CN103827187B - 用β片层多肽嵌段共聚物功能化的生物活性碳纳米管复合材料及其制备方法 - Google Patents

用β片层多肽嵌段共聚物功能化的生物活性碳纳米管复合材料及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用β片层多肽嵌段共聚物功能化的生物活性碳纳米管复合材料，其展示了极好的水分散作用以及拥有生物活性因此被用作刺激-响应生物材料或者用于生产基于CNT的电子生物传感器装置。此外，该生物活性碳纳米管复合材料能够被用作将生物活性材料递送入细胞的组合物。而且，预期β片层肽和碳基疏水性材料之间相互作用的应用对设计和开发由蛋白质异常片层引起的疾病的抑制剂有用。

Description

用β片层多肽嵌段共聚物功能化的生物活性碳纳米管复合材料及其制备方法
技术领域
本发明涉及用β片层多肽嵌段共聚物功能化的生物活性碳纳米管复合物。更详细地，本发明涉及高水分散性、生物活性复合物，所述复合物包括用生物活性两亲的β片层多肽嵌段共聚物功能化的碳纳米管。本发明还涉及生物传感器、蛋白质错折叠疾病和生物大分子相互作用的抑制剂、以及使用碳纳米管复合物进行生物活性材料细胞内递送的组合物。
背景技术
碳纳米管(CNT)是具有广泛电子、光学、机械和生物应用范围的纳米材料。为了将CNT用做生物材料，需要满足CNT的某些特定的物理、化学和生物性质。CNT本质上在水溶液中不可溶且广泛地成束。因为生物系统基本上由水溶性分子和结构组成，所以CNT在水溶液中的增溶(solubilization)是其在生物应用中使用的先决条件。此外，用生物活性分子表面功能化CNT是重要的，其为了给予所述CNT执行特定生物功能的能力。
CNT增溶的两种主要方法是基于共价和非共价功能化。在共价功能化中，官能团(如羧酸或者胺)通过化学反应在CNT的缺陷位点(defectsites)形成，然后其可用作与生物活性分子进行缀合反应的位点。用这种方法的问题在于所述方法会损害原始CNT的内部结构以及电性质。相反地，非共价方法能够潜在地保护CNT的π-共轭系统。所述方法通常使用两亲分子，所述两亲分子的疏水部分环绕着CNT的壁而亲水部分与水溶液相互作用。多种类型的分子(包括低分子量的亲水脂分子或表面活性物质、聚合物和碳水化合物)已经被用来进行CNT的非共价功能化和增溶。
韩国专利公开号10-2004-0075620描述了碳纳米管在固体状态下的非共价功能化以形成碳纳米管/核酸复合体。韩国专利注册号10-0682381描述了碳纳米管衍生物，其中碳纳米管用卵清蛋白非共价功能化。
发明内容
技术问题
本发明的第一个目标是提供用生物活性的β片层多肽嵌段共聚物功能化的碳纳米管复合物，所述共聚多肽通过生物活性和亲水的肽片段缀合到β片层片段形成。
本发明的第二个目标是提供使用用β片层多肽嵌段共聚物功能化的碳纳米管复合物进行细胞内递送生物活性材料的组合物和生物传感器。
本发明的第三个目标是提供制备用β片层多肽嵌段共聚物功能化的碳纳米管复合物的方法。
技术方案
为了达到第一个目标，本发明提供了β片层多肽嵌段共聚物和碳纳米管的复合物，其中每个β片层多肽嵌段共聚物由β片层多肽嵌段和生物活性多肽嵌段组成，β片层多肽嵌段具有非极性和极性氨基酸的交替系列或包含50％至100％的非极性氨基酸，生物活性多肽嵌段包含占其总氨基酸的50％-100％的极性氨基酸，β片层多肽嵌段非共价结合到碳纳米管表面，并且生物活性多肽嵌段是亲水性的并暴露在复合物外。
根据本发明的一个实施方案，非极性氨基酸可选自苯丙氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸和色氨酸。
根据本发明的一个实施方案，极性氨基酸可以选自赖氨酸、甘氨酸、精氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸和硒代半胱氨酸。
根据本发明的另一个实施方案，β片层多肽嵌段的非极性氨基酸可以为苯丙氨酸或者色氨酸，而β片层多肽嵌段的极性氨基酸可以为赖氨酸、谷氨酸或者甘氨酸。
根据本发明的另一个实施方案，β片层多肽嵌段通过肽链间β片层氢键自组装，且苯丙氨酸或者色氨酸可以通过π-π堆积和疏水相互作用非共价结合到碳纳米管的表面。
根据本发明的另一个实施方案，β片层多肽嵌段共聚物可以是大环肽(macrocyclicpeptide)，其中N-和C-末端彼此连接。
为了达到第二个目标，本发明提供了生物传感器，所述传感器包含β片层多肽嵌段共聚物和碳纳米管的复合物，以及连接到复合物与目标生物材料反应的配体或者受体。
根据本发明的一个实施方案，配体或者受体可选自酶底物、配体、氨基酸、肽、蛋白质、酶、脂质、辅因子、碳水化合物及其组合。
本发明还提供了用于生物活性材料细胞内递送的组合物，所述组合物包含作为活性成分的β片层多肽嵌段共聚物和碳纳米管的复合物。
为了达到第三个目标，本发明提供了制备β片层多肽嵌段共聚物和碳纳米管的复合物的方法，所述方法包括(a)从碳纳米管悬液中除去悬浮用溶剂以获得经预处理的碳纳米管，和(b)向β片层多肽嵌段共聚物水溶液中加入经预处理的碳纳米管以获得分散液(dispersion)。
根据本发明的一个实施方案，分散液可以还包含盐。
根据本发明的另一个实施方案，在步骤(a)中所述，悬浮用溶剂可为四氢呋喃并且可以通过离心除去。
根据本发明的另一个实施方案，盐可以在分散液中以1mM或更高的浓度存在，且所述分散液可以通过超声处理(sonication)制备。
有益效果
本发明的复合物通过用生物活性两亲的β片层多肽嵌段共聚物功能化碳纳米管制备。肽／碳纳米管复合物具有高水分散性和生物活性。由于这些优点，肽／碳纳米管复合物能够被用来作为刺激-响应(stimulus-reactive)生物材料或用于制造基于CNT的电子生物传感器装置。此外，肽／碳纳米管复合物能够应用于生物活性材料细胞内递送的组合物。基于β片层肽和碳基疏水性材料之间的相互作用，预期肽／碳纳米管复合物对设计和开发针对蛋白质错折叠疾病的抑制剂有用。
附图说明
图1是示出根据本发明的复合物的β片层多肽嵌段共聚物和单壁碳纳米管(SWCNT)之间组合自组装的多种反应路径的概念图：肽的a和b分别代表生物活性片段(GRKKRRQRRRPPQGSGG)和β片层自组装片段(FKFEFKFEFKFE)。
图2示出SWCNT在纯水中的增溶：a)图像示出β片层多肽嵌段共聚物浓度对SWCNT增溶的影响(数字代表肽的浓度)，b)曲线图示出通过动态光散射(DLS)测定的溶解的肽／SWCNT复合物流体动力学半径(RH)的分布，和(c)图像示出β片层多肽嵌段共聚物浓度在从左至右1.5、5、12.5μM的肽浓度下对SWCNT(SWCNT的量是5mg)的增溶的影响。
图3示出离子强度对β片层肽和SWCNT组合自组装的影响：a)在纯水(左)或者在50mMNaCl(右)中进行涡旋混匀的肽样品的图像，b)在纯水(左)或者在50mMNaCl(右)中经超声处理的肽样品的图像，c)圆二(CD)色谱，a(粗体实线，5mM肽+60mMNaCl)，b(点线，5mM肽+20mMNaCl)，c(交替一长和两短虚线，5mM肽+60mMNaCl+5mgSWCNT)，和d(细实线，5mM肽+20mMNaCl+5mgSWCNT)，d)肽单独的荧光发射光谱(b，点线)和肽／SWCNT复合物的荧光发射光谱(a，实线)，以及e)和f)溶解的肽／SWCNT(50mM／5mg)复合物在纯水(e)和20mMNaCl(f)中的TEM图像。
图4示出确认肽／SWCNT复合物在Hela细胞中细胞内递送的图像：a)图像示出肽／SWCNT复合物的细胞内分布，b)图像示出细胞用LysoTrackerRedDND-99染色的图像，和c)合并的图像(放大倍率400×)。
图5示出离子强度对β片层多肽嵌段共聚物形成的影响：在多个盐浓度下测定的CD色谱(左)，和示出在215nm下测定的取决于β片层多肽嵌段共聚物中的β片层含量的摩尔椭圆率的曲线图(右)。
图6示出离子强度对β片层多肽嵌段共聚物形成的影响：在多个盐浓度(0-120mM)下测定的CD色谱(左)，和图示出在215nm下测定的取决于β片层多肽嵌段共聚物中的β片层含量的摩尔椭圆率的曲线图(右)。
图7示出根据本发明的复合物的环状β片层多肽嵌段共聚物的结构(合成实施例2中的肽1至4)。
图8的图像示出确定SWCNT是否在与环状多肽嵌段共聚物结合后在20mM盐的水溶液(左)和超声处理后的150mM盐的水溶液(右)中溶解。
图9是溶解的环状多肽／SWCNT的TEM图像。
图10示出CD色谱测定以确定根据本发明的环状多肽／SWCNT复合物的稳定肽的α螺旋结构的功能。
图11所示图像确认使用环状肽对SWCNT的增溶，以探究除了苯丙氨酸残基之外使用色氨酸残基作为共聚多肽β片层形成片段从而使得SWCNT增溶的可能性。
图12的图像示出确定肽增溶SWCNT的能力，尽管β片层形成残基特别是色氨酸残基的数量和排列在β片层多肽片段中有变化。
图13描绘了环状β片层多肽嵌段共聚物合成的环化反应。
具体实施方式
现将更详细地描述本发明。
当合适地设计时，肽(蛋白质的最小构成)能够开发成为类蛋白质的人造纳米材料并自组装成为可控纳米结构。
特别地，当生物活性和亲水肽片段缀合到β片层片段时，自组装β片层肽可被功能化变成生物活性纳米结构，得到生物活性的β片层多肽嵌段共聚物。这样做，可制造出多种类型的可控和生物有用的β片层肽纳米结构。
β片层多肽嵌段共聚物可自身自组装成纳米结构。此外，对β片层多肽嵌段共聚物的自组装的控制允许它们与碳纳米管共组装来代替自组装。
本发明提供了基于β片层多肽嵌段共聚物和碳纳米管之间的共组装来制备β片层多肽嵌段共聚物/碳纳米管复合物的技术。
本发明提供了通过生物活性的β片层多肽嵌段共聚物与CNT的组合自组装制备的生物活性碳纳米管复合物。
本发明提供了包含碳纳米管和多个β片层多肽嵌段共聚物的水溶性复合物，其中每一个β片层多肽嵌段共聚物通过生物活性多肽片段和β片层多肽片段的共聚作用制备，且全部或部分地通过非共价结合环绕在碳纳米管表面。β片层多肽片段结合到碳纳米管的表面，亲水多肽片段带有电荷并暴露在外表面层。生物活性多肽嵌段有交替排列的一种或多种选自赖氨酸、甘氨酸、精氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺和丝氨酸的氨基酸，而β片层多肽有交替排列的一种或多种选自苯丙氨酸、色氨酸、赖氨酸、谷氨酸和甘氨酸的氨基酸。
β片层多肽嵌段共聚物是线状肽或大环肽，其中N-和C-末端彼此连接。
本发明的自组装系统应包括两类竞争力之间的受力平衡过程(force-balanceprocesses)：β片层片段之间的引力和β片层片段与CNT之间的引力。如果前者占优势，肽应该参与形成β片层纳米结构，而CNT仍然在水溶液中不可溶。另一方面，如果后者的引力变得占优势，能够构建用生物活性的β片层多肽嵌段共聚物非共价功能化的水溶性／生物活性CNT。对于这种受力平衡过程更详细的了解对于控制并因此抑制蛋白质错折叠疾病中的β淀粉状蛋白和相关蛋白质的聚集行为是有价值的。
β片层多肽通过肽链间β片层氢键自组装，且β片层多肽的苯丙氨酸或色氨酸残基通过π-π堆积相互作用结合到碳纳米管的表面。
如上文所证明，β片层多肽嵌段共聚物的两个片段关于极性和聚集倾向有显著不同的性质。
生物活性片段(例如，图1中的a)是基于Tat细胞穿膜肽(Tatcell-penetratingpeptide)的。由于该片段包含多个赖氨酸和精氨酸，其在水溶液中变为高电荷和有极性。自组装片段有非极性(苯丙氨酸或色氨酸)和极性(赖氨酸和谷氨酸)氨基酸的交替系列，这促进了在肽链间β片层氢键的形成。由于亲水片段的庞大和多个正电荷，这样排列的多肽嵌段共聚物仅在足够高的离子强度下能形成β片层纳米带状结构(图1中的路径1)。不存在盐或者在低离子强度下，多肽嵌段共聚物大多数以无规卷曲构象存在。
本发明提供了生物传感器，所述生物传感器包含β片层多肽嵌段共聚物和碳纳米管的水溶性复合物，和连接到复合物与目标生物材料反应的配体或受体。
在本发明中，目标生物材料是这样一种材料，其能够适合于作为与配体或者受体反应结果探测的目标。目标生物材料优先选自蛋白质、核酸、抗体、酶、碳水化合物、脂质和其他生物分子，且更优选疾病相关的蛋白质、核酸或者碳水化合物。
在本发明中，配体或者受体可以是酶底物、配体、氨基酸、肽、蛋白质、酶、脂质、辅因子或者碳水化合物。
本发明还提供了用于生物活性材料细胞内递送的组合物，所述组合物包含作为活性成分的β片层多肽嵌段共聚物-碳纳米管复合物。
本发明的组合物能穿透细胞膜并直接在细胞内作用。相反地，常见的生物活性材料不容易穿过细胞膜。因此，本发明的组合物能够在药物递送系统的发展中带来重要的突破。
本发明的组合物包含以基于其总重0.0001重量％至50重量％的活性成分。
本发明的组合物还可以含有一种或更多种展示出与β片层多肽嵌段共聚物-碳纳米管复合物的功能有相同或相似功能的活性成分。
为了施用，除了上文描述的活性成分外，本发明的组合物还可以包括一个或更多个药物上可接受的载体。合适的药物上可接受的载体包括生理盐水、无菌水、林格氏溶液(Ringer'ssolution)、缓冲盐水、葡萄糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油、乙醇、脂质体和其混合物。如果必要的话，本发明的组合物还可以包含一个或更多个选自本领域公知的添加剂(例如抗氧化剂、缓冲溶液和制菌剂)。本发明的组合物可以与稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和润滑剂调配来制备注射剂(injectables，如水溶液、悬液或乳浊液)、丸剂、胶囊、颗粒或者片剂。目标器官特异性抗体或者其他配体可以结合到所述载体上。此外，本发明的组合物可以通过本领域已知的合适技术根据疾病的类型或者成分的种类进行调配。
包含作为活性成分的复合物的组合物可以通过合适的途径进行细胞内递送，所述途径包括静脉内、腹膜内、肌内、皮下、皮内、鼻的、黏膜的、吸入和口服进入。剂量可以根据体重、年龄、性别、治疗对象的健康和饮食、施用的时间和模式、排泄率、疾病的严重性和其他相关因素而变化。复合物的每日剂量可以在约0.1mg／kg至约100mg／kg范围内，优选为0.5mg／kg至10mg／kg，且更优选地以单剂量或者分剂量施用。
本发明提供了制备β片层多肽嵌段共聚物和碳纳米管水溶性复合物的方法，所述方法包括(a)在四氢呋喃中悬浮碳纳米管并通过离心蒸发四氢呋喃以获得经预处理的碳纳米管，和(b)将经预处理的碳纳米管、5-200μM的β片层多肽嵌段共聚物水溶液和10-150mM的氯化钠水溶液混和，并超声处理该混合物。
β片层多肽嵌段共聚物是生物活性多肽和β片层多肽的嵌段共聚物。生物活性多肽具有一种或更多种选自赖氨酸、甘氨酸、精氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺和丝氨酸的氨基酸的交替排列，而β片层多肽具有一种或更多种选自苯丙氨酸、色氨酸、赖氨酸、谷氨酸和甘氨酸的氨基酸的交替排列。
本发明将参考下面的实施例进行解释。然而，显然对于本领域技术人员这些实施例仅是为了说明的目的，并不意味着限制了本发明的范围。
发明模式
从Novabiochem(德国)购买芴甲氧羰基-氨基酸(Fmoc-aminoacid)。分别从Merck(德国)和Anaspec(美国)购买Fmoc-21-氨基-4,7,10,13,16,19-六氧杂二十一碳酸(Fmoc-NH-PEG5-COOH)和N-(Fmoc-8-氨基-3,6-二氧杂辛基)琥珀酰胺酸(Fmoc-PEG2-Suc-OH或者Fmoc-Ebes-OH)。从HanwhaNanotec(韩国)购买通过电弧放电生产的单壁碳纳米管(ASP-100F，“纯化”等级)。从Invitrogen(美国)购买组织培养试剂。
合成实施例1：线状β片层多肽嵌段共聚物
(1)在RinkAmideMBHA树脂LL(Novabiochem)上用TributeTM肽合成仪(ProteinTechnologies，Inc.)使用标准Fmoc方案合成肽。合成使用了标准氨基酸保护基团。β片层多肽嵌段共聚物的序列如下：
Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Glu-Arg-Arg-Arg-Pro-Pro-Glu-Ser-Gly-Gly-Phe-Lys-Phe-Glu-Phe-Lys-Phe-Glu-Phe-Lys-Phe-Glu或者
GRKKRRQRRRPPQGSGGFKFEFKFEFKFE
(2)为了肽合成中在N-末端加入荧光标签，1mL的N-甲基-2吡咯烷酮(NMP)中的5-羧基荧光素(50mmol)、HBTU(45mmol)和DIPEA(100mmol)溶液被加入树脂结合的肽中并过夜反应。然后，树脂继续用NMP和乙腈洗涤并在真空中干燥。干燥后的树脂用裂解溶液(cleavagesolution)(TFA∶TIS∶水=95∶2.5∶2.5)处理3小时并与叔丁基甲基醚一起研磨。肽通过反相HPLC(水-乙腈，0.1％TFA)纯化。分子量通过MALDI-TOF质谱分析来确定。通过分析HPLC确定肽的纯度＞95％。
使用257.5nm下苯丙氨酸的摩尔消光系数(195mol-1cm-1)在水∶乙腈(1∶1)溶液中用分光光度法确定浓度。
实验实施例：线状β片层多肽嵌段
(1)圆二色性(CD)
使用装有珀耳帖温度控制器(Peltiertemperaturecontroller)的ChirascanTM圆二色分光计(AppliedPhotophysics.，Ltd.)测量CD光谱。使用2mm通路长度(path-length)池记录从250nm至190nm的光谱。扫描重复五次并取平均。计算每氨基酸残基的摩尔椭圆率。在测量前，5μM有和没有SWCNT的肽溶液在室温下于20mM或60mMNaCl中孵育12小时。
(2)透射电子显微镜(TEM)
将2mL的样品放置在碳涂层的铜载网上并完全干燥。加入2mL水1分钟来溶解并除去任何未结合的肽，然后使用滤纸通过毛细作用(wickoff)带走水。使用JEOL-JEM2010设备在150kV下运行来观察样品。获得的数据用DigitalMicrographTM软件进行分析。
(3)动态光散射(DLS)
DLS实验在室温下使用在632.8nm下运行的装有He-Ne激光的ALV／CGS-3紧凑测角系统(compactgoniometersystem)进行。光学探测器使用连接到ALV／SO-SIPD／DUAL探测单元的光纤，所述探测单元使用EMIPM-28B电源和ALV／PM-PD前置放大器／鉴别器。信号分析器是有288个指数分布通道的ALV5000／E／WIN多tau数字相关器(multiple-taudigitalcorrelator)。散射角为90°。使用约束正则化方法(constrained-regularizationmethod)确定大小分布。
(4)荧光分光法
使用HitachiF-4500荧光分光光度计和1cm通路长度石英池记录稳定状态的荧光光谱。在50mMNaCl溶液中肽浓度通常为5mM。为了从苯丙氨酸残基测量荧光性，样品在257nm下激发。使用具有10nm标称带通路(nominalband-path)的激发和发射狭缝来测量。
(5)组织培养和细胞内递送实验
为了显微观察β片层多肽嵌段共聚物／SWCNT复合物的细胞内递送，HeLa细胞(4×105)在8孔Lab-tekII胶室盖玻片系统(Nunc)上于10％FBS的DMEM中接种并在37℃下过夜培养。细胞用DPBS洗涤并用肽／SWCNT复合物处理20分钟。然后，样品溶液被移出，且细胞进一步在DMEM中孵育90分钟。在获得图像前，LysoTrackerRedDND-99(Invitrogen)以50nM加入5分钟。装有氩(488nm)和氦-氖(543nm)激光的NikonEclipseTE2000-U倒置显微镜被用来共焦图像。
实验实施例1
首先，所述实验来确定是否潜在的β片层形成肽能够结合然后在纯水中增溶SWCNT。电弧生产的SWCNT在四氢呋喃(THF)中悬浮且向微量离心管中加入相同量的SWCNT(5mg)。在THF蒸发后，加入多肽嵌段共聚物溶液(0.3mL)，且该混合物在室温下进行超声处理15分钟。如图2中a)和b)所示，当肽浓度增加时SWCNT变得溶解增加；大部分SWCNT在肽浓度约12.5μM时悬浮(参加图2c))。该结果提出多肽嵌段共聚物中的苯丙氨酸残基通过疏水和π-π堆积相互作用连接到SWCNT，且富含赖氨酸和精氨酸的亲水片段通过与水溶液相互作用帮助肽／SWCNT复合物的溶解(图1)。Zeta电位(ζ)测量显示肽／SWCNT复合物有大的正值(+58±3mV)，证明由于阳离子和亲水片段在肽／SWCNT复合物外层的暴露形成了带正电荷的表面。
实验实施例2
接下来，研究离子强度对肽／SWCNT复合物形成的影响。嵌段多肽溶液的β片层含量随着增加NaCl浓度而增加，且在盐浓度约50-60mM时增加到达了一个平台(参见图5)。基于该结果研究离子强度对SWCNT增溶的影响。该实验在5mM的肽浓度下进行，所述浓度对于5mg的SWCNT在纯水中(图2的c)中间的图像)的增溶是不充足的。
如图3的a)(左)中所示，肽(5mM)和SWCNT混合物在纯水中示出SWCNT大颗粒的存在，表明其不完全溶解。相反地，当加入盐(50mM)且溶液进行涡旋混匀，颗粒变小了(图3的a)中的右边图像)。对两个混合物进行超声处理，有显著的重大差异。纯水中的混合物显示大量聚集在空气-水界面不可溶SWCNT的形成(图3的b)中的左边图像)，而在有盐的情况下，SWCNT几乎全部溶解(图3的b)中的右边图像)。
因此，所述结果证明了在高离子强度下对于SWCNT溶解的增强作用。考虑到嵌段共聚肽在盐浓度50mM下形成稳定的β片层纳米带状结构(图5)，该行为显示β片层片段和SWCNT之间的引力强于β片层片段之间的引力，以及肽／SWCNT组合自组装过程快于β片层的形成。该结果也得到CD光谱对于肽和肽／SWCNT复合物记录的结果支持。SWCNT的存在防止了β片层的形成，正如被在215nm下负最低椭圆率的显著减小所证明(参见图3的c))。β片层片段和SWCNT之间的强吸引和肽直接结合在SWCNT上进一步通过在复合物形成时苯丙氨酸荧光的消失确定(参见图3的d))。
实验实施例3
TEM图像更显著地示出离子强度对于肽／SWCNT复合物形成的影响。
虽然SWCNT在纯水中表现出很好的分散稳定状态，但是已证实制备的复合物在某些条件下也能够显示出成束的SWCNT(参见图3的e)和图1中的路径2)。与此相反，当存在盐的情况下制备复合物时，大多数SWCNT是不成束的(参见图3的f)和图1中的路径3)。
因此，该发现意味着盐的存在进一步加强了苯丙氨酸和SWCNT之间的疏水相互作用，并且屏蔽了肽之间非特异性电荷相互作用，从而对SWCNT的有效增溶和不成束起到作用。
实验实施例4
进行研究来确定预先组装的β片层纳米带是否能够被分解并在SWCNT存在下用于增溶CNT(图1中的路径1或路径5)。
结果，甚至在充分超声处理(extensivesonfication)之后，所述实验显示一旦β片层纳米带已经形成，SWCNT不能被增溶和用肽功能化。
综合考虑，上述实验实施例的结果描绘了在β片层肽和CNT的组合自组装中的两个重要发现。
第一，当β片层肽之间的关联弱或肽处于自组装的起始阶段时，图1中路径2和路径3的组合使得能够制造用生物活性CNT的功能化的β片层多肽嵌段共聚物。
第二，上述结果已经示出对蛋白质错折叠疾病中淀粉状纤维形成的抑制作用。更确切地说，碳的同素异形体(如CNT和富勒烯)可防止淀粉状蛋白的形成。考虑到分解预先组装的β片层纳米带的困难(路径4和路径5)，碳基淀粉状蛋白抑制剂的主要目标应该是中间组装物，如在淀粉状纤维形成的早期阶段中形成的原纤维物类。
实验实施例5
为了探究使用通过路径3制备的肽／SWCNT复合物作为细胞递送材料的可能性，研究复合物与哺乳动物细胞的相互作用。
因为复合物用Tat细胞穿膜肽修饰，所以所述复合物可能有效地进入细胞内。Tat细胞穿膜肽(CPP)已经显示可穿过细胞的细胞质膜和核膜屏障。为了显示复合物，将荧光素标记的肽与未加标记的肽以1∶50的摩尔比混合，且肽混合物用来功能化SWCNT。如图4中的a)所示，复合物在整个细胞质中广泛分布，表明复合物有效的细胞内递送。
复合物的绿色荧光和LysoTracker(在活细胞中标记酸性细胞器的探针)的红色荧光表明复合物通过内吞作用机制进入细胞(参见图4的c))。作为分离肽，Tat肽能够同进入细胞质一样进入细胞核和核仁。然而，尽管Tat肽有细胞核定位活动，然而复合物主要定位于细胞质中表明由于复合物的大尺寸，其不能通过核孔复合体(NPC)。因此，所述结果意味着在细胞内肽仍然处在SWCNT结合状态，证明了复合物的稳定性。
合成实施例2：环状β片层多肽嵌段共聚物
(1)在RinkAmideMBHA树脂LL(Novabiochem)上用TributeTM肽合成仪(ProteinTechnologies，Inc.)使用标准Fmoc方案合成肽。对于合成，对于氨基酸使用了标准氨基酸保护基团，而不是甲氧基三苯基(Mmt)保护的半胱氨酸。β片层多肽嵌段共聚物(肽1-4)的序列如下：
1.环
[-Phe-Lys-Phe-Glu-Phe-Lys-Phe-Glu-Phe-PEG5-Thr-Arg-Gln-Ala-Arg-Arg-Asn-Arg-Arg-Arg-Arg-Trp-Arg-Arg-PEG5-Cys-]
或者环[-FKFEFKFEF-PEG5-TRQARRNRRRRWRR-PEG5-C-]
2.环
[-Trp-Lys-Trp-Glu-Trp-Lys-Trp-Glu-Trp-Lys-Trp-Glu-Trp-Ebes-Gly-Thr-Arg-Gln-Ala-Arg-Arg-Asn-Arg-Arg-Arg-Arg-Trp-Arg-Arg-Ebes-Cys-]
或者环
[-WKWEWKWEWKWEW-Ebes-GTRQARRNRRRRWRR-Ebes-C-]
3.环
[-Trp-Trp-Gly-Trp-Trp-Ebes-Thr-Arg-Gln-Ala-Arg-Arg-Asn-Arg-Arg-Arg-Arg-Trp-Arg-Arg-Ebes-]
或者环[-WWGWW-Ebes-TRQARRNRRRRWRR-Ebes-]
4.环
[-Gly-Trp-Trp-Trp-Trp-Ebes-Thr-Arg-Gln-Ala-Arg-Arg-Asn-Arg-Arg-Arg-Arg-Trp-Arg-Arg-Ebes-]
或者环[-GWWWW-Ebes-TRQARRNRRRRWRR-Ebes-]
多肽嵌段共聚物是大环肽，其中N-和C-末端通过图13描绘的环化反应连接。所述结构在图7中进行显示(生物活性的肽片段和β片层自组装片段分别以“蓝”和“红”指出)。
(2)合成的β片层多肽嵌段共聚物通过下面的过程进行环化。首先，溴乙酸与树脂结合肽的N-末端偶联，且将孵育10分钟进行羧化的溴乙酸(28mg，200mmol)和N，N-二异丙基碳二亚胺(DIPC)的混合物加入树脂。然后，树脂用NMP和DCM洗涤，并在1分钟内将在DCM中1％的TFA溶液多次加入树脂以从半胱氨酸除去Mmt基团。其后，加入3mL1％的DIPEA且允许混合物在室温下过夜反应来分子内环化。然后，树脂继续用NMP和乙腈洗涤并在真空中干燥。干燥后的树脂用裂解溶液(TFA∶TIS∶水=95∶2.5∶2.5)处理3小时并与叔丁基甲基醚一起研磨。肽通过反相HPLC(水-乙腈，0.1％TFA)纯化。
分子量通过MALDI-TOF质谱分析来确定。通过分析HPLC确定肽的纯度＞95％。
分别使用280nm下色氨酸和257.5nm下苯丙氨酸的摩尔消光系数(195mol-1cm-1)在水∶乙腈(1∶1)溶液中用分光光度法确定肽1和肽2的浓度。
实验实施例：环状β片层多肽嵌段
(1)投射电子显微镜
将2mL的样品放置在碳涂层的铜载网上并完全干燥。在1分钟内加入2mL水溶解并除去任何未结合的肽，然后使用滤纸通过毛细作用带走水。使用JEOL-JEM2010设备在150kV下运行来观察样品。获得的数据用DigitalMicrographTM软件进行分析。
(2)圆二色性(CD)
使用装有珀耳帖温度控制器的ChirascanTM圆二色分光计(AppliedPhotophysics.，Ltd.)测量CD光谱。使用2mm通路长度池记录从260nm至200nm的光谱。扫描重复五次并取平均。计算每氨基酸残基的摩尔椭圆率。在测量前，50μM有和没有SWCNT的肽溶液在150mMKF中孵育24小时，而另一个没有SWCNT的50μM肽溶液在蒸馏水中孵育24小时。
实验实施例6
首先，所述实验来确定是否像线状多肽嵌段共聚物、环状多肽嵌段共聚物能够结合并随后增溶SWCNT。为此，使用合成实施例2的肽1。
电弧生产的SWCNT在四氢呋喃(THF)中悬浮且向微量离心管中加入相同量的SWCNT(5mg)。在THF蒸发后，加入合成实施例2的环状多肽嵌段共聚物1溶液(0.3mL)，且该混合物在室温下进行超声处理15分钟。
如图8(左边图像)所示，在低浓度(20mM)下的盐的水溶液中通过肽1SWCNT未被有效增溶。相反地，如图8(右边图像)所示，借助于超声处理，通过肽1大部分SWCNT悬浮在150mM盐的水溶液中。所述结果提出像线状共聚多肽、环状共聚多肽也能够在适当的离子强度下通过苯丙氨酸残基的疏水和π-π堆积相互作用以及生物活性片段与水溶液的相互作用提高肽／SWCNT复合物的溶解性。
实验实施例7
图9的TEM图像示出环状共聚多肽对SWCNT的增溶。
实验实施例8
CD色谱测定来确定肽／SWCNT复合物稳定肽的α螺旋结构的功能。
为了检验SWCNT作为蛋白质模拟型(proteinmimics)支撑α螺旋结构的功能，CD色谱在合成实施例2的肽2的50μM在纯水中的溶液和肽2在150mM盐的水溶液中的溶液上测定(分别为图10的谱b(点线)和c(交替一长和两短虚线))。将50μM浓度的肽2加入含有20μgSWCNT的150mM盐的水溶液，接着进行超声处理以形成肽／SWCNT复合物，其用来进行CD色谱测定(图10的谱a(实线))。
如图10所示，虽然在水中和盐的水溶液中没有SWCNT的肽未能稳定α螺旋结构，但是肽／SWCNT复合物在盐的水溶液中的CD色谱展示出在208nm和222nm下显著的负最低椭圆率值，其显示α螺旋结构的有效稳定作用。从这个结果能够确定SWCNT强力地通过疏水和π-π堆积相互作用支撑了的环状共聚多肽的β片层形成片段，证明SWCNT稳定肽的α螺旋结构的能力，所述能力类似于巨型蛋白质在体内对α螺旋结构的支撑。
实验实施例9
为了探究除了苯丙氨酸残基之外使用色氨酸残基作为对于SWCNT增溶的共聚多肽β片层形成片段的可能性，应用环状肽2进行SWCNT增溶。
如图11的左边图像所示，SWCNT在不含有肽的150mM盐的水溶液中未被有效增溶。相反地，如图11的右边图像所示，借助于超声处理，大部分SWCNT悬浮在含有10μM浓度肽1的150mMKF盐溶液中。所述结果表明像苯丙氨酸残基、色氨酸残基能够通过疏水和π-π堆积相互作用有效地增溶SWCNT。
实验实施例10
研究合成实施例2的环状肽3和肽4是否能够增溶SWCNT，尽管β片层多肽片段的β片层形成残基特别是色氨酸残基的数量和排列有变化。
如图12所示，40mMKF盐的水溶液未良好地悬浮SWCNT(左边图像)，而借助于超声处理，含有30μM肽3的40mM盐的水溶液显示出增溶SWCNT的趋向(右边图像)。
综合考虑，前述实验实施例的结果确定了只要β片层多肽片段残基的种类、数量和排列合适的变化，环状肽就能够被应用于SWCNT的增溶。
工业应用性
如上文所证明，在生物活性的β片层多肽嵌段共聚物和CNT的组合自组装过程中存在若干不同的关联模式。根据条件生物活性的β片层多肽嵌段共聚物能够自组装或者能够用来功能化CNT复合物。这在扩展生物活性的β片层多肽嵌段共聚物的潜在应用上很重要。生物活性的β片层多肽嵌段共聚物／CNT复合物能够用作刺激-响应生物材料或者用于制造基于CNT的电子生物传感器装置。此外，观察β片层肽和碳基疏水材料之间的相互作用预期对设计和开发蛋白质错折叠疾病的抑制剂有用。

Claims (12)

1.一种β片层多肽嵌段共聚物和碳纳米管的复合物，
其中每个β片层多肽嵌段共聚物由β片层多肽嵌段和生物活性多肽嵌段组成，
所述β片层多肽嵌段有非极性氨基酸和极性氨基酸的交替系列或者包含50％至100％的非极性氨基酸，
所述生物活性多肽嵌段中构成生物活性多肽嵌段之总氨基酸的50％至100％由极性氨基酸构成，
所述β片层多肽嵌段与所述碳纳米管的表面非共价结合，以及
所述生物活性多肽嵌段带有电荷并暴露在所述复合物之外。
2.根据权利要求1的β片层多肽嵌段共聚物和碳纳米管的复合物，其中所述非极性氨基酸选自苯丙氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸和色氨酸，而极性氨基酸选自赖氨酸、甘氨酸、精氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸和硒代半胱氨酸。
3.根据权利要求2的β片层多肽嵌段共聚物和碳纳米管的复合物，其中所述β片层多肽嵌段的非极性氨基酸为苯丙氨酸或色氨酸，而β片层多肽嵌段的极性氨基酸为赖氨酸、谷氨酸或甘氨酸。
4.根据权利要求3的β片层多肽嵌段共聚物和碳纳米管的复合物，其中所述β片层多肽嵌段通过肽链间的β片层氢键自组装，且苯丙氨酸或色氨酸通过π-π堆积和疏水相互作用与所述碳纳米管的表面非共价结合。
5.根据权利要求1的β片层多肽嵌段共聚物和碳纳米管的复合物，其中所述β片层多肽嵌段共聚物是大环肽，其中N-和C-末端彼此连接。
6.一种生物传感器，其包含根据权利要求1至5中任一项的β片层多肽嵌段共聚物和碳纳米管的复合物，和连接到所述复合物以与目标生物材料反应的配体或者受体。
7.根据权利要求6的生物传感器，其中所述配体或者受体选自酶底物、氨基酸、肽、蛋白质、酶、脂质、辅因子、碳水化合物及其组合。
8.用于细胞内递送生物活性材料的组合物，其包含作为活性成分的根据权利要求1至5中任一项的β片层多肽嵌段共聚物和碳纳米管的复合物。
9.制备根据权利要求1的β片层多肽嵌段共聚物和碳纳米管的复合物的方法，所述方法包括
(a)从碳纳米管悬液中除去悬浮用溶剂以获得经预处理的碳纳米管，和
(b)向β片层多肽嵌段共聚物的水溶液中加入所述经预处理的碳纳米管以获得分散液。
10.根据权利要求9的方法，其中所述分散液还包含盐。
11.根据权利要求9或10的方法，其中在步骤(a)中，所述悬浮用溶剂为四氢呋喃并通过离心除去。
12.根据权利要求10的方法，其中所述盐在分散液中以10至150mM的浓度存在，并且所述分散液通过超声处理制备。
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