CN103820507A - 一种利用细菌还原香草醛制备香草醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用细菌还原香草醛制备香草醇的方法，包括：（1）从保存菌种的琼脂斜面培养基上取一环醋酸杆菌接入液体种子培养基中，在20-30℃下培养12-24小时，以活化菌种；（2）将种子液按体积百分比6-10%接入到液体发酵培养基中，于20-30℃摇床培养或者静置培养12～48h；（3）待液体发酵培养基中有大量的絮状物生成，向培养基中加入经过过滤除菌的香草醛溶液，使培养基中香草醛的终浓度达到0.1-3.0mmol/L，于20-35℃摇床培养或者静置培养0.5～7天后，即得香草醇。本发明转化得率较高，可达50-98%，反应条件温和、绿色环保，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于香草醇的制备领域，特别涉及一种利用细菌还原香草醛制备香草醇的方法。
背景技术
香草醇又称香荚兰醇、香兰醇、4-羟基-3-甲氧基苄醇，分子量为154.16，具有奶油甜香及椰子香气。香气较香兰素更柔和、持久、性质给稳定。香兰醇为世界公认的香料，几乎适用于所有香型。可广泛用于食品、烟酒、饮料及日化产品，甜香独特且突出。
一般存在于兰科植物天麻（Gastrodia elata Bl.）的块茎中，是天麻中的有效成分。药效上具有明显镇静作用，可使小白鼠自发活动减少，能延长环己烯巴比妥钠的睡眠时间，尚有促进胆汁分泌作用。化学合成香草醇的反应时间较长，溶剂用量大，转化率低，成本高，因此亟需开发新的技术方法生产香草醇。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种利用细菌还原香草醛制备香草醇的方法，该方法转化得率较高，可达50-98%，反应条件温和、绿色环保，具有良好的应用前景。
本发明的一种利用细菌还原香草醛制备香草醇的方法，包括：
（1）从保存菌种的琼脂斜面培养基上取一环醋酸杆菌接入液体种子培养基中，在20-30℃下培养12-24小时，以活化菌种；
（2）将种子液按体积百分比6-10%接入到液体发酵培养基中，于20-30℃摇床培养或者静置培养12～48h；
（3）待液体发酵培养基中有大量的絮状物生成，向培养基中加入经过灭菌过滤的香草醛溶液，使培养基中香草醛的终浓度达到0.1-3.0mmol/L，于20-35℃摇床培养或者静置培养0.5～7天后，即得香草醇。
所述步骤（1）中的醋酸杆菌为醋酸菌属、葡萄糖酸杆菌属或葡糖酸醋杆菌属。
所述步骤（1）和（2）中的液体种子培养基和液体发酵培养基的组分为：甘露醇、葡萄糖、蔗糖、甘油或果糖25g、蛋白胨或胰蛋白胨3g、酵母浸膏5g，水1L，pH3.5-7.5，121℃灭菌20min；或者为：甘露醇、葡萄糖、蔗糖、甘油或果糖20-100g，酵母浸膏5g，蛋白胨或胰蛋白胨5g，柠檬酸1.15g，Na2HPO42.7g，水1L，pH3.5-7.5，121℃灭菌20min。
所述步骤（1）中在液体种子培养基中培养是摇床培养，速度为160～180r/min。
所述步骤（2）和（3）中的摇床培养的速度为100-250r/min。
有益效果
本发明转化得率较高，可达50-98%，反应条件温和、绿色环保，与传统的化学法相比能耗低、生产工艺简单，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为木醋杆菌（Acetobacter xylinum ATCC23770）还原转化不同浓度香草醛的历程图；A为培养基中添加0-10mmol/L香草醛时残余葡萄糖的变化情况；B为培养基中添加0-10mmol/L香草醛时培养过程pH值的变化情况；C为培养基中添加0-10mmol/L香草醛时培养过程中活菌的增殖情况；D为培养基中添加0-10mmol/L香草醛时香草醛浓度的变化。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
（1）活化菌种
从保存菌种的琼脂斜面培养基上取一环木醋杆菌（Acetobacter xylinum ATCC23770）接入液体种子培养基（甘露醇、葡萄糖、蔗糖或者甘油25g、蛋白胨3g、酵母浸膏5g，水1L，pH3.5，121℃灭菌20min）中，在30℃下160转培养12小时，以活化菌种；
（2）扩培菌种细胞
将含有种子液按6%（v/v）接入到液体培养基（葡萄糖、甘露醇、蔗糖或者甘油25g、蛋白胨3g、酵母浸膏5g，水1L，pH3.5，121℃灭菌20min）中，于20℃、100r/min条件下摇床培养或者静置培养12h后备用；
（3）加入香草醛制备香草醇
待培养基中有大量的絮状物生成，分别向培养基中加入经过灭菌过滤的香草醛溶液，使培养基中香草醛的终浓度达到0.5mmol/L，于20℃、100r/min条件下摇床培养或者静置培养1天后，用高效液相色谱（HPLC）检测培养基中的香草醛的转化率。
HPLC（Agilent1200series，C18柱配UV和DAD检测器）的检测方法流动相为A相：2mmol/L甲酸加入到Milli-Q超纯水中；B相：2mmol/L甲酸加入到乙腈。流动相流速：0.4mL/min。柱温：40℃。检测波长：280nm。
结果如图1中0.5mM香草醛的情况。结果发现被转化的香草醛的量达到100%，其中转化为香草醇的含量占到初始香草醛含量的91%。
实施例2
（1）活化菌种
从保存菌种的琼脂斜面培养基上取一环木醋杆菌（Acetobacter xylinum ATCC23770）接入液体种子培养基（甘露醇、葡萄糖、蔗糖或者果糖25g、胰蛋白胨3g、酵母浸膏5g，水1L，pH5.5，121℃灭菌20min）中，在30℃下160转培养18小时，以活化菌种；
（2）扩培菌种细胞
将含有种子液按8%（v/v）接入到液体培养基（葡萄糖、甘露醇、蔗糖或者果糖25g、胰蛋白胨3g、酵母浸膏5g，水1L，pH5.5，121℃灭菌20min）中，于30℃、250r/min条件下摇床培养或者静置培养18h后备用；
（3）加入香草醛制备香草醇
待培养基中有大量的絮状物生成，分别向培养基中加入经过灭菌过滤的香草醛溶液，使培养基中香草醛的终浓度达到3.0mmol/L，于35℃、250r/min条件下摇床培养或者静置培养4天后，用高效液相色谱（HPLC）检测培养基中的香草醛的转化率，检测方法如实施例1。结果发现被转化的香草醛的量达到65%，其中转化为香草醇的含量占到初始香草醛含量的50%。
实施例3
（1）活化菌种
从保存菌种的琼脂斜面培养基上取一环木醋杆菌（Acetobacter xylinum ATCC23770）接入液体种子培养基（甘露醇、葡萄糖、蔗糖或者果糖25g、胰蛋白胨3g、酵母浸膏5g，水1L，pH5.5，121℃灭菌20min）中，在30℃下160转培养24小时，以活化菌种；
（2）扩培菌种细胞
将含有种子液按10%（v/v）接入到液体培养基（甘露醇、葡萄糖、蔗糖或者果糖25g、胰蛋白胨3g、酵母浸膏5g，水1L，pH5.5，121℃灭菌20min）中，于25℃、150r/min条件下摇床培养或者静置培养48h后备用；
（3）加入香草醛制备香草醇
待培养基中有大量的絮状物生成，分别向培养基中加入经过灭菌过滤的香草溶液，使培养基中香草的终浓度达到3.0mmol/L，于30℃、150r/min条件下摇床培养或者静置培养0.5天后，用高效液相色谱（HPLC）检测培养基中的香草的转化率，检测方法如实施例1。结果发现被转化的香草醛的量达到70%，其中转化为香草醇的含量占到初始香草醛含量的65%。
实施例4
（1）活化菌种
从保存菌种的琼脂斜面培养基上取一环氧化葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter oxydans DSM2003或者ATCC23773）接入液体种子培养基（甘露醇、葡萄糖、蔗糖或者果糖100g，酵母浸膏5g，蛋白胨5g，柠檬酸1.15g，Na2HPO42.7g，水1L，pH7.5，121℃灭菌20min）中，在30℃下160转培养12小时，以活化菌种；
（2）扩培菌种细胞
将含有种子液按6%（v/v）接入到液体培养基（葡萄糖、蔗糖或者果糖100g，酵母浸膏5g，蛋白胨5g，柠檬酸1.15g，Na2HPO42.7g，水1L，pH7.5，121℃灭菌20min）中，于20℃、100r/min条件下摇床培养或者静置培养1h后备用；
（3）加入香草醛制备香草醇
待培养基中有大量的絮状物生成，分别向培养基中加入经过灭菌过滤的香草醛溶液，使培养基中香草醛的终浓度达到0.1mmol/L，于20℃、100r/min条件下摇床培养或者静置培养0.5天后，用高效液相色谱（HPLC）检测培养基中的香草醛的转化率，检测方法如实施例1。结果发现被转化的香草醛的量达到100%，其中转化为香草醇的含量占到初始香草醛含量的100%。
实施例5
（1）活化菌种
从保存菌种的琼脂斜面培养基上取一环氧化葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter oxydans DSM2003）接入液体种子培养基（甘露醇、葡萄糖、蔗糖或者果糖100g，酵母浸膏5g，蛋白胨5g，柠檬酸1.15g，Na2HPO42.7g，水1L，pH7.5，121℃灭菌20min）中，在30℃下160转培养14小时，以活化菌种；
（2）扩培菌种细胞
将含有种子液按10%（v/v）接入到液体培养基（甘露醇、葡萄糖、蔗糖或者果糖100g，酵母浸膏5g，蛋白胨5g，柠檬酸1.15g，Na2HPO42.7g，水1L，pH7.5，121℃灭菌20min）中，于30℃、250r/min条件下摇床培养或者静置培养48h后备用；
（3）加入香草醛制备香草醇
待培养基中有大量的絮状物生成，分别向培养基中加入经过灭菌过滤的香草醛溶液，使培养基中香草醛的终浓度达到1.5mmol/L，于35℃、250r/min条件下摇床培养或者静置培养1天后，用高效液相色谱（HPLC）检测培养基中的香草醛的转化率，检测方法如实施例1。结果发现被转化的香草醛的量达到100%，其中转化为香草醇的含量占到初始香草醛含量的90%。
实施例6
（1）活化菌种
从保存菌种的琼脂斜面培养基上取一环木葡糖酸醋杆菌（Gluconacetobacter xylinusATCC23770或者ATCC53524）接入液体种子培养基（甘露醇、葡萄糖、蔗糖或者果糖100g，酵母浸膏5g，蛋白胨5g，柠檬酸1.15g，Na2HPO42.7g，水1L，pH7.5，121℃灭菌20min）中，在30℃下160转培养12小时，以活化菌种；
（2）扩培菌种细胞
将含有种子液按8%（v/v）接入到液体培养基（甘露醇、葡萄糖、蔗糖或者果糖100g，酵母浸膏5g，蛋白胨5g，柠檬酸1.15g，Na2HPO42.7g，水1L，pH7.5，121℃灭菌20min）中，于26℃、140r/min条件下摇床培养或者静置培养20h后备用；
（3）加入香草醛制备香草醇
待培养基中有大量的絮状物生成，分别向培养基中加入经过灭菌过滤的香草醛溶液，使培养基中香草醛的终浓度达到3.0mmol/L，于20℃、100r/min条件下摇床培养或者静置培养2天后，用高效液相色谱（HPLC）检测培养基中的香草醛的转化率，检测方法如实施例1。结果发现被转化的香草醛的量达到95%，其中转化为香草醇的含量占到初始香草醛含量的86%。
Claims (5)
1.一种利用细菌还原香草醛制备香草醇的方法，包括：
（1）从保存菌种的琼脂斜面培养基上取一环醋酸杆菌接入液体种子培养基中，在20-30℃下培养12-24小时，以活化菌种；
（2）将种子液按体积百分比6-10%接入到液体发酵培养基中，于20-30℃摇床培养或者静置培养12～48h；
（3）待液体发酵培养基中有大量的絮状物生成，向培养基中加入经过灭菌过滤的香草醛溶液，使培养基中香草醛的终浓度达到0.1-3.0mmol/L，于20-35℃摇床培养或者静置培养0.5～7天后，即得香草醇。
2.根据权利要求1所述的一种利用细菌还原香草醛制备香草醇的方法，其特征在于：所述步骤（1）中的醋酸杆菌为醋酸菌属、葡萄糖酸杆菌属或葡糖酸醋杆菌属。
3.根据权利要求1所述的一种利用细菌还原香草醛制备香草醇的方法，其特征在于：所述步骤（1）和（2）中的液体种子培养基和液体发酵培养基的组分为：甘露醇、葡萄糖、蔗糖、甘油或果糖25g、蛋白胨或胰蛋白胨3g、酵母浸膏5g，水1L，pH3.5-7.5，121℃灭菌20min；或者为：甘露醇、葡萄糖、蔗糖、甘油或果糖20-100g，酵母浸膏5g，蛋白胨或胰蛋白胨5g，柠檬酸1.15g，Na2HPO42.7g，水1L，pH3.5-7.5，121℃灭菌20min。
4.根据权利要求1所述的一种利用细菌还原香草醛制备香草醇的方法，其特征在于：所述步骤（1）中在液体种子培养基中培养是摇床培养，速度为160～180r/min。
5.根据权利要求1所述的一种利用细菌还原香草醛制备香草醇的方法，其特征在于：所述步骤（2）和（3）中的摇床培养的速度为100-250r/min。
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