CN103820569A - 检测安达曼紫檀的专用探针、引物、基因芯片和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了检测安达曼紫檀（Pteroearpus dalbergioides Benth.）的专用探针、引物、基因芯片和方法。该专用探针是核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.4所示序列的DNA片段，或者是核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.4所示序列的反向互补序列的DNA片段。通过该基因芯片能够在短时间内对常见的花梨木安达曼紫檀进行鉴别，实现了在“种”的水平上对红木进行的鉴定，提升了红木鉴定的准确性和分辨率。

Description

检测安达曼紫檀的专用探针、引物、基因芯片和方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及检测安达曼紫檀的专用探针、引物、基因芯片和方法。
背景技术
红木是一类外表呈红色的优质硬木的统称，多产于热带亚热带地区，历来就受到世界各地人民的青睐。尤其是在中国的明清两代，经传统工艺制成的红木家具更是创造了中国古典家具的典范。根据我国的国家标准GB18107-2000《红木》，“红木”范围确定为5属8类、33个主要品种。目前，传统的鉴定方法依据心材颜色、气味、管孔弦向直径、气干密度、射线等指标将红木分为八类，鉴定结果只分辨到“类”，很难再深入到“种”的层面进行鉴定。
基因芯片是DNA识别技术的一种体现，利用芯片高通量的优势，可以在一张芯片上同时对多种红木的多个DNA条形码进行检测，不仅极大地提高了鉴定的准确性，而且还可以区分红木种与种之间的微小DNA差异，即基因芯片可以在“种”的水平上对不同红木进行准确鉴定。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，针对目前在“种”的水平上对不同红木进行准确鉴定的缺陷，提供一种检测安达曼紫檀的专用探针、引物、基因芯片和方法，该方法能够在“种”的水平上对安达曼紫檀进行准确鉴定。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
本发明的技术方案之一为：检测安达曼紫檀（Pteroearpus dalbergioides Benth.）的专用探针，其是核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.4所示的DNA片段，或者是核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO.4所示序列的反向互补序列的DNA片段。
上述探针检测安达曼紫檀的靶序列是核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO.1所示的DNA片段，或者是核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示序列的反向互补序列的DNA片段。
本发明的技术方案之二为：检测安达曼紫檀的基因芯片，其含有所述的专用探针。本发明所述的基因芯片如本领域常规，而其上的检测探针则是如上所述的专用探针。
本发明的技术方案之三为：检测安达曼紫檀的装置，其包括所述的专用探针或者所述的DNA芯片。本发明所述的装置如本领域常规，其中，优选的，所述的装置还包括引物对，所述的引物对中，一条引物的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO.2，另一条引物的核苷酸序列如序列表中的SEQ IDNO.3所示。其中，优选的，所述的引物上含有荧光标记。
本发明的技术方案之四为：检测安达曼紫檀的引物，其是核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的DNA片段。其中，优选的，所述的引物上含有荧光标记。
本发明的技术方案之五为：一种检测安达曼紫檀的方法，包括以下步骤：
（1）制备待测样本的总DNA，作为模板，用含检测标记的引物对进行PCR扩增，获得PCR产物，所述的引物对中，一条引物的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO.2，另一条引物的核苷酸序列如序列表中的SEQ IDNO.3所示；
（2）将专用探针结合于基因芯片的片基上，洗去未结合的探针，获得检测安达曼紫檀的基因芯片，所述的专用探针是核苷酸序列如序列表中SEQID NO.4所示的DNA片段，或者是核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.4所示序列的反向互补序列的DNA片段；
（3）在步骤（2）所得的检测安达曼紫檀的基因芯片中加入步骤（1）所得的PCR产物，进行杂交，洗去未杂交的PCR产物；
（4）检测步骤（3）所得的杂交后的基因芯片。
其中，步骤（1）所述的制备待测样本的总DNA的方法是常规的。所述PCR的扩增方法也是常规的，较佳的PCR扩增程序如下：95℃预热5min；35个循环：95℃30s，55℃30s，72℃30s；最后72℃延伸5min。
其中，步骤（2）所述的将专用探针结合于基因芯片的片基上的方法是常规的。基因芯片的片基是常规的，优选的，所述的片基是醛基片基，所述的探针是氨基化探针。优选的，在步骤（2）所述的基因芯片的另外的加样孔中加入花梨木管家基因检测探针，所述的花梨木管家基因检测探针是常规的，优选的是序列如序列表中SEQ ID NO.16所示序列的核苷酸片段。优选的，在步骤（2）所述的基因芯片的另外的加样孔中还可以加入其它试剂，如作为各种对照的试剂、检测其他种花梨木的检测探针等。
其中，步骤（3）所述的杂交是常规的。
其中，步骤（4）所述的检测方法是常规的，优选激光共聚焦扫描仪检测基因芯片，获得杂交结果。优选的，根据步骤（4）检测所得的杂交结果评判如下：杂交结果为阳性，则所述待测样本为安达曼紫檀；杂交结果不为阳性，则所述待测样本不为安达曼紫檀。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
本发明提供了鉴别安达曼紫檀该种花梨木的专用探针、引物、基因芯片和方法。对安达曼紫檀进行DNA鉴定，在“种”的水平上对该花梨木进行检测和鉴定，为传统的木材鉴定提供了一种新的技术和思路。
本发明的特点包括：
（1）高通量：能同时鉴定多个安达曼紫檀样品；若将多个花梨木的检测探针置于同一芯片上，能同时鉴定多个花梨木品种；
（2）准确性：基于DNA差异的检测，结果更可靠；
（3）时效性：相比于传统红木鉴定耗时15天，本发明只需要8小时即可完成对红木品种的鉴定。
（4）可靠性：含有内对照点，对检测操作的准确性进行质控。
附图说明
图1为安达曼紫檀的检测结果图。图中Pd为安达曼紫檀的检测位点；Pi为印度紫檀的检测位点；Pe为的检测位点；QC为管家基因的检测位点，也是芯片的质控位点。
图2为印度紫檀的检测结果图。图中Pd为安达曼紫檀的检测位点；Pi为印度紫檀的检测位点；Pe为的检测位点；QC为管家基因的检测位点；也是芯片的质控位点。
图3为的检测结果图。图中Pd为安达曼紫檀的检测位点；Pi为印度紫檀的检测位点；Pe为的检测位点；QC为管家基因的检测位点，也是芯片的质控位点。
图4对照组越柬紫檀的检测结果。图中Pc为越柬紫檀的检测位点；Dc为刀状黑黄檀的检测位点；Df为绒毛黄檀的检测位点；QC为管家基因的检测位点，也是芯片的质控位点。
图5对照组刀状黑黄檀的检测结果。图中Pc为越柬紫檀的检测位点；Dc为刀状黑黄檀的检测位点；Df为绒毛黄檀的检测位点；QC为管家基因的检测位点，也是芯片的质控位点。
图6对照组刀绒毛黄檀的检测结果。图中Pc为越柬紫檀的检测位点；Dc为刀状黑黄檀的检测位点；Df为绒毛黄檀的检测位点；QC为管家基因的检测位点，也是芯片的质控位点。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1靶序列的确定
根据报道的安达曼紫檀（Pteroearpus dalbergioides Benth.）、印度紫檀（Pterocarpus indicus Wiild.）、刺猬紫檀（Pterocarpus erinaceus Poir.）基因序列，选择一段特异性较好、片段长度适合的基因序列作为检测的靶序列。所选取的靶序列经过同源性比对检索后，目前确定为一段特异性较高的DNA序列。
3种花梨木的特异性检测靶序列分别为：
安达曼紫檀：
5’AGTTTATTTTGAAATAATTCATTTTTTTTTCCTTACAATACAAAGAGAAATNTATGTTTGGCAAAATTTTGAAAAAGGGGGTAAAATNTTCAATGTNTTTCTTTAGATNTTAAAAAGGTAAAAAAAAAGATAAAAAAAGGGGGGGGTAAGATATATGGGTAATTAATCAAAGAAGAATTAGTTTTCCTTTTGAGAACCGAAGGAAGGTTTTTCCCCTGACCCGGAGCAATG—3’（SEQ ID NO.1）；
印度紫檀：
5’GAAAGGAAAAGGCTATACATATATATATATGTATATATACGTATTTGTACTGAAATACTATTTCAATTGAGTAATGAAGACTCCAAATCTCTATTTGTGACTCTTTATATCACAAATGACAAATGAAAAATGTGAATCAAATCAATCCAAGTTGA—3’（SEQ ID NO.5）；
刺猬紫檀：
5’CAATCCCGGCGCCTCCGGGCACCGGGCGGGGCGGATGCTGGCCTCCCGCGAGCGAGCGCCTCTCGGTTGGCCGAAAATCGGGTTCGTGGCGGAGGGCAGCGCCACGACAGGTGGCGGTTGAGCGCAATCTCGAGGCCGGCCGTGCGCGCGCCCCCTCCGTCGTTGCGGACCCTAAGACCCGCGGGCGGCACCGATCCGCCGCCCATGACGCGACCTC—3’（SEQ ID NO.9）。
实施例2引物与探针的设计和合成
靶序列确定后，根据引物与探针设计原则，设计引物与探针如下：
安达曼紫檀：
引物1:5’Hex—AGTTTATTTTGAAATAATTCA—3’  （SEQ ID NO.2）；
引物2：5’—CATTGCTCCGGGTCAGGGGAAAAAC—3’  （SEQ ID NO.3）；
检测探针：
5’NH3—TTTTTTTTTTTCAAAAGGAAAACTAATTCTTCTTTGATT—3’  （SEQ ID NO.4）。
将所设计的引物和探针在NCBI上进行同源性比对，结果显示引物和探针序列只与报道的安达曼紫檀序列100%相似。另外，比对结果显示序列与其他树种虽有一定的相似，但是无法与其他树种序列进行有效结合，从而只能扩增和检测出安达曼紫檀。
印度紫檀：
引物1:5’Hex—GAAAGGAAAAGGCTATACAT—3’  （SEQ ID NO.6）；
引物2：5’—TCAACTTGGATTGATTTGATTC—3’  （SEQ ID NO.7）；
检测探针：
5’NH3—TTTTTTTTTTGATATAAAGAGTCACAAATAGAGATT—3’  （SEQ ID NO.8）。
将所设计的引物和探针在NCBI上进行同源性比对，结果显示引物和探针序列只与报道的印度紫檀序列100%相似。另外，比对结果显示序列与其他树种虽有一定的相似，但是无法与其他树种序列进行有效结合，从而只能扩增和检测出印度紫檀。
刺猬紫檀：
引物1:5’Hex—CAATCCCGGCGCCTCCGGGCACC—3’  （SEQ ID NO.10）；
引物2：5’—GAGGTCGCGTCATGGGCGGCGG—3’  （SEQ ID NO.11）；
检测探针：
5’NH3—TTTTTTTTTTTTGAGATTGCGCTCAACCGCCACCTGTCG—3’  （SEQ ID NO.12）。
将所设计的引物和探针在NCBI上进行同源性比对，结果显示引物和探针序列只与报道的刺猬紫檀序列100%相似。另外，比对结果显示序列与其他树种虽有一定的相似，但是无法与其他树种序列进行有效结合，从而只能扩增和检测出刺猬紫檀。
并且，通过同源比对，在3种花梨木的叶绿体基因组上找到了一段高度保守的基因序列，并将其作为管家基因对制备的芯片进行质控。序列如下：
5’AATAATTTTTCGTCTACCTTATCCTTCTTCAAGGATCCTTTGATTCATTATGTTAGATATCAAGGAAAATCCATTCTGGCTTCAAAGAATGCGCCTCTTTTGATGAATAAATGGAAATACTATCTCATCTATTTCTGGCAATGTCATTTTGATGTTTGGTCTCAACCAGGAACGATCCATATAAACCAATTATTATCCG—3’（SEQ ID NO.13）
针对管家基因序列，设计PCR扩增引物及其修饰位点如下：
质控引物1:5’Hex—AATAATTTTTCGTCTACCTTATC—3’  （SEQ ID NO.14）；
质控引物2：5’—CGGATAATAATTGGTTTATATG—3’  （SEQ ID NO.15）。
针对管家基因序列，设计检测探针的序列及其修饰位点如下：
5’NH3—TTTTTTTTTGATAGTATTTCCATTTATTCATCAAAAGAGGCGC—3’  （SEQ ID NO.16）。
将以上引物和检测探针送上海生物工程有限公司进行人工合成。引物的5’端带HEX荧光标记，备用。探针的5’端带氨基基团，即探针的氨基化，备用。
实施例3模板提取
用OMEGA的植物基因组提取试剂盒SP Plant DNA Maxi Kit（购自美国Omega Bio-Tek公司），取用安达曼紫檀、印度紫檀、刺猬紫檀三种木材的心材部分提取总DNA。提取方法及步骤详见说明书。最后将DNA溶解于水中，制备成浓度为10ng/μl的溶液。
实施例4PCR扩增及荧光标记
用已经荧光标记的引物对提取的模板进行PCR扩增（采用日本TaKaRa公司的PCR Amplification Kit），PCR扩增体系如下：
成分 浓度 用量
引物（HEX标记5’端） 10pM 0.2μl
10×PCR buffer 2.5μl
模板DNA 10ng/μl 3μl
DNA聚合酶 5U/μl 0.5μl
dNTP 10mM 2μl
ddH2O 补充至25μl
PCR程序如下：95℃预热5min；35个循环：95℃30s，55℃30s，72℃30s；最后72℃延伸5min。
实施例5芯片制备
将氨基化的探针按终浓度20pmoL/L（点样体积为500nl）分别点在醛基片基（购自上海领成生物科技有限公司）上，室温放置过夜，先后用洗脱液I（5×SSC,1%SDS）、洗脱液II(0.25×SSC,1%SDS)各洗脱5min，将没有固定上的探针洗脱掉，然后离心甩干备用。
实施例6分子杂交
将实施例4的PCR产物点在实施例5制备好的芯片上，在42℃下保持40min，用洗脱液I（5×SSC,1%SDS）、洗脱液II(0.25×SSC，1%SDS)各洗脱5min。各芯片的上样情况见下表：
Figure BDA0000479359610000081
实施例7杂交结果检测
用激光共聚焦扫描仪检测上述3芯片的杂交结果，结果参见图1-3。从图中可见，三张结果图中的质控点都显示正常，说明整个检测操作流程是可靠的，三种红木的检测探针都分别杂交上了靶序列，芯片特异性较好。
实施例8对比试验
为进一步验证芯片的可靠性和分辨率，选取另外的三种红木越柬紫檀（Pterocarpus cambodianus Pierre）、刀状黑黄檀（Dalbergia cultrata Grah）和绒毛黄檀（Dalbergia frulescens）进行对照检验。步骤如下：
1）模板提取：用OMEGA的植物基因组提取试剂盒分别提取越柬紫檀、刀状黑黄檀和绒毛黄檀三种木材的总DNA。提取方法及步骤同实施例3。
2）PCR扩增：按照实施例4中的PCR扩增体系和条件，对步骤1）获得的模板DNA进行扩增。
3）分子杂交：将步骤2）的PCR产物与实施例5中制备的芯片进行原位杂交，杂交条件与实施例6一致。
4）结果分析：用激光共聚焦扫描仪检测杂交结果，结果见图4-6，显示本发明所制备的芯片无法检测出越柬紫檀、刀状黑黄檀和绒毛黄檀三种红木，对照试验说明该芯片能将检测的靶序列同其他树种区分开，验证了本发明芯片的准确性和分辨度。
本发明中，各序列分别为：
安达曼紫檀：靶序列：SEQ ID NO.1；引物1：SEQ ID NO.2；引物2：SEQ ID NO.3；检测探针：SEQ ID NO.4。
印度紫檀:靶序列：SEQ ID NO.5；引物1：SEQ ID NO.6；引物2：SEQID NO.7；检测探针：SEQ ID NO.8。
刺猬紫檀：靶序列：SEQ ID NO.9；引物1：SEQ ID NO.10；引物2：SEQID NO.11；检测探针：SEQ ID NO.12。
质控基因序列:SEQ ID NO.13；质控引物1：SEQ ID NO.14；质控引物2：SEQ ID NO.15；质控检测探针：SEQ ID NO.16。
应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Figure IDA0000479359670000011
Figure IDA0000479359670000021
Figure IDA0000479359670000031
Figure IDA0000479359670000041
Figure IDA0000479359670000051

Claims (10)

1.检测安达曼紫檀（Pteroearpus dalbergioides Benth.）的专用探针，其特征在于，其是核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.4所示的DNA片段，或者是核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.4所示序列的反向互补序列的DNA片段。
2.检测安达曼紫檀的基因芯片，其特征在于，其含有权利要求1所述的专用探针。
3.检测安达曼紫檀的装置，其特征在于，其包括如权利要求1所述的专用探针或者如权利要求2所述的DNA芯片。
4.如权利要求3所述的装置，其特征在于，所述的装置还包括引物对，所述的引物对中，一条引物的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO.2，另一条引物的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO.3所示。
5.如权利要求4所述的装置，其特征在于，所述的引物上含有荧光标记。
6.检测安达曼紫檀的引物，其特征在于，其是核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的DNA片段。
7.如权利要求6所述的引物，其特征在于，所述的引物上含有荧光标记。
8.一种检测安达曼紫檀的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）制备待测样本的总DNA，作为模板，用含检测标记的引物对进行PCR扩增，获得PCR产物，所述的引物对中，一条引物的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO.2，另一条引物的核苷酸序列如序列表中的SEQ IDNO.3所示；
（2）将专用探针结合于基因芯片的片基上，洗去未结合的探针，获得检测安达曼紫檀的基因芯片，所述的专用探针是核苷酸序列如序列表中SEQID NO.4所示的DNA片段，或者是核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.4所示序列的反向互补序列的DNA片段；
（3）在步骤（2）所得的检测安达曼紫檀的基因芯片中加入步骤（1）所得的PCR产物，进行杂交，洗去未杂交的PCR产物；
（4）检测步骤（3）所得的杂交后的基因芯片。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤（2）所述的基因芯片的片基是醛基片基，所述的探针是氨基化探针。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤（2）所述的基因芯片的另外的加样孔中加入花梨木管家基因检测探针，所述的花梨木管家基因检测探针的序列如序列表中SEQ ID NO.16所示序列的核苷酸片段。
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