pLVX-shRNA2，再加入1μgpcDNA3.1(+)-mIL-33高表达质粒，混匀后，分别向各管中加入4μL NanoFectin转染试剂，充分混匀后，离心室温放置15分钟；然后将各混合物逐滴加入对应的细胞孔中；8h后换成不含抗生素的DMEM培养基；37℃，5%CO2培养箱中继续培养40h；提取细胞的总RNA，逆转录后进行RT-PCR方法检测重组质粒的干扰效率。靶向IL-33基因RNA干扰的重组质粒对IL-33基因抑制效果如图5所示。图5中，0为无插入双链DNA片段的pLVX-shRNA2对照，1,2,3,4分别为插入上述4个实施例中合成的4种双链DNA片段的重组慢病毒pLVX-IL-33-shRNA2干扰质粒载体。从图5中可看出4个实施例中，实施例1和实施例4构建的靶向IL-33基因的RNA干扰抑制效果最好；实施例2次之；实施例3的抑制效果较差。
4.慢病毒包装及滴度测定
无内毒素质粒大提试剂盒提取病毒包装的三个辅助质粒pMDLg pRRE、pRSV-rev及pCMV-VSV-G质粒；然后与构建的干扰效率高重组质粒按照NanoFectin使用说明书共转染到293T细胞；转染8h后换成不含抗生素的DMEM培养基；换液后分别在48h、72h时收集细胞上清；4℃3000g离心15min去除细胞和细胞碎片后，用0.45μm滤膜过滤彻底去除细胞碎片，若要获得较高浓度的慢病毒，可在滤膜过滤后加入原上清1/4体积的Lenti-ConcentinTM VirusPrecipitation Solution；充分混匀，4℃放置24h，4℃1500g离心30min；弃上清，再次1500g离心5min弃净剩余液体；然后用1/100原上清体积的PBS重悬沉淀，分装成小份，每种病毒取出一支进行滴度测定，剩余的-80℃冰箱冻存。
按照梯度稀释法进行滴度测定，即准备500μL无菌离心管，IL-33基因RNA干扰的重组慢病毒载体和空病毒载体各10个，每管加入90μL含血清的DMEM培养基；分别取10μL IL-33基因RNA干扰的重组慢病毒载体和空病毒载体分别加入到第1个管中，混匀后吸取10μL加入到第2个管中，继续相同操作，每管中加入1.5×104个293T细胞，充分混匀后将离心管中的混合物加入到96孔板中，37℃培养24h后换液，继续培养48h后用倒置荧光显微镜观察，慢病毒滴度=(带有荧光的细胞数/病毒原液量)×103TU/mL。
以上实施例中所用主要材料的来源为：PrimeSTAR HS DNA Polymerase、BamH I、EcoR I、DNA Ligation Kit Ver.2.1、RNAiSO Plus和DL2,000Marker均购于大连宝生生物有限公司；质粒DNA小量制备试剂盒与GenClean柱式琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购于上海捷瑞生物工程有限公司；逆转录试剂盒购于Invitrogen公司；无内毒素质粒大提试剂盒购买于天根生化科技有限公司；NanoFectin Transfection Regent和Lenti-ConcentinTM Virus Precipitation Solution购买于上海ExCell Bio；DMEM高糖培养基和胎牛血清购买于Hyclone公司；胰酶与抗生素购买于Gibco公司；10cm的细胞培养皿购买于Corning公司；大肠杆菌DH5α、含pcDNA3.1(+)-mIL-33质粒的甘油菌由本实验室保存；pLVX-shRNA2(Clontech)慢病毒载体与三代慢病毒辅助载体pMDLg pRRE(Addgene)、pRSV-rev(Addgene)及pCMV-VSV-G(Addgene)购买于长沙爱科博生物科技有限公司；293T细胞购买于上海中科院细胞库。

Claims (3)

1.靶向IL-33基因RNA干扰重组慢病毒载体的构建方法，其特征在于该构建方法包括以下步骤：
a.根据IL-33mRNA序列，设计合成双链DNA片段；
b.将合成的双链DNA片段连接到pLVX-shRNA2载体的多克隆位点中构建成pLVX-IL-33-shRNA2重组载体；
c.将构建得到的pLVX-IL-33-shRNA2重组载体与pMDLg pRRE载体、pRSV-rev载体及pCMV-VSV-G载体共转染到293T细胞培养，即得到靶向IL-33基因RNA干扰重组慢病毒载体。
2.根据权利要求1所述的靶向IL-33基因RNA干扰重组慢病毒载体的构建方法，其特征在于所述的双链DNA片段为以下四种序列中的一种：
(1)mus-IL-33寡核苷酸序列1：
正义链：5'-gatccACGGGATTCTAGGAAGAGATTCAAGAGATCTCTTCCTAGAATCCCGTTTTTTTACGCGTg-3'，
反义链：5'-aattcACGCGTAAAAAAACGGGATTCTAGGAAGAGATCTCTTGAATCTCTTCCTAGAATCCCGTg-3'；
(2)mus-IL-33寡核苷酸序列2：
正义链：5'-gatccGTGCTACTACGCTACTATGTTCAAGAGACATAGTAGCGTAGTAGCACTTTTTTACGCGTg-3'，
反义链：5'-aattcACGCGTAAAAAAGTGCTACTACGCTACTATGTCTCTTGAACATAGTAGCGTAGTAGCACg-3'；
(3)mus-IL-33寡核苷酸序列3：
正义链：5'-gatccGCCATAAGAAAGGAGACTAGTTCAAGAGACTAGTCTCCTTTCTTATGGTTTTTTACGCGTg-3'，
反义链：5'-aattcACGCGTAAAAAACCATAAGAAAGGAGACTAGTCTCTTGAACTAGTCTCCTTTCTTATGGCg-3'；
(4)mus-IL-33寡核苷酸序列4：
正义链：5'-gatccGCCCTGAGTACATACAATGATTCAAGAGATCATTGTATGTACTCAGGGTTTTTTACGCGTg-3'，
反义链：5'-aattcACGCGTAAAAAACCCTGAGTACATACAATGATCTCTTGAATCATTGTATGTACTCAGGGCg-3'。
3.根据权利要求1或2所述的靶向IL-33基因RNA干扰重组慢病毒载体的构建方法，其特征在于步骤b中，所述的pLVX-shRNA2载体的多克隆位点连接双链DNA片段的酶切位点为BamH I和EcoR I。
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