KR20130019803A - 베타-시트 폴리펩티드 블록 공중합체로 기능화된 생체활성 탄소나노튜브 복합체 및 그 제조방법 - Google Patents

베타-시트 폴리펩티드 블록 공중합체로 기능화된 생체활성 탄소나노튜브 복합체 및 그 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 베타-시트 폴리펩티드 블록 공중합체로 기능화된 생체활성 탄소나노튜브 복합체에 관한 것으로서, 수분산성이 우수하고, 생체활성을 가져서 자극 반응성 바이오 소재로서 또는 CNT 기반 전자 바이오 센서 장치의 제작에 사용될 수 있다. 또한, 생물학적 활성 물질의 세포내 전달용 조성물로서도 활용이 가능하고, β-시트 펩티드와 탄소 기반 소수성 물질 사이의 상호작용을 응용하여 단백질의 이상접힘에 의한 질환에 대한 억제제의 설계 및 개발에도 유용할 것으로 기대된다.

Description

베타-시트 폴리펩티드 블록 공중합체로 기능화된 생체활성 탄소나노튜브 복합체 및 그 제조방법{Bioactive carbon nanotube functionalized by β-sheet block copolypeptide and preparing method the same}
본 발명은 베타-시트 폴리펩티드 블록 공중합체로 기능화된 생체활성 탄소나노튜브 복합체에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 생체활성을 갖는 양친매성 베타-시트 폴리펩티드 블록 공중합체를 이용하여 탄소나노튜브를 수분산성이 우수한 생체활성 복합체로 기능화하고, 이를 바이오 센서 및 생물학적 활성 물질의 세포내 전달용 조성물로 활용한 것이다.
탄소 나노튜브(CNT)는 다양한 전기적, 광학적, 기계적, 생물학적 응용범위를 가지는 나노물질이다. CNT를 바이오소재로 사용하려면, 몇 가지 물리적, 화학적, 생물학적 특징이 충족되어야 한다. CNT는 본래 수용액에서 불용성이며 심하게 응집된다. 생체 시스템은 기본적으로 수용성 분자 및 구조체로 구성되어 있으므로, CNT의 생물학적 이용을 위해서는 수용액 내에서의 가용화 문제가 해결되어야 한다. 또한, CNT가 특정한 생물학적 기능을 수행할 수 있도록 하기 위해 그 표면을 생체활성 분자로 기능화하는 것이 중요하다.
CNT의 가용화를 위한 두 가지 주요 접근방법은 공유결합에 의한 기능화와 비공유결합에 의한 기능화이다. 공유결합에 의한 기능화에서는 화학반응을 통해 CNT의 결함 자리에 카르복실산 또는 아민과 같은 작용기를 형성하는데, 이들 작용기는 생체활성 분자와의 컨주게이션 반응에 이용될 수 있다. 이 방법의 문제점은 CNT 고유의 구조적, 전기적 특징이 훼손될 수 있다는 점이다.
이에 비해, 비공유결합에 의한 기능화 방법에서는 CNT의 π-컨주게이션 시스템이 보존될 수 있다. 이 방법에서는 주로 양친매성 분자를 이용하는데, 양친매성 분자의 소수성 부분은 CNT의 벽을 둘러싸고 친수성 부분이 수용액과 상호작용을 한다. 저분자량 분자 또는 계면활성제, 폴리머, 탄수화물 등이 CNT의 비공유결합 기능화 및 가용화를 위해 사용되어 왔다.
종래 기술로서, 한국공개특허(공개번호 제10-2004-0075620호)에는 고체 상태에서 비공유 결합을 통하여 탄소나노튜브/핵산 결합체를 형성한 탄소나노튜브의 기능화 내용이 기재되어 있고, 한국등록특허(등록번호 제10-0682381호)에 탄소나노튜브와 난백-단백질이 비공유결합된 탄소나노튜브 유도체에 관한 내용이 기재되어 있다.
펩티드(단백질의 최소화된 형태)는 적절한 설계 및 자기조립을 통해 제어 가능한 나노구조를 형성하도록 함으로써 단백질 유사 인공 나노물질로 개발할 수 있다.
특히, 자기조립 β-시트 펩티드는 생체활성 및 친수성 펩티드 부분을 β-시트 부분과 컨주게이션하여 생체활성 β-시트 폴리펩티드 블록 공중합체를 형성함으로써 생체활성 나노구조로의 기능화가 가능하다. 이를 통해, 제어 가능하며 생물학적으로 유용한 다양한 형태의 β-시트 펩티드 나노구조를 제조할 수 있다.
따라서, 본 발명이 해결하고자 하는 첫 번째 과제는 생체활성 및 친수성 펩티드 부분을 β-시트 부분과 컨주게이션하여 형성한 생체활성 β-시트 폴리펩티드 블록 공중합체를 이용하여 기능화한 탄소나노튜브 복합체를 제공하는 것이다.
본 발명이 해결하고자 하는 두 번째 과제는 상기 β-시트 폴리펩티드 블록 공중합체를 이용하여 기능화한 탄소나노튜브 복합체를 활용한 바이오 센서 및 생물학적 활성 물질의 세포내 전달용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명이 해결하고자 하는 세 번째 과제는 상기 β-시트 폴리펩티드 블록 공중합체를 이용하여 기능화한 탄소나노튜브 복합체의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 상기 첫 번째 과제를 달성하기 위하여,
베타-시트 폴리펩티드 블록 공중합체 및 탄소나노튜브와의 복합체로서,
상기 베타-시트 폴리펩티드 블록 공중합체는 소수성 폴리펩티드 블록 및 친수성 폴리펩티드 블록으로 이루어지고,
상기 소수성 폴리펩티드 블록은 비극성 아미노산 및 제1 극성 아미노산이 서로 반복되는 구조를 가지고,
상기 친수성 폴리펩티드 블록은 친수성 폴리펩티드 블록을 이루는 아미노산의 55-100%가 제2 극성 아미노산으로 이루어지며,
상기 소수성 폴리펩티드 블록은 상기 탄소나노튜브 표면과 비공유 결합을 하고,
상기 친수성 폴리펩티드 블록은 양전하를 띠면서 상기 복합체 외곽으로 노출되는 것을 특징으로 하는 베타-시트 폴리펩티드 블록 공중합체 및 탄소나노튜브와의 복합체를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 친수성 폴리펩티드 블록은 친수성 폴리펩티드 블록을 이루는 아미노산의 55-100%가 친수성 아미노산으로 이루어지고,
상기 비극성 아미노산은 페닐알라닌(phenylalanine), 알라닌(alanine), 발린(valine), 이소류신(isoleucine), 류신(leucine), 메치오닌(methionine), 티로신(tyrosine) 및 트립토판(tryptophan) 중에서 선택되고,
상기 제1 극성 아미노산 및 상기 제2 극성 아미노산은 각각 독립적으로 라이신(lysine), 글라이신(glycine), 아르기닌(arginine), 프롤린(proline), 글루타민(glutamine), 세린(serine), 히스티딘(histidine), 아스파라긴산(aspartic acid), 글루타민산(glutamic acid), 트레오닌(threonine), 아스파라긴(aspargine), 시스테인(cysteine) 및 셀레노시스테인(selenocysteine) 중에서 선택될 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시예에 의하면, 상기 비극성 아미노산은 페닐알라닌이고, 상기 제1 극성 아미노산은 라이신 또는 글루탐산일 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시예에 의하면, 상기 소수성 폴리펩티드 블록은 펩티드 가닥 사이에서 베타-시트 수소결합을 형성하여 자기조립을 형성하고, 상기 페닐알라닌이 상기 탄소나노튜브 표면과 π-π 스태킹 및 소수성 상호작용을 통하여 비공유 결합을 형성할 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시예에 의하면, 상기 친수성 폴리펩티드 블록은 글라이신-아르기닌-라이신-라이신-아르기닌-아르기닌-글루타민-아르기닌-아르기닌-아르기닌-프롤린-프롤린-글루타민-세린-글라이신-글라이신의 아미노산 서열을 포함하고,
상기 소수성 폴리펩티드 블록은 페닐알라닌-라이신-페닐알라닌-글루탐산의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명은 상기 두 번째 과제를 달성하기 위하여,
상기 베타-시트 폴리펩티드 블록 공중합체 및 탄소나노튜브와의 복합체, 및 상기 베타-시트 폴리펩티드 블록 공중합체 및 탄소나노튜브와의 복합체에 표적 바이오 물질과 반응할 수 있는 리간드 또는 리셉터가 부착된 것을 특징으로 하는 바이오 센서를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 리간드 및 리셉터는 각각 독립적으로 효소기질, 리간드, 아미노산, 펩티드, 단백질, 효소, 지질, 코펙터, 탄수화물 및 이들 2종의 조합일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 베타-시트 폴리펩티드 블록 공중합체 및 탄소나노튜브와의 복합체를 유효 성분으로 포함하는 생물학적 활성 물질의 세포내 전달용 조성물을 제공한다.
본 발명은 상기 세 번째 과제를 달성하기 위하여,
(a) 탄소나노튜브 현탁액에서 현탁 용매를 제거함으로써 전처리된 탄소나노튜브를 수득하는 단계; 및
(b) 상기 전처리된 탄소나노튜브를 베타-시트 폴리펩티드 블록 공중합체 수용액에 추가하여 분산액을 수득하는 단계;를 포함하는 베타-시트 폴리펩티드 블록 공중합체 및 탄소나노튜브와의 복합체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 분산액은 염을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시예에 의하면, 상기 (a) 단계의 상기 현탁 용매는 테트라 하이드로 퓨란이고, 상기 현탁 용매는 원심분리 방법에 의해서 제거될 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시예에 의하면, 상기 염의 상기 분산액 내 농도가 1 mM이상이고, 상기 분산액은 초음파 방법을 이용하여 제조할 수 있다.
본 발명은 생체활성을 갖는 양친매성 베타-시트 폴리펩티드 블록 공중합체를 이용하여 탄소나노튜브를 기능화한 것으로서, 이에 따라 제조된 펩티드/탄소나노튜브 복합체는 수분산성이 우수하고, 생체활성을 가져서 자극 반응성 바이오 소재로서 또는 CNT 기반 전자 바이오 센서 장치의 제작에 사용될 수 있다. 또한, 생물학적 활성 물질의 세포내 전달용 조성물로서도 활용이 가능하고, β-시트 펩티드와 탄소 기반 소수성 물질 사이의 상호작용을 응용하여 단백질의 이상접힘에 의한 질환에 대한 억제제의 설계 및 개발에도 유용할 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 β-시트 폴리펩티드 블록 공중합체와 단일벽 탄소나노튜브(SWCNT)의 다양한 조합/자기조립의 반응 경로를 보여주는 개념도로서, 펩티드의 청색(GRKKRRQRRRPPQGSGG) 부분은 친수성 및 생체활성 부분이고, 적색(FKFEFKFEFKFE) 부분은 자기조립 부분이다.
도 2는 순수한 물 내에서 SWCNT의 가용화를 확인한 것으로서,
(a)는 β-시트 폴리펩티드 블록 공중합체의 농도가 SWCNT의 가용화에 미치는 영향을 확인한 이미지이고,(숫자는 펩티드의 농도를 나타낸다)
(b)는 동적 광산란(DLS)에 의해 측정한, 가용화된 펩티드/SWCNT 복합체의 수화반경(RH)분포를 나타낸 그래프이며,
(c)는 왼쪽부터 펩티드 농도 1.5, 5 및 12.5 mM에서 β-시트 폴리펩티드 블록 공중합체의 농도가 SWCNT의 가용화에 미치는 영향을 확인한 이미지이다. (SWCNT의 양은 5 ㎍임)
하기 도 3은 이온세기가 β-시트 펩티드와 SWCNT의 조합 자기조립에 미치는 영향을 확인한 것으로서,
(a)는 순수한 물(왼쪽) 또는 50 mM NaCl(오른쪽) 내의, 볼텍싱한 펩티드 샘플을 나타내는 이미지이다.
(b)는 순수한 물(왼쪽) 또는 50 mM NaCl(오른쪽) 내의, 초음파 처리한 펩티드 샘플을 나타내는 이미지이다.
(c)는 CD 스펙트럼을 나타낸 그래프로서, 검은색(5 μM 펩티드 + 60 mM NaCl), 청색(5 μM 펩티드 + 20 mM NaCl), 녹색(5 μM 펩티드 + 60 mM NaCl + 5 ㎍ SWCNT), 적색(5 μM 펩티드 + 20 mM NaCl + 5 ㎍ SWCNT)이다.
(d)는 펩티드 단독(적색) 및 펩티드/SWCNT 복합체(청색)의 형광방출 스펙트럼을 나타낸 그래프이다.
(e) 및 (f)는 각각 순수한 물 내(e) 및 20 mM NaCl 존재 하(f)의, 가용화된 펩티드/SWCNT(50 μM/5 ㎍) 복합체의 TEM 이미지이다.
도 4는 HeLa 세포에서 펩티드/SWCNT 복합체의 세포 간 전달을 확인한 이미지로서,
(a)는 펩티드/SWCNT 복합체의 세포 내 분포를 나타내는 이미지이고,
(b)는 LysoTracker Red DND-99로 염색한 세포 이미지이며,
(c)는 합성 이미지이다. (배율 ×400)
도 5는 이온 세기가 폴리 펩티드 블록 공중합체의 β-시트 형성에 미치는 영향을 확인한 것으로서,
(a)는 여러 염 농도에서 측정한 CD 스펙트럼이다.
(b)는 215 nm에서 측정한 β-시트 폴리펩티드 블록 공중합체 내 β-시트 함량에 따른 분자의 타원율을 나타낸 그래프이다.
도 6은 이온 세기가 폴리 펩티드 블록 공중합체의 β-시트 형성에 미치는 영향을 확인한 것으로서,
(a)는 여러 염(0-120 mM) 농도에서 측정한 CD 스펙트럼이다.
(b)는 215 ㎚에서 측정한 β-시트 폴리펩티드 블록 공중합체 내 β-시트 함량에 따른 분자의 타원율을 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
본 발명은 생체활성 β-시트 폴리펩티드 블록 공중합체와 CNT가 조합되어 자기조립된 생체활성 탄소나노튜브 복합체를 제공한다.
친수성 폴리펩티드와 소수성 폴리펩티드가 공중합된 복수개의 베타-시트 폴리펩티드 블록 공중합체가 비공유 결합에 의해서 탄소나노튜브 표면의 전부 또는 일부를 감싸고, 상기 소수성 폴리펩티드 부분은 상기 탄소나노튜브 표면과 결합하고, 상기 친수성 폴리펩티드 부분은 양전하를 띠면서 외곽 표면층으로 노출되며, 상기 친수성 폴리펩티드는 라이신, 글라이신, 아르기닌, 프롤린, 글루타민 및 세린 중에서 선택되는 1종 이상의 아미노산이 복수개로 반복되어 이루어지고, 상기 소수성 폴리펩티드는 페닐알라닌, 라이신 및 글루탐산 중에서 선택되는 1종 이상의 아미노산이 복수개로 반복되어 이루어지는 것을 특징으로 하는 베타-시트 폴리펩티드 블록 공중합체-탄소나노튜브 수용성 복합체를 제공한다.
본 발명에 따른 자기조립 시스템에서는 두 가지의 경쟁적인 힘, 즉 β-시트 부분 사이의 인력과 β-시트 부분 및 CNT 사이의 인력이 균형을 이루어야 한다. 전자가 우세할 경우, 펩티드는 β-시트 나노구조의 형성에 참여하지만 CNT는 수용액 내에 불용 상태로 남게 된다. 한편, 후자가 우세할 경우, 생체활성 β-시트 폴리펩티드 블록 공중합체에 의해 비공유적으로 기능화된 수용성/생체활성 CNT가 얻어질 수 있다. 또한, 상기 경쟁적인 힘들 사이의 균형을 보다 상세하게 규명할 경우에 단백질의 이상접힘에 의한 질환에 있어 β-아밀로이드 및 관련 단백질의 제어 및 응집방지가 가능할 수도 있다.
상기 소수성 폴리펩티드는 펩티드 가닥 사이에서 베타-시트 수소결합을 형성하여 자기조립되는 것을 특징으로 하고, 상기 소수성 폴리펩티드의 페닐알라닌 잔기가 π-π 스태킹 및 소수성 상호작용을 통하여 상기 탄소나노튜브 표면과 결합하는 것을 특징으로 한다.
이와 같이, β-시트 폴리펩티드 블록 공중합체는 극성과 응집경향에 있어 매우 다른 성격을 갖는 두 부분으로 구성된다.
친수성 및 생체활성 부분(예를 들면, 하기 도 1의 청색 부분)은 세포 투과성 펩티드인 Tat를 기본으로 한다. 이 부분은 다수의 라이신 및 아르기닌을 포함하므로, 수용액 내에서 높은 전하를 띠며 극성을 갖게 된다. 자기조립 부분은 비극성 아미노산(페닐알라닌)과 극성 아미노산(라이신 및 글루탐산)이 반복되는 구조를 가지며, 펩티드 가닥 사이의 β-시트 수소결합 형성을 촉진한다. 이러한 구조를 갖는 폴리펩티드 블록 공중합체가 친수성 부분의 큰 부피와 다수의 양전하 때문에 충분히 높은 이온세기 하에서만 β-시트 나노리본 구조를 형성할 수 있다.(하기 도 1의 path 1). 염이 존재하지 않거나 이온세기가 낮은 경우, 폴리펩티드 블록 공중합체는 주로 랜덤코일의 형태로 존재한다.
본 발명의 범위가 이에 제한되는 것은 아니나, 상기 β-시트 폴리펩티드 블록 공중합체의 친수성 폴리펩티드는 하기와 같은 순으로 구성되며, 하기 실시예에 따라 펩티드를 합성하였다.
글라이신-아르기닌-라이신-라이신-아르기닌-아르기닌-글루타민-아르기닌-아르기닌-아르기닌-프롤린-프롤린-글루타민-세린-글라이신-글라이신
(Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Glu-Arg-Arg-Arg-Pro-Pro-Glu-Ser-Gly-Gly 또는 GRKKRRQRRRPPQGSGG)
또한, 상기 소수성 폴리펩티드는 하기와 같은 순으로 구성되며, 역시 하기 실시예에 따라 펩티드를 합성하였다.
페닐알라닌-라이신-페닐알라닌-글루탐산-페닐알라닌-라이신-페닐알라닌-글루탐산-페닐알라닌-라이신-페닐알라닌-글루탐산
(Phe-Lys-Phe-Glu-Phe-Lys-Phe-Glu-Phe-Lys-Phe-Glu 또는 FKFEFKFEFKFE)
본 발명은 상기 베타-시트 폴리펩티드 블록 공중합체-탄소나노튜브 수용성 복합체에 표적 바이오 물질과 반응하는 리간드 또는 리셉터를 부착시킨 것을 특징으로 하는 바이오 센서를 제공한다.
본 발명에 있어서, 표적 바이오물질 혹은 유기화합물은 리간드 또는 리셉터와 반응하여 검출되는 표적 역할을 할 수 있는 물질로서, 바람직하게는 단백질, 핵산, 항체, 효소, 탄수화물, 지질 또는 기타 바이오 분자이며, 더욱 바람직하게는 질병에 관련된 단백질, 핵산 또는 탄수화물이다.
본 발명에 있어서, 리간드 또는 리셉터는 효소기질, 리간드, 아미노산, 펩타이드, 단백질, 핵산, 지질, 코펙터 또는 탄수화물인 것을 특징으로 할 수 있다.
또한, 본 발명은 베타-시트 폴리펩티드 블록 공중합체-탄소나노튜브 수용성 복합체를 유효 성분으로 포함하는 생물학적 활성 물질의 세포내 전달용 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물은 종래에 생물학적 활성물질이 쉽게 통과할 수 없었던 세포막을 통과하여 세포 내에 직접 작용할 수 있게 한다. 따라서 본 발명의 조성물은 약물전달체계(drug delivery system)의 발전에 획기적인 계기가 될 수 있다.
본 발명의 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 유효성분을 0.0001 내지 50 중량%로 포함한다.
본 발명의 조성물은 상기 유효성분에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물은, 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 더 나아가 당해 기술분야의 적정한 방법으로 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
상기 복합체를 유효성분으로 포함하는 조성물은 정맥내(intravein), 복막내(intraperitoneal), 근육내(intramuscular), 피하내(subcutaneous), 피내(intradermal), 비내(nasal), 점막내(mucosal), 흡입(inhalation) 및 경구(oral) 등의 경로로 주입함으로써 생체 내 전달될 수 있다. 투여량은 대상의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 일일 투여량은 화합물의 경우 약 0.1 내지 100 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 0.5 내지 10 ㎎/㎏이며, 하루 일 회 내지 수 회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.
본 발명은 (a) 탄소나노튜브를 테트라하이드로퓨란에 현탁시킨 후, 원심분리하여 테트라하이드로퓨란을 증발시켜 전처리된 탄소나노튜브를 수득하는 단계 및 (b) 상기 전처리한 탄소나노튜브, 5-200 μM 베타-시트 폴리펩티드 블록 공중합체 수용액 및 10-150 mM 염화나트륨 수용액을 혼합하여 초음파처리하는 단계를 포함하는 베타-시트 폴리펩티드 블록 공중합체-탄소나노튜브 수용성 복합체의 제조방법을 제공한다.
상기 베타-시트 폴리펩티드 블록 공중합체는 친수성 폴리펩티드와 소수성 폴리펩티드가 블록 공중합된 것이며, 상기 친수성 폴리펩티드는 라이신, 글라이신, 아르기닌, 프롤린, 글루타민 및 세린 중에서 선택되는 1종 이상의 아미노산이 복수개로 반복되어 이루어지고, 상기 소수성 폴리펩티드는 페닐알라닌, 라이신 및 글루탐산 중에서 선택되는 1종 이상의 아미노산이 복수 개로 반복되어 이루어지는 것을 특징으로 한다.
이하, 바람직한 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 의하여 제한되지 않는다는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.
<실시예>
이하의 실시예에서, Fmoc-아미노산은 Novabiochem(독일)에서 구입하여 사용하였고, 아크방전법에 의해 제조된 단일벽 탄소 나노튜브(ASP-100F, "정제" 등급)는 한화나노테크(한국)에서 구입하였다. 조직배양시약은 Invitrogen(미국)에서 구입하였다.
<합성예> β-시트 폴리펩티드 블록 공중합체
(1) 합성 Rink Amide MBHA 레진 LL(Novabiochem) 상에서 표준 Fmoc 프로토콜에 따라 Tribute™ 펩티드 합성기(Protein Technologies, Inc)를 사용하여 펩티드를 합성하였고, 합성 과정에서 표준 아미노산 보호기를 사용하였다. 합성한 β-시트 폴리펩티드 블록 공중합체의 구성은 다음과 같다.
Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Glu-Arg-Arg-Arg-Pro-Pro-Glu-Ser-Gly-Gly-Phe-Lys-Phe-Glu-Phe-Lys-Phe-Glu-Phe-Lys-Phe-Glu
또는 GRKKRRQRRRPPQGSGGFKFEFKFEFKFE
(2) N-말단이 형광 표지된 펩티드의 합성을 위해, 1 ㎖의 N-메틸-2-피롤리돈(NMP)에 용해된 5-카르복시플루오레신(50 mM), HBTU(45 mM) 및 DIPEA(100 mM)를 레진에 결합된 펩티드에 가하고 밤새 반응시켰다. 이어, 레진을 NMP와 아세토니트릴로 세척하고 진공 하에서 건조하였다. 건조된 레진을 분리용액(TFA:TIS:물 = 95:2.5:2.5)으로 3 시간 동안 처리한 다음, t-부틸 메틸 에테르를 이용하여 분말화하였다. 얻어진 펩티드를 역상 HPLC(물-아세토니트릴, 0.1% TFA)로 정제하였다.
MALDI-TOF 질량분석을 통해 분자량을 측정하였다. HPLC 분석 결과 펩티드의 순도는 95% 이상이었다.
물:아세토니트릴 (1:1) 내에서, 페닐알라닌의 몰흡광계수(195 m-1㎝-1)를 이용하여 257.5 ㎚에서 농도를 분광학적으로 측정하였다.
<실험예>
(1) 원편광 이색성(CD)
펠티에 온도조절장치(Applied Photophysics., Ltd)가 구비된 Chirascan™ 원편광 이색성 분광계를 사용하여 CD 스펙트럼을 측정하였다. 스펙트럼은 2 ㎜ 경로길이의 큐벳을 사용하여 250 ㎚에서부터 190 ㎚까지 측정하였다. 5회 반복 측정하여 평균값을 기록하였다. 각 아미노산 잔기에 대하여 몰 타원율을 계산하였다. 측정에 앞서, SWCNT가 포함된 또는 포함되지 않은 5 μM 펩티드 용액을 20 mM 또는 60 mM NaCl로 실온에서 12 시간 동안 처리하였다.
(2) 투과전자현미경 분석(TEM)
2 ㎕의 샘플을 탄소 코팅한 구리격자 상에서 완전히 건조시켰다. 이어, 2 ㎕의 물을 1 분간 가하여 결합되지 않은 펩티드를 용해시키고 여과지를 이용하여 제거하였다. JEOL-JEM 2010 기기를 사용하여 150 ㎸에서 샘플을 관찰하였다. 얻어진 데이터를 Digital Micrograph™ 소프트웨어를 이용하여 분석하였다.
(3) 동적 광산란 (DLS)
DLS 실험은 632.8 ㎚의 He-Ne 레이저가 구비된 ALV/CGS-3 Compact Goniometer System을 사용하여 실온에서 수행하였다. 검출에는 광섬유가 연결된 ALV/SO-SIPD/DUAL 검출장치, EMI PM-28B 전원장치 및 ALV/PM-PD 프리앰프/판별장치를 사용하였다. 신호 분석장치로는 지수적으로 배치된 288 개의 채널을 구비한 ALV-5000/E/WIN 멀티플타우 디지털 코릴레이터를 사용하였다. 산란각은 90°였다. 크기분포는 강제조정법에 의해 결정하였다.
(3) 형광 스펙트럼분석
Hitachi F-4500 형광분광계와 1 ㎝ 경로길이의 석영 큐벳을 사용하여 정상상태 형광스펙트럼을 기록하였다. 50 mM NaCl 용액 내의 펩티드 농도는 5 μM으로 하였다. 페닐알라닌 잔기로부터 방출되는 형광을 측정하기 위하여, 샘플을 257 ㎚에서 여기시켰다. 여기용 및 방출용 슬릿은 공칭 밴드패스가 10 ㎚인 것을 사용하였다.
(4) 조직배양 및 세포 내 전달 실험
β-시트 폴리펩티드 블록 공중합체/SWCNT 복합체의 세포 내 전달을 현미경으로 관찰하기 위하여, HeLa 세포(4×105)를 8-웰 Lab-tek Ⅱ 챔버 커버글래스 시스템(Nunc)에 분주하고 10% FBS을 포함하는 DMEM을 사용하여 37 ℃에서 밤새 배양하였다. 세포를 DPBS로 세척한 다음, 펩티드/SWCNT 복합체로 20 분 동안 처리하였다. 이어, 샘플 용액을 제거하고, DMEM 내에서 90 분 동안 세포를 더 배양하였다. 이미지 촬영에 앞서, 50 nM 농도의 LysoTracker Red DND-99(Invitrogen)를 5 분간 가하였다. 아르곤(488 ㎚) 및 헬륨-네온(543 ㎚) 레이저가 구비된 Nikon Eclipse TE2000-U 도립현미경을 사용하여 공초점 이미지를 촬영하였다.
실험예 1.
먼저, β-시트를 형성할 수 있는 이 펩티드가 SWCNT와 결합하여 순수한 물 내에서 SWCNT를 가용화할 수 있는지 확인하였다.
아크 방전법을 통해 제조한 SWCNT를 테트라하이드로퓨란(THF)에 현탁하고 동량(5 ㎍)의 SWCNT를 마이크로 원심분리튜브에 가하였다. THF가 증발한 후, 폴리펩티드 블록 공중합체 용액(0.3 ㎖)을 가하고, 그 혼합물을 실온에서 15 분 동안 초음파 처리하였다.
하기 도 2(a)와 2(b)에서 보는 바와 같이, 펩티드의 농도가 증가함에 따라 SWCNT가 가용화되었다. 펩티드 농도가 약 12.5 mM에 이르자 대부분의 SWCNT가 현탁되었다(하기 도2(c)). 이러한 결과로부터, 폴리펩티드 블록 공중합체의 페닐알라닌 잔기가 소수성 및 π-π 스태킹 상호작용을 통해 SWCNT와 결합하고, 라이신과 아르기닌 함량이 높은 친수성 부분은 수용액과 상호작용하여 펩티드/SWCNT 복합체의 용해를 돕는다는 것을 알 수 있다(하기 도 1).
또한, 제타포텐셜(ζ) 측정 결과, 펩티드/SWCNT 복합체는 큰 양의 값(+58 ±3 ㎷)을 가지는 것으로 나타났는데, 이로부터 펩티드/SWCNT 복합체 외곽층의, 양전하를 띠는 친수성 부분이 노출되어 양전하를 갖는 표면이 형성됨을 알 수 있다.
실험예 2.
이어, 이온 세기가 펩티드/SWCNT 복합체의 형성에 미치는 영향을 확인하였다.
NaCl의 농도를 높이자 폴리펩티드 블록 공중합체 용액의 β-시트 함량이 증가하였으며, 염농도 약 50-60 mM에서 증가가 멈추었다(하기 도 5 참고). 이러한 결과를 바탕으로, 이온 세기가 SWCNT의 가용화에 미치는 영향을 조사하였다. 펩티드의 농도는 순수한 물 내에서 5 ㎍의 SWCNT를 가용화기에는 불충분한 양인 5 μM으로 하여 실험하였다(하기 도 2(c)의 가운데 이미지).
하기 도 3(a)(왼쪽)에서 보듯이, 펩티드(5 μM)와 SWCNT의 혼합물은 순수한 물에서 큰 과립 형태의 SWCNT를 보였는데, 이로써 가용화가 불충분하다는 것을 알 수 있다. 염을 가하고(50 mM) 용액을 볼텍싱하자, 과립의 크기가 작아졌다(하기 도 3(a)의 오른쪽). 두 혼합물을 초음파 처리하자 큰 차이를 보였다. 순수한 물 내의 혼합물의 경우 공기-물 계면에서 크기가 큰 불용성 SWCNT 응집체가 형성된 반면(하기 도 3(b)의 왼쪽), 염존재 하의 SWCNT는 거의 완전히 가용화되었다(하기 도 3(b)의 오른쪽).
따라서, 이러한 결과로부터 이온세기가 높을 경우 SWCNT의 가용화가 촉진됨을 알 수 있다. 폴리펩티드 블록 공중합체가 염농도 50 mM에서 안정한 β-시트 나노리본 구조를 형성하는 것을 감안할 때(하기 도 5), β-시트 부분과 SWCNT 사이의 인력이 β-시트 부분들 사이의 인력보다 강하며, 펩티드/SWCNT 조합 자기조립 과정이 β-시트의 형성보다 빠르게 진행된다는 것을 알 수 있다. 펩티드 및 펩티드/SWCNT 복합체에 대한 CD 스펙트럼 측정결과도 이를 뒷받침한다. 215 ㎚에서 타원율의 음의 최대값이 크게 감소하였는데, 이로부터 SWCNT의 존재가 β-시트의 형성을 방해함을 알 수 있다(하기 도 3(c)). 복합체가 형성되면서 페닐알라닌의 형광피크가 사라진 점 역시, β-시트 부분과 SWCNT 사이의 강한 인력과 펩티드가 SWCNT에 직접 결합한다는 것을 확인시켜 준다(하기 도3(d)).
실험예 3.
TEM 이미지로부터 이온세기가 펩티드/SWCNT 복합체의 형성에 미치는 영향을 더욱 분명하게 확인하였다.
순수한 물 내에서 SWCNT가 안정한 상태로 잘 분산된 것처럼 보였지만, 형성된 복합체는 조건에 따라서 SWCNT 응집을 보일 수도 있음을 확인하였다(하기 도 3(e), 하기 도 1의 path 2). 이와는 대조적으로, 염 존재 하에서 복합체를 형성한 경우, 대부분의 SWCNT가 응집되지 않은 상태였다(하기 도 3(f), 하기 도 1의 path 3).
따라서, 염의 존재가 페닐알라닌과 SWCNT 사이의 소수성 상호작용을 더욱 강화시키고 펩티드들 사이의 비특이적, 전기적 상호작용을 차단하여, SWCNT의 효과적인 가용화 및 응집 억제에 기여함을 알 수 있다.
실험예 4.
이미 조립된 β-시트 나노리본이 SWCNT 존재 하에 분해되어 CNT를 가용화할 수 있는지를 조사하였다(하기 도 1의 path 4, 5).
그 결과, β-시트 나노리본이 이미 형성된 후에는, 충분한 초음파 처리를 한 후에도 SWCNT를 펩티드로 가용화 및 기능화할 수 없음을 확인하였다.
상기의 실험예를 종합하면, β-시트 펩티드와 CNT의 조합 자기조립 과정에서 두 가지 중요한 사실을 알 수 있다.
첫째로, β-시트 펩티드들 사이의 결합이 약하거나 펩티드가 자기조립의 초기단계에 있을 경우, 하기 도 1의 path 2와 3을 조합함으로써 β-시트 폴리펩티드 블록 공중합체로 기능화된 생체활성 CNT를 제조할 수 있다.
둘째로, 단백질의 이상접힘에 의한 질환에서 나타나는 아밀로이드 섬유의 형성을 억제하는 방안을 모색할 수 있을 것이다. 즉, 탄소의 동소체(예컨대, CNT와 풀러렌)가 아밀로이드의 형성을 억제할 수 있는데, 이미 조립된 β-시트 나노리본을 분해하는 것(path 4, 5)이 어렵다는 점을 감안할 때, 탄소 기반 아밀로이드 억제제 개발의 주된 타겟은 아밀로이드 섬유 형성의 초기단계에서 생성되는 원섬유종과 같은 중간조립체가 될 것이다.
실험예 5.
path 3에 의해 제조된 펩티드/SWCNT 복합체의 세포전달물질로의 이용 가능성을 모색하기 위하여, 우리는 포유동물 세포 내에서 복합체의 상호작용을 조사하였다.
복합체는 세포 투과성 펩티드인 Tat로 수식되어 있으므로 세포 내로 쉽게 진입한다. Tat는 세포의 세포막과 핵막을 통과한다. 복합체를 가시화하기 위하여, 플로오레신으로 표지한 펩티드와 표지하지 않은 펩티드를 1 : 50의 몰비로 혼합하고, 그 펩티드 혼합물을 이용하여 SWCNT를 기능화하였다.
하기 도 4(a)에서 보듯이, 복합체는 세포질 전체에 걸쳐 분포되어 있었다. 따라서, 복합체가 세포 내로 효과적으로 전달됨을 알 수 있다. 복합체의 녹색 형광과 LysoTracker(살아있는 세포의 산성 소기관 표지에 이용되는 프로브)의 적색 형광으로부터, 엔도시토시스 작용에 의해 복합체가 세포 내로 진입하는 것을 알 수 있다(하기 도 4(c)). Tat 펩티드는 단독으로도 세포질 내뿐 아니라 핵 이동 작용에 의해 핵과 인 안으로 진입할 수 있다. 그러나, Tat 펩티드의 핵 이동 작용에도 불구하고 복합체가 주로 세포질에 분포한다는 것은 복합체의 크기가 커서 핵공복합체(NPC)를 통과하지 못하는 것일 수 있음을 시사한다. 이러한 결과로부터 펩티드가 세포 내에서 SWCNT에 결합된 상태로 존재한다는 것을 알 수 있는데, 이것은 복합체가 안정하다는 것을 의미한다.
이와 같이, 생체활성 β-시트 폴리펩티드 블록 공중합체와 CNT의 조합 자기조립 과정에서 여러 개의 상이한 모드가 관련됨을 확인하였다. 생체활성 β-시트 폴리펩티드 블록 공중합체는 스스로 자기조립할 수 있으며, 경우에 따라서는 CNT-복합체의 기능화에도 이용될 수 있다. 이것은 생체활성 β-시트 폴리펩티드 블록 공중합체의 응용범위를 넓히는 데 있어 중요한 의미를 갖는다. 생체활성 β-시트 폴리펩티드 블록 공중합체/CNT 복합체는 자극 반응성 바이오 소재로서 또는 CNT 기반 전자 바이오 센서 장치의 제작에 사용될 수 있다. 또한, β-시트 펩티드와 탄소 기반 소수성 물질 사이의 상호작용에 대한 이해는 단백질의 이상접힘에 의한 질환에 대한 억제제의 설계 및 개발에도 유용할 것으로 기대된다.

Claims (12)

  1. 베타-시트 폴리펩티드 블록 공중합체 및 탄소나노튜브와의 복합체로서,
    상기 베타-시트 폴리펩티드 블록 공중합체는 소수성 폴리펩티드 블록 및 친수성 폴리펩티드 블록으로 이루어지고,
    상기 소수성 폴리펩티드 블록은 비극성 아미노산 및 제1 극성 아미노산이 서로 반복되는 구조를 가지고,
    상기 친수성 폴리펩티드 블록은 친수성 폴리펩티드 블록을 이루는 아미노산의 55-100%가 제2 극성 아미노산으로 이루어지며,
    상기 소수성 폴리펩티드 블록은 상기 탄소나노튜브 표면과 비공유 결합을 하고,
    상기 친수성 폴리펩티드 블록은 양전하를 띠면서 상기 복합체 외곽으로 노출되는 것을 특징으로 하는 베타-시트 폴리펩티드 블록 공중합체 및 탄소나노튜브와의 복합체.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 친수성 폴리펩티드 블록은 친수성 폴리펩티드 블록을 이루는 아미노산의 55-100%가 친수성 아미노산으로 이루어지고,
    상기 비극성 아미노산은 페닐알라닌(phenylalanine), 알라닌(alanine), 발린(valine), 이소류신(isoleucine), 류신(leucine), 메치오닌(methionine), 티로신(tyrosine) 및 트립토판(tryptophan) 중에서 선택되고,
    상기 제1 극성 아미노산 및 상기 제2 극성 아미노산은 각각 독립적으로 페닐알라닌(phenylalanine), 알라닌(alanine), 발린(valine), 이소류신(isoleucine), 류신(leucine), 메치오닌(methionine), 티로신(tyrosine) 및 트립토판(tryptophan) 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 베타-시트 폴리펩티드 블록 공중합체 및 탄소나노튜브와의 복합체.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 비극성 아미노산은 페닐알라닌이고, 상기 제1 극성 아미노산은 라이신 또는 글루탐산인 것을 특징으로 하는 베타-시트 폴리펩티드 블록 공중합체 및 탄소나노튜브와의 복합체.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 소수성 폴리펩티드 블록은 펩티드 가닥 사이에서 베타-시트 수소결합을 형성하여 자기조립을 형성하고, 상기 페닐알라닌이 상기 탄소나노튜브 표면과 π-π 스태킹 및 소수성 상호작용을 통하여 비공유 결합을 형성하는 것을 특징으로 하는 베타-시트 폴리펩티드 블록 공중합체 및 탄소나노튜브와의 복합체.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 친수성 폴리펩티드 블록은 글라이신-아르기닌-라이신-라이신-아르기닌-아르기닌-글루타민-아르기닌-아르기닌-아르기닌-프롤린-프롤린-글루타민-세린-글라이신-글라이신의 아미노산 서열을 포함하고,
    상기 소수성 폴리펩티드 블록은 페닐알라닌-라이신-페닐알라닌-글루탐산의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 베타-시트 폴리펩티드 블록 공중합체 및 탄소나노튜브와의 복합체.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 베타-시트 폴리펩티드 블록 공중합체 및 탄소나노튜브와의 복합체, 및
    상기 베타-시트 폴리펩티드 블록 공중합체 및 탄소나노튜브와의 복합체에 표적 바이오 물질과 반응할 수 있는 리간드 또는 리셉터가 부착된 것을 특징으로 하는 바이오 센서.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 리간드 및 리셉터는 각각 독립적으로 효소기질, 리간드, 아미노산, 펩티드, 단백질, 효소, 지질, 코펙터, 탄수화물 및 이들 2종의 조합인 것을 특징으로 하는 바이오 센서.
  8. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 베타-시트 폴리펩티드 블록 공중합체 및 탄소나노튜브와의 복합체를 유효 성분으로 포함하는 생물학적 활성 물질의 세포내 전달용 조성물.
  9. (a) 탄소나노튜브 현탁액에서 현탁 용매를 제거함으로써 전처리된 탄소나노튜브를 수득하는 단계; 및
    (b) 상기 전처리된 탄소나노튜브를 베타-시트 폴리펩티드 블록 공중합체 수용액에 추가하여 분산액을 수득하는 단계;를 포함하는 베타-시트 폴리펩티드 블록 공중합체 및 탄소나노튜브와의 복합체의 제조방법.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 분산액은 염을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 베타-시트 폴리펩티드 블록 공중합체 및 탄소나노튜브와의 복합체의 제조방법.
  11. 제 9 항에 있어서,
    상기 (a) 단계의 상기 현탁 용매는 테트라 하이드로 퓨란이고, 상기 현탁 용매는 원심분리 방법에 의해서 제거되는 것을 특징으로 하는 베타-시트 폴리펩티드 블록 공중합체 및 탄소나노튜브와의 복합체의 제조방법.
  12. 제 10 항에 있어서,
    상기 염의 상기 분산액 내 농도가 10-150 mM이고, 상기 분산액은 초음파 방법을 이용하여 제조되는 것을 특징으로 하는 베타-시트 폴리펩티드 블록 공중합체 및 탄소나노튜브와의 복합체의 제조방법.
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