KR101712270B1 - 탄소 나노튜브-고분자 복합체 전극 및 이를 이용한 dna의 전기화학적 검출방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 표면 개질이 없이도 DNA를 직접적으로 검출할 수 있으며 재사용이 가능한 전기화학 측정용 탄소 나노튜브-고분자 복합체 전극 및 이를 이용한 DNA의 전기화학적 검출방법에 관한 것이다.
본 발명의 탄소 나노튜브-고분자 복합체 전극은 DNA와 탄소나노튜브 간의 파이-파이 결합을 통해 DNA를 검지할 수 있으며, 재사용이 가능하다.
본 발명의 탄소 나노튜브-고분자 복합체 전극은 프로브 고정이나 표면 개질이 요구되지 않고 용액 공정으로만 수행되므로 제조공정이 매우 간단하고 경제적이다. 또한, 본 발명의 탄소 나노튜브-고분자 복합체 전극은 유연성, 신축성 및 점착성이 우수하여 플렉시블한 전극으로 사용될 수 있으며, 금 전극에 비해 제조비용도 간단하다.

Description

탄소 나노튜브-고분자 복합체 전극 및 이를 이용한 DNA의 전기화학적 검출방법{Carbon nanotube-polymer composite electrodes and Electrochemical Method for Detecting DNA using the same}

본 발명은 탄소 나노튜브-고분자 복합체 전극 및 이를 이용한 DNA의 전기화학적 검출방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 표면 개질이 없이도 DNA를 직접적으로 검출할 수 있으며 재사용이 가능한 전기화학 측정용 탄소 나노튜브-고분자 복합체 전극 및 이를 이용한 DNA의 전기화학적 검출방법에 관한 것이다.

최근, 인간의 유전자나 단백질 및 세포 등 나노단위의 생체분자 거동을 직접적으로 확인하고 조작할 수 있는 나노-바이오 기술에 대한 연구가 활발하게 이루어지고 있다. 특히, 나노-바이오 기술은 질병을 진단, 분석하고 신약 개발을 위한 임상 검사를 빠르고 간단하게 수행할 수 있는 나노바이오칩으로 구체화되어 빠르게 우리 일상과 의료현장으로 다가오고 있다.

나노-바이오 기술을 가능하게 하는 새로운 도구(tool)라고 할 수 있는 나노바이오칩은 나노 단위의 생체 시료의 분석을 통해 DNA, 단백질 및 세포 등의 반응 메커니즘을 직접 분석함으로써 빠르고 정확하게 미세 생체분자의 현상을 파악할 수 있다는 장점이 있다.

나노스케일의 생체분자에 대한 다양한 정보를 얻기 위해서는 무엇보다 생체분자 자체에 대한 안정성의 확보가 필요하다. 즉, 외부로부터의 자극에 의한 비특이적인 반응을 원천적으로 봉쇄하고 특정 자극에 대해서만 반응할 수 있도록 안정된 조건을 유지할 수 있어야 한다. 이러한 비특이적인 반응은 물질의 특성 변화를 일으키게 되고, 결국 왜곡된 정보(noise)를 제공하게 되므로 나노스케일에서 생체분자의 분석 및 진단에 있어 많은 제약을 가져온다.

DNA센서는 포인트 케어 의료 분석, 게놈 조사 및 법의학 등에 적용되고 있다. DNA 탐침용으로 전기화학적 방법이 광법위하게 사용되고 있는데, 이것은 생물학적 정보를 전류 흐름으로 직접 변환 가능하므로 심플하면서도 정확하다.

현재, 전기화학적 DNA센서의 가동 전극으로 금 전극을 많이 사용하고 있다. 그러나 금 전극은 제조비용이 높아 상업화에 어느 정도 한계가 있다. 금 전극의 고비용을 해소하고자 탄소 기반의 전극으로 금 전극을 대체하려는 시도가 있다. 예를 들면, GLASSY 탄소 전극(GCEs)이 많이 사용되고 있다. 하지만, DNA를 탐지하기 위해 GCEs 전극 표면에 DNA를 고정하기 위해 특정 기능기를 부착하거나 피롤, 탄소나노튜브, 금 나노입자와 같은 물질들로 코팅을 하여야 한다. 또한, 이러한 공정은 프로브를 고정하기 위한 공정이 추가로 더 필요하다. 결국, DNA 탐침용 GCEs 전극 제조 공정은 공정이 복잡하고 노동집약적이고 많은 제조시간이 요구된다.

CNT는 전기적, 화학적, 기계적으로 독특한 특성을 가지고 있어 전계효과 트랜지스터 형태의 DNA 센서나 전하 이송 물질로 사용하고 있다. 그러나, 표면 개질 없이 탄소 나노튜브 전극이 DNA 탐침을 위한 분석기로 직접적으로 연결(사용)되는 경우는 없었다. 이것은 CNT 표면이 화학적으로 불활성이어서 그 표면에서 생물학적 반응을 검지하기에는 적합하지 않기 때문이다.

본 발명은 탄소나노튜브의 표면 개질이나 프로브 고정없이도 전기화학적 방법으로 표적 DNA를 검출할 수 있는 전극 및 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 유연성, 신축성 및 점착성이 우수하면서도 제조공정이 간단하고 효율적인 DNA를 검지용 전극 및 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 하나의 양상은

연성 고분자층과 탄소 나노튜브 층을 압착하여 열처리하여 제조되고, 상기 탄소 나노튜브는 그 표면이 개질되지 않은 불활성 상태를 유지하는 탄소 나노튜브-연성 고분자 복합체 전극으로서, 상기 전극의 탄소 나노튜브 표면에 단일 가닥의 DNA가 π-π 스태킹되어 흡착되는 탄소 나노튜브-연성 고분자 복합체 전극에 관계한다.

다른 양상에서 본 발명은 상기 탄소 나노튜브-연성 고분자 복합체 전극을 샘플 용액에 침지하는 단계 ; 및 상기 용액의 전기화학 신호를 측정하는 단계를 포함하고, 상기 샘플용액은 완충용액에 프로브 DNA, 염료 및 타겟 DNA를 포함하는 DNA의 전기화학적 검출방법에 관계한다.

본 발명의 탄소 나노튜브-고분자 복합체 전극은 탄소나노튜브를 표면 개질되지 않은 상태에서 DNA를 직접적으로 검출할 수 있는 전기화학적 분석기로 사용될 수 있다. 본 발명의 탄소 나노튜브-고분자 복합체 전극은 DNA와 탄소나노튜브 간의 파이-파이 결합을 통해 DNA를 검지할 수 있으며, 재사용이 가능하다.

본 발명의 탄소 나노튜브-고분자 복합체 전극은 종래 카본 나노튜브 전극이나 GCEs 전극에서 요구되는 프로브 고정이나 표면 개질이 요구되지 않고 용액 공정으로만 수행되므로 제조공정이 매우 간단하고 경제적이다. 또한, 본 발명의 탄소 나노튜브-고분자 복합체 전극은 유연성, 신축성 및 점착성이 우수하여 플렉시블한 전극으로 사용될 수 있으며, 금 전극에 비해 제조비용도 간단하다.

본 발명의 전기화학적 검출방법은 고정화에 필요한 물질을 첨가하지 않아도 되는 등 검출 방법이 간단하면서도 빠르게 표적 DNA를 검출할 수 있다.

도 1은 상기 탄소 나노 튜브-연성 고분자 복합체 전극의 제조방법을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 전기화학 측정방법을 이용한 DNA 측정 장치의 일예이다.
도 3은 탄소나노튜브, 프로브 DNA, 염료 및 타겟 DNA들간의 상호작용을 보여주는 모식도이다.
도 4는 실시예 1에서 제조한 MWCNT-PDMS-glass 복합체 전극을 6× 12mm로 절단한 것이다.
도 5의 A는 실시예 1에서 가열 가압하기 전의 탄소나노튜브의 SEM 이미지이고, 도 5의 B는 가열 가압한 후의 SEM 이미지이다.
도 6은 실시예 2의 DPV(Differential pulse voltammetry) 측정 결과를 보여주는 그래프이다.
도 7은 세척을 통해 대부분의 염료, DNA가 제거되므로 MWCNT-PDMS-glass 전극을 재사용할 수 있음을 보여주는 DPV 그래프이다.

도 1은 상기 탄소 나노 튜브-연성 고분자 복합체 전극의 제조방법을 나타낸 것이다. 도 1을 참고하면, 본 발명의 탄소나노튜브-연성 고분자 복합체 전극은 상기 탄소나노튜브를 용매에 분산시키는 단계, 탄소나노튜브 층(10)을 형성하는 단계, 유리기판(30)위에 연성 고분자층(20)을 형성하는 단계, 탄소나노튜브 층과 연성고분자층을 접촉한 후 가압 가열하는 단계를 포함하여 제조될 수 있다.

먼저, 분산은 소정량의 탄소나노튜브를 용매에 넣어 혼합하는 단계이다. 용매는 이소프로필 알코올을 사용할 수 있다.

상기 탄소나노튜브층(10)은 분산액을 접시(Petri dish)에 떨어뜨린 후 건조시켜 형성할 수 있다. 바람직하게는, 상기 분산액을 소정량씩 몇 차례에 걸쳐 나누어 접시에 떨어뜨려 각각 건조시키면 균일한 탄소나노튜브층을 얻을 수 있다.

연성고분자층(20)은 연성고분자와 경화제를 소정비로, 예를 들면 10 : 1로 혼합한 후, 상기 혼합물을 유리 기판위에 떨어뜨린 후 경화하여 제조할 수 있다.

다음으로, 본 발명은 탄소나노튜브 층과 연성고분자층을 접촉한 후 가압 가열하는 단계를 포함한다. 예를 들면, 두 개의 층에 10~15kPa을 가하며 15분~2시간 정도 80~100도에서 가열한다. 이 후, 5~20 시간 동안 100도 이하로 열처리할 수 있다.

상기 접시에서 탄소나노튜브-연성고분자-유리기판으로 이루어진 복합체를 분리시키면 본 발명의 전극을 수득할 수 있다.

상기 유리기판을 제거하면 본 발명의 탄소나노튜브-연성고분자 복합체 전극을 수득할 수 있다.

본 발명의 탄소나노튜브-연성 고분자 복합체 전극은 연성 고분자층(10)과 탄소나노튜브층(20)을 포함한다.

상기 연성 고분자층(20)은 당업계에서 통상적으로 사용되는 임의의 재질, 실리콘 웨이퍼, PDMS(polydimethylsiloxane), 플라스틱 등 대부분의 재질이 사용될 수 있다.

상기 탄소나노튜브는 단일벽, 다중벽, 탄소나노섬유 중에 적어도 하나를 포함하여 선택될 수 있다.

상기 탄소나노튜브 두께는 0.5~30㎛, 연성고분자층 두께는 5~3000㎛일 수 있다.

상기 복합체 전극은 탄소나노튜브와 연성고분자 특성에 의해 유연하고 신축성 있으며, 접착성이 우수하다.

상기 복합체 전극의 탄소 나노튜브는 그 표면이 개질되지 않은 불활성 상태를 유지하므로 그 표면에 단일 가닥의 DNA가 π-π 스태킹되어 흡착될 수 있다.

본 발명의 탄소 나노튜브-고분자 복합체 전극은 DNA를 직접적으로 검출할 수 있는 전기화학적 분석기로 사용될 수 있으며, 분석 용액 대비 안정적이고 재사용이 가능하다. 본 발명의 탄소 나노튜브-고분자 복합체 전극은 용액 공정으로만 수행되어 제조되므로 공정이 매우 간단하고 경제적이다.

다른 양상에서, 본 발명은 상기 탄소 나노튜브-고분자 복합체 전극을 용액에 침지하는 단계 및 전기화학적 신호를 측정하는 단계를 포함하는 DNA의 전기화학적 검출방법에 관계한다.

본 발명은 상기 탄소 나노튜브-고분자 복합체 전극을 이용하여 DNA를 전기화학적으로 검출할 수 있다.

도 2는 본 발명의 전기화학 측정방법을 이용한 DNA 측정 장치의 일구현예이다. 상기 측정장치는 용기에 샘플용액이 담겨져 있고, 여기에 상대전극(CE)으로 백금전극, 가동전극(WE)으로 앞에서 제조한 탄소 나노튜브-고분자 복합체 전극, 기준전극(RE)으로 Ag/AgCl 전극이 침지되어 고정된다.

또한, 본 발명의 DNA 측정장치는 백금전극이나 Ag/AgCl 전극을 사용하지 않고도, 상기 탄소 나노튜브-연성 고분자 복합체 전극 3개를 샘플 용액에 침지시키는 방식으로도 타겟 DNA의 염기서열 일치여부를 측정할 수 있다.

상기 샘플용액은 완충용액에 프로브 DNA, 염료 및 타겟 DNA가 혼합된다.

상기 전기화학적 신호를 측정하는 단계는 상기 용액, 특히 염료의 전기화학 신호를 측정하는 단계이다.

도 3은 탄소나노튜브, 프로브 DNA, 염료 및 타겟 DNA들간의 상호작용을 보여준다. 먼저 프로브 DNA를 상기 탄소 나노튜브-고분자 복합체 전극이 들어 있는 용액에 주입하여 소정시간 방치하면 프로브 DNA가 탄소나노튜브와 π-π 스태킹되어 흡착된다. 여기에 도 3A와 같이, 상기 프로브 DNA와 상보적이지 않은 타겟 DNA(T3)을 첨가하면, 이중나선 DNA가 형성되지 않고 프로브 DNA와 타겟 DNA(T3)가 각각 탄소나노튜브 표면에 흡착되어 잔존한다. 즉, 상기 타겟 DNA와 프로브 DNA는 단일나선 구조를 가지고 있어, 탄소나노튜브 전극의 표면에 비공유 π-π스태킹과 소수성 상호작용으로 흡착된다. 여기에 염료를 첨가하면 염료 분자는 파이-파이 상호작용을 통해 전극 표면에 흡착될 수 있고, 또한, 양전하를 띈 염료는 전극 표면에 흡착된 단일 나선 DNA의 인산염(Phosphate, 음전하를 띄는)에 쿨롱 결합되므로 전극 표면에서 염료의 농도가 증가된다.

도 3A를 참고하면, 탄소나노튜브의 불활성 표면이 화학적으로 탐지층으로 사용될 수 있음을 보여준다. 또한, π-π 상호작용이 탄소나노튜브 곡면으로 인해 다소 감소될 수 있어도, 여전히 π-π 상호 작용은 DNA를 센싱할 수 있을 정도로 충분히 강하다.

상기 염료는 메틸렌 블루(methylene blue)일 수 있다.

즉, 본 발명의 상기 샘플 용액 속에 타겟 DNA와 프루브 DNA가 미스매치 되는 경우, 상기 염료의 양이 증가되고 더 높은 전기화학적 신호가 나타난다.

상기 전기화학적 신호의 측정은 DPV(differential pulse voltammetry) 또는 CV(cyclic voltammetry)일 수 있다. 또한, 상기 DPV(differential pulse voltammetry) 또는 CV(cyclic voltametry)는 10 - 2000 mV/s로 수행될 수 있다.

도 3B를 참고하면, 프로브 DNA를 상기 탄소 나노튜브-고분자 복합체 전극이 들어 있는 용액에 주입하여 소정시간 방치하면 프로브 DNA가 탄소나노튜브와 π-π 스태킹되어 흡착된다. 도 3A와 달리, 타겟 DNA(T1)와 프로브 DNA가 서로 상보적인 경우, 타겟 DNA와 프로브 DNA가 서로 혼성화되어 이중 나선 구조를 형성한다. 이 때, DNA와 탄소나노튜브 사이의 π-π 결합이 약해짐에 따라 이중 나선 DNA는 전극 표면에 흡착되지 않고 분리된다. 여기에 염료를 주입하는 경우, 염료의 일부가 탄소나노튜브 전극 표면에 결합하지만, 상당수 양은 이중나선 DNA(dsDNA) 내측에 삽입되어 dsDNA와 같이 전극 표면에 흡착되기 보다는 용액에 분산된다. 따라서, 이 경우, 전극 근처에서의 염료(MB)농도가 도 3A에 비해 증가하지 않는다.

결과적으로, 상보적인 타켓과 프로브가 혼합된 샘플 용액보다 비상보적인 프로브와 타겟이 함유된 샘플 용액인 경우에 있어서 전극 근처의 염료 농도가 높으므로 더 높은 전류 피크를 발생시킨다.

본 발명의 DNA 검출방법은 상기 타겟 DNA가 상기 프로브 DNA와 상보적이지 않은 경우 전극 근처의 염료 농도가 증가하여 높은 전류 피크를 발생시킬 수 있다. 본 발명의 DNA 검출방법은 이러한 전류피크 차이를 분석하여 타겟 DNA와 프로브 DNA가 상보적인지 여부를 판단할 수 있다.

이하, 본 발명을 첨부된 실시예 및 도면을 참조하여 자세히 설명한다. 그러나 첨부된 실시예는 본 발명의 구체적인 실시태양을 예시할 뿐, 본 발명의 권리범위를 이에 한정하려는 의도는 아니다.

실시예 1

1) 먼저 16mg의 MWCNT를 20 mL의 IPA(이소프로필알콜)에 분산시켰다.

2) 분산액을 Petri dish에 10mL 떨어뜨리고 95도에서 1시간 건조시키고, 이후 4, 3, 1 mL를 떨어뜨린 후 30분씩 건조하였다.

3) PDMS 엘라스토머와 경화제를 10:1로 혼합하고, 상기 혼합물을 유리기판 위에 떨어뜨려 도포한후 경화하였다. PDMS를 MWCNT에 접촉한 후 11.2 kPa을 가하며 30분간 95도에서 가열하고, 10.5h간 95도에서 annealing 하였다.

4) Petri dish에서 MWCNT-PDMS-glass를 벗겨낸다.

5) Flexible electrode를 만들 때는 MWCNT와 glass를 벗겨낸다.

제조된 MWCNT-PDMS 층의 두께는 각각 5.9㎛, 95.5㎛이다.

실시예 2

먼저 P1 프로브 800nM을 PBS 완충용액 1ml에 첨가하였다(3개 용기).

10분 후에 800nm 타겟(T1, T2, T3, 하기 표 1에 나타냄)을 각 3개의 용액에 첨가하였다. 프로브와 타겟의 상호반응을 위해 20분 정도 방치하고, 상기 용액에 15.632μ의 MB를 첨가하였다. 샘플 용액이 30분 정도 상온에서 저장한 후 도 2와 같이 전기화학적 실험을 수행하였다.

앞에서 제조한 MWCNT-PDMS-glass 전극이 전기화학 분석기의 가동 전극으로 사용되고, Ag/AgCl 전극과 백금 와이어는 각각 기준전극과 보조전극으로 사용된다. MWCNT-PDMS-glass전극과 다른 두 개 전극은 셀내부에 전극 반 정도로 잠기게 고정하였다. -0.4~0V, 스위프율(sweep rate) 0.0004V/s로 DPV, CV 측정을 하였다. DNA 측정을 위한 전기화학적 신호는 1시간 이내에 얻을 수 있다.

Type	Name	Sequence (5'→3')	Mismatches between probe and target sequences
Probe	P1	GTG TTG TCT CCT AGG TTG GCT CTG
Target	T1	CAG AGC CAA CCT AGG AGA CAA CAC	비교예 1 None(상보적임)
Target	T2	CAG AGC CAA CCT CGG AGA CAA CAC	비교예 2 One base-pair
Target	T3	ATA TCG ACC TTG GCC GAG ACG GTG	실시예 1 All base-pairs (상보적이지 않음)

도 4는 실시예 1에서 제조한 MWCNT-PDMS-glass 복합체 전극을 6× 12mm로 절단한 것이다. 도 4를 참고하면, 실시예 1에서 제조된 전극은 유연성이 있어 플렉시블 소자에 적용될 수 있음을 알 수 있다.

도 5의 A는 실시예 1에서 가열 가압하기 전의 탄소나노튜브의 SEM 이미지이고, 도 5의 B는 가열 가압한 후의 SEM 이미지이다. 도 5를 참고하면, 가압과 가열에 의해 탄소나노튜브는 표면 기공이 거의 없이 좀 더 부드러우면서 밀도 있게 형성되었다.

실시예 1에서 제조한 MWCNT-PDMS-glass 전극의 면저항이 60 Ω/sq로서, 종래 공지된 CNT 기반의 전극(Liu et al., 2010; Zhou et al., 2006)의 면저항 120105 Ω/sq 보다 낮다. 또한, 본 발명의 고분자 층으로 사용된 PDMS층은 소수성 특성으로 인해 유리 기판에 쉽게 접착될 수 있는 장점이 있다.

도 6은 실시예 2의 DPV(Differential pulse voltammetry) 측정 결과를 보여주는 그래프이다. 도 6을 참고하면, 타겟 DNA가 T3인 경우(프루브와 타겟의 시퀀스가 완전히 어긋나는 경우) 높은 전류값이 측정되고, 타겟 DNA가 T1(두 개의 시퀀스가 상보적인 경우)인 경우 T3에 비해 낮은 전류값이 측정됨을 확인할 수 있다.

실시예 3

실시예 2를 수행한 후 MWCNT-PDMS-glass 전극을 1 분 정도 이온수로 세척하였다, 이어서, 상기 전극으로 DPV 측정을 수행하고 이를 도 7에 나타내었다.

도 7의 A는 실시예 3과 같이 MWCNT-PDMS-glass 전극을 1 분 정도 이온수로 세척하고, MB와 DNA없이 DPV를 측정한 그래프이다. 도 7의 B는 타겟 DNA로서 T3을 사용하고 MWCNT-PDMS-glass 전극을 세척하여 6회 반복하여 DPV를 측정한 그래프이다. 도 7의 B는 6회의 측정값이 거의 유사하여(편차가 2.72% 이내임) 본 발명에서 제조된 MWCNT-PDMS-glass 전극이 재사용 가능함을 보여준다.

본 발명의 탄소나노튜브-고분자 전극은 염료와 DNA가 탄소나노튜브 표면에 화학적으로 결합되는 것이 아니라 물리적으로 흡착되므로 물로 세척하여 재사용할 수 있다.

이상에서, 본 발명의 바람직한 구현예에 대하여 상세하게 설명하였으나, 이들은 단지 설명의 목적을 위한 것으로 본 발명의 보호 범위가 이들로 제한되는 것은 아니다.

Claims (4)

1. 삭제
2. 탄소나노튜브를 용매에 분산시키는 단계 ;
   분산액을 접시(Petri dish)에 떨어뜨린 후 건조시켜 탄소나노튜브 층을 형성하는 단계 ;
   연성고분자와 경화제를 소정비로 혼합한 후 유리 기판위에 떨어뜨리고, 이를 경화하여 연성 고분자층을 형성하는 단계 ; 및
   상기 탄소나노튜브 층과 연성고분자층을 접촉한 후 가압 가열하는 단계를 포함하는 탄소 나노튜브-연성 고분자 복합체 전극 제조방법.
3. 제 2항의 제조방법으로 제조된 탄소 나노튜브-연성 고분자 복합체 전극을 샘플 용액에 침지하는 단계 ; 및
   상기 용액의 전기화학 신호를 측정하는 단계를 포함하고, 상기 샘플용액은 완충용액에 프로브 DNA, 염료 및 타겟 DNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA의 전기화학적 검출방법.
4. 제 3항에 있어서, 상기 신호측정 단계는 상기 프로브 DNA와 타겟의 DNA가 서로 상보적이지 않은 경우 상보적인 경우보다 더 높은 전류피크를 나타내는 것을 특징으로 하는 DNA의 전기화학적 검출방법.
   
   
   
   
   

Images