CN103820486B - 一种谷氨酸棒杆菌启动子探针载体及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种谷氨酸棒杆菌启动子探针载体，以谷氨酸棒杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体为出发质粒，插入上游不含启动子的报告基因及新抗性基因，同时在报告基因上游的MCS位点前端插入终止子。本发明还公开了上述启动子探针载体的构建方法和应用。本发明中构建的启动子探针载体为pTSDCAT，是谷氨酸棒杆菌-大肠杆菌的穿梭质粒，为定量筛选谷氨酸棒菌不同强度启动子活性片段提供了有效工具。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种谷氨酸棒杆菌启动子探针载体及其构建方法和应用。
背景技术
谷氨酸棒杆菌属于革兰氏阳性菌，能生产多种氨基酸，例如L-谷氨酸、L-色氨酸、L-苏氨酸等，此外还能生产多种核苷酸以及丁二酸等重要化学品，其应用广泛涉及医药、食品、化工等领域。在以绿色化学为主题的今天，谷氨酸棒杆菌势必是先进生物与化学品制造领域的重要工业微生物。在过去传统的研究中，人们通过诱变育种技术，筛选获得了多种适合不同物质生产的菌株。如今随着分子生物学技术的发展，以及多个谷氨酸棒菌亚种测序的完成，对谷氨酸棒杆菌遗传系统、基因水平和代谢网络的研究也更加地深入。
目前，从谷氨酸棒杆菌中已经分离获得了pBL1，pXZ10142，pCRY4，pCG1四个家族，共计20余种质粒，为谷氨酸棒杆菌提供了丰富的遗传载体。现今对谷氨酸棒杆菌遗传系统的改造大多是在对所涉及的代谢途径中某些基因的优化和调控，而这些功能基因往往在诸多调控元件的控制下表达，例如启动子，增强子，终止子等。上述调控方式中，最突出和重要的就是启动子调控。启动子位于基因的上游，对基因表达强弱和表达调控有着极其重要的意义。同时启动子也是合成生物学中重要的研究和应用元件。探究模式微生物的启动子作用机理，建立启动子元件文库，对菌种改造和科学研究有着极其重要的意义。
根据目前文献所报道基因启动子的克隆方法主要包括：以启动子探针构建基因组文库筛选法、启动子结构预测及PCR克隆预测片段法、以及利用启动子陷阱技术克隆启动子。无论采用何种方法获得启动子，最终都需要通过启动子探针来对其进行筛选，测定和分析。启动子探针载体是借助缺失启动子且其产物易于检测的报告基因，来构建启动子探针载体，从而鉴定有启动功能的DNA片段，它具备两个基本部分：转化单元和检测单元。其中，转化单元包括复制起点和抗生素抗性基因，用来筛选被转化的细胞；检测单元则含有一个已丧失转录功能且产物易于检测的报告基因以及克隆位点和转录终止子。通过报告基因的表达情况来确定插入片段是否具有启动子活性；也可以通过测定报告基因的表达量来定量分析该启动子片段的强弱。因此，构建一个高效准确的启动子探针对启动子及其后续研究有着重要的意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题，在于提供一个有效的谷氨酸棒杆菌启动子探针载体。
本发明所要解决的另一个技术问题在于，提供上述启动子探针载体的新颖快捷的构建方法。
本发明最后要解决的技术问题在于，提供上述启动子探针载体的应用。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种谷氨酸棒杆菌启动子探针载体，以谷氨酸棒杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体为出发质粒，插入上游不含启动子的报告基因及新抗性基因，同时在报告基因上游的MCS位点前端插入终止子，以消除质粒通读现象或者上游序列引起的干扰。
其中，所述的谷氨酸棒杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体为pXMJ19。
其中，所述的报告基因为氯霉素乙酰转移酶基因CmR。
其中，所述的新抗性基因为氨苄青霉素抗性基因AmpR。
其中，所述的终止子为rrnBT1。
上述谷氨酸棒杆菌启动子探针载体的构建方法，以谷氨酸棒杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体为出发质粒，利用PCR-targeting打靶技术以及一步克隆法插入上游不含启动子的报告基因和作为探针筛选标记的新抗性基因，同时在报告基因上游的MCS位点前端插入终止子。
优选的构建方法是，以谷氨酸棒杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体pXMJ19为出发载体，利用PCR-targeting打靶技术插入上游不含启动子的报告基因CmR和作为探针筛选标记的新抗性基因AmpR，同时在报告基因上游的MCS位点前端插入终止子rrnBT1。
具体来说，分别以载体pUC18和pXMJ19为模板，用下述引物，分别扩增得到片段AmpR和片段MCS-SD-CmR，再以引物CmR-F和AmpR-R进行overlapPCR，获得片段AmpR-MCS-SD-CmR：
CmR-F:5’-TCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTCGAGATTTTCAGGAGCTAAGGAAG；
CmR-R:5’-TGATGGCAGGTTGGGCGTCGCTTGGTCGGTCATTTCGAAGGGCACCAATAACTGC；
AmpR-F:5’-CTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCGGGTACCATGTGCGCGGAACCCCTATTTGT；
AmpR-R:5’-AAATCTTCTCTCATCCGCCAAAACAGCCAAGCTGAATTCGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTG。
通过PCR-targeting技术将扩增得到的AmpR-MCS-SD-CmR片段打靶替换到载体pXMJ19上，得到质粒pSDCAT。
以载体pXMJ19为模板，用下述引物，扩增得到终止子rrnBT1：
rrnBT1-F:5’-GGTTCCGCGCACATGGTACCTAGCGCCGATGGTAGTGTG；
rrnBT1-R:5’-CGACTCTAGAGGATCCCTCCCGGCGGATTTGTCCTACTC。
通过酶切位点BamHI和KpnI将载体pSDCAT线性化后，通过一步克隆法构建入终止子rrnBT1，得到启动子探针载体pTSDCAT。
上述谷氨酸棒杆菌启动子探针载体在定量筛选谷氨酸棒杆菌不同强度启动子中的应用。
本发明的实例中，确认了启动子探针本身无法表达报告基因，即在谷氨酸棒杆菌中未表现出氯霉素抗性。而后将已知的四个CorynebacteriumglutamicumATCC13032启动子片段P-45、P-dapA、P-dapB、P-Tac克隆至上述启动子探针中以验证其功能，通过测定重组谷棒的氯霉素乙酰转移酶的活性表明：pTSDCAT无论在大肠杆菌还是在谷氨酸棒杆菌中都具有启动子探针的功能。并且可以有效地定量测定启动子片段的强度。故本发明启动子探针载体pTSDCAT的构建不光提供一种新颖快捷的启动子探针载体的构建方法，也为高效筛选分析谷氨酸棒杆菌启动子，建立高丰度的启动子文库提供了有效工具。
附图说明
图1为本发明中谷氨酸棒杆菌启动子探针载体pTSDCAT的构建流程图。
图2为将启动子片段克隆至启动子探针载体pTSDCAT的构建流程图。
图3为PCR扩增AmpR,MCS-SD-CmR片段，以及overlapPCR扩增打靶片段AmpR-MCS-SD-CmR的琼脂糖凝胶电泳鉴定图，M：DNA分子量标准DL2000；1：片段AmpR；2：片段MCS-SD-CmR；3：打靶片段AmpR-MCS-SD-CmR。
图4为重组质粒pSDCAT的鉴定图，M：DNA分子量标准DL2000；1：重组质粒pSDCATHindⅢ&BspT104I双酶切后的琼脂糖凝胶电泳鉴定图。
图5为PCR扩增终止子片段rrnBT1的琼脂糖凝胶电泳鉴定图,M：DNA分子量标准DL10000；1：片段rrnBT1。
图6为启动子探针载体pTSDCAT的鉴定图，M：DNA分子量标准DL10000；1：启动子探针载体pTSDCATKpnI&BamHI双酶切后的琼脂糖凝胶电泳鉴定图。
图7为PCR扩增各个启动子片段片段的琼脂糖凝胶电泳鉴定图，M：DNA分子量标准DL2000；1：片段P-dapA；2：片段P-dapB；3：片段P-45；4：P-Tac。
图8为测定含不同启动子片段的重组谷棒的单位质量粗酶的CAT活性结果柱形图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
以下所述的实施例中所用的方法若无特别阐述则均为本领域技术人员所熟知的手段。实施过程中除了ClonExpressTM一步克隆试剂盒是由Vazyme公司提供，其余所用的酶均为TaKaRa公司产品。
下述实施例中所用的CorynebacteriumglutamicumATCC13032和质粒pXMJ19均由中科院微生物研究所惠赠(质粒pXMJ19，GenBank:AJ133195.1)。
实施例1：谷氨酸棒杆菌-大肠杆菌穿梭启动子探针载体pTSDCAT的构建。
启动子探针载体构建策略如图1。
1、扩增打靶片段AmpR-MCS-SD-CmR。
以质粒pUC18和pXMJ19为模板，用下述引物，分别扩增得到AmpR和MCS-SD-CmR。其中
AmpR作为探针筛选标记的新抗性基因；MCS-SD-CmR为上游不含启动子的报告基因。再以引物CmR-F和AmpR-R进行overlapPCR，获得打靶片段AmpR-MCS-SD-CmR。
CmR-F:5’-TCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTCGAGATTTTCAGGAGCTAAGGAAG；
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AmpR-F:5’-CTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCGGGTACCATGTGCGCGGAACCCCTATTTGT；
AmpR-R：
5’-AAATCTTCTCTCATCCGCCAAAACAGCCAAGCTGAATTCGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTG；
常规PCR和overlapPCR都采用如下的50μLPCR体系：在200μL无菌PCR管中加入双蒸水33μL；4μLdNTPMix（2.5mMeach）；10μL5×PrimeSTARBuffer（Mg2+plus）；1μL上游引物；1μL下游引物；0.5μL模板；0.5μLPrimeSTARHSDNAPolymerase。无气泡混匀后离瞬时离心，在BIO-RADPCR仪中按如下程序完成扩增：预变性98℃5min，98℃变性30s,56℃退火15s,72℃延伸1.5min，共30个循环，最后72℃延伸10min。
将PCR产物用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测可见如下大小的扩增条带：AmpR约1000bp；MCS-SD-CmR约750bp；AmpR-MCS-SD-CmR约1750bp，与预期大小相符，证明打靶片段扩增成功(图3)。
2、通过PCR-targeting打靶技术将谷氨酸棒杆菌表达载体pXMJ19改造成pSDCAT。
取pXMJ19质粒1μL，按照钙转法转化入E.coliBW25113/pKD46感受态细胞，涂布氯霉素和氨苄青霉素双抗平板（含氯霉素50μg/mL、氨苄青霉素50μg/mL）。验证正确后，进一步制成电转感受态。
电转感受态制备：30℃平板活化；挑单菌落至5mLLB培养基（含氯霉素50μg/mL、氨苄青霉素50μg/mL），30℃过夜(OD600约为3-4)；转接100μL至10mLLB培养基（含10mmol/L阿拉伯糖、氯霉素50μg/mL、氨苄青霉素50μg/mL），30℃培养3-4h左右，至OD600约为0.4；4℃，4000×g离心5min，收集菌体；弃上清，加入预冷的10%甘油，洗涤菌体；重复一次；用100μL冰冷的10%甘油重悬菌体，分装成2管，作为电转感受态。
PCR-targeting：取2μL上述打靶片段AmpR-MCS-SD-CmR，加至100μL感受态细胞，混匀，2500V(2mm)，电击；立即加入1mLLB，37℃复苏1h，使温敏性质粒pKD46丢失；离心，涂布于含50μg/mL氨苄青霉素抗性平板。转化子提质粒，进行如下10μL酶切体系进行验证：5.6μL双蒸水；1μL1×M；0.2μLHindⅢ；0.2μLBspT104I；3μL质粒。将阳性克隆命名为pSDCAT。
HindⅢ和BspT104I两个酶切位点选自打靶目的片段，酶切产物通过0.8%琼脂糖凝胶电泳检测发现切下约700bp的片段。与预期大小相符，证明片段AmpR-MCS-SD-CmR已打靶至原载体(图4)。再通过测序确保上述扩增片段未发生突变，故质粒pSDCAT构建成功。
3、一步克隆法完成谷氨酸棒杆菌启动子探针pTSDCAT的构建。
以载体pXMJ19为模板，用下述引物，分别扩增得到终止子rrnBT1。
rrnBT1-F:5’-GGTTCCGCGCACATGGTACCTAGCGCCGATGGTAGTGTG；
rrnBT1-R:5’-CGACTCTAGAGGATCCCTCCCGGCGGATTTGTCCTACTC；
PCR体系参考实施例1-1。PCR产物约190bp，通过琼脂糖凝胶电泳检测可见如(图5)所示的条带，符合预期大小，终止子片段rrnBT1扩增成功。
将载体pSDCAT通过酶切位点BamHI和KpnI双切线性化后，通过ClonExpressTM一步克隆试剂盒构建入终止子片段rrnBT1。一步克隆体系：120ng线性化pSDCAT；4ng终止子rrnBT1片段；4μL5×CEⅡBuffer；2μLExnaseTMⅡ；以双蒸水定容至20μL。置于37℃反应30min。反应完成后立即将反应管置于冰水浴中，冷却5min。
将上述反应液按照钙转法转化入200μLE.coliDH5α感受态细胞中，并涂布于含50μg/mL氨苄青霉素的平板。转化子提质粒，进行KpnI和BamHI双切验证，酶切体系参考实施例1-2。酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳检测发现切下约190bp的片段，与预期大小相符，证明终止子片段rrnBT1成功构建入载体pSDCAT(图6)。
至此，本发明最终的谷氨酸棒杆菌启动子探针pTSDCAT构建完成。
实施例2：谷氨酸棒杆菌启动子探针载体pTSDCAT的功能验证。
1、确认启动子探针本身不表达报告基因。
首先测定谷氨酸棒杆菌对氯霉素的最高耐受性。将OD600为1的CorynebacteriumglutamicumATCC13032菌液分别稀释至10-3、10-4、10-5、10-6，取200μL涂布到BHI平板上。结果显示稀释至10-5时，涂布后菌体能很好地分出单菌落，以便菌体氯霉素耐受性实验。再用OD600为1的CorynebacteriumglutamicumATCC13032菌液稀释至10-5后分别涂布到不同氯霉素含量的平板上：2μg/mL、3μg/mL、4μg/mL、5μg/mL。结果显示，谷氨酸棒杆菌可以在2μg/mL的氯霉素平板上正常生长。
其次将上述启动子探针载体pTSDCAT电转至CorynebacteriumglutamicumATCC13032电转感受态后（电转方法参考实施例2-3），同样分别涂布到不同氯霉素含量的平板上：2μg/mL、3μg/mL、4μg/mL、5μg/mL。结果显示，重组谷氨酸棒杆菌只能在2μg/mL的氯霉素平板上正常生长。这与谷氨酸棒杆菌的本底耐受性一致。故可证实本发明所中的启动子探针本身不表达报告基因。
2、克隆已报道的谷氨酸棒杆菌启动子片段至本发明探针载体pTSDCAT。构建策略如图2。
根据文献报道，选择了四个已知的CorynebacteriumglutamicumATCC13032启动子片段来对探针进行验证，分别为来自谷棒基因组的P-45、P-dapA、P-dapB以及来自谷棒表达载体pXMJ19中用于表达外源基因的启动子P-Tac。故分别以CorynebacteriumglutamicumATCC13032基因组和表达载体pXMJ19为模板，以下表为引物，扩增各启动子片段。PCR体系参考实施例1-1。
将PCR产物用琼脂糖凝胶电泳检测可见各个扩增条带约500bp，与预期大小相符，证明打靶片段扩增成功(图7)，证明启动子片段扩增成功。
将探针载体pTSDCAT通过酶切位点BamHI和HindⅢ双切线性化后，通过ClonExpressTM一步克隆试剂盒构建入上述各启动子片段。一步克隆体系参考实施例1-3。将各反应液按照钙转法转化入E.coliDH5α感受态细胞中，并涂布于含50μg/mL氨苄青霉素的平板。转化子提质粒，进行HindⅢ和BamHI双切验证，酶切体系参考实施例1-2。酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳检测发现切下约190bp的片段，与预期大小相符，证明各启动子片段正确构建入载体pTSDCAT。各重组质粒分别命名为：pTSDCAT-Tac、pTSDCAT-dapA、pTSDCAT-dapB、pTSDCAT-45。
3、携带启动子的各个重组探针质粒的功能验证。
CorynebacteriumglutamicumATCC13032电转感受态的制备：挑取新鲜的平皿上菌种接入2mlBHI培养基中，30℃，200rpm，过夜。再将其以1%的接种量转接入100mL的BHIS培养基（37g/L的脑心粉，91g/L的山梨醇）。30℃，200rpm，直至OD600约为1.2。细胞冰浴15min，而后以5500g，4℃离心20min收集菌体。用预冷的10%的甘油洗涤菌体3次。用1mL的10%甘油重悬细胞，分装，每管100μL。CorynebacteriumglutamicumATCC13032的电转：将谷棒感受态置于冰上融化，而后各添加约1μg质粒，移如0.2cm的电转杯。在电击之前，在细胞悬液上轻轻加入0.8mL预冷的10%甘油，避免两液层混合。在25uF,12.5kV/cm,200Ω的条件下电击，电击后立即转移入4mL46℃预热的BHIS培养基。并在46℃水浴6min，然后于30℃，200rpm复苏培养1h。后离心涂布于含有10μg/mL氯霉素的BHI平板，于30℃培养。结果显示，转化子均可在含10μg/mL氯霉素的BHI平板上正常生长，表明本发明中的启动子探针载体的确具有筛选启动子片段的功能。
各启动子片段强度的定量测定。选择含各启动子的重组谷氨酸棒杆菌以及原始CorynebacteriumglutamicumATCC13032，作为阴性对照。挑取在新鲜平板生长的谷棒菌落接种BHI液体培养基，于30℃摇床培养过夜,离心收集细胞，用100mmol/LTris-HCL(pH7.8)洗涤两遍，悬浮，超声波破碎细胞，离心，取上清待用。用马斯亮蓝法测定粗酶浓度。报告基因氯霉素乙酰转移酶(CAT)活性的测定：1.0mL反应体系含100mmol/LTris-HCL(pH7.8)，0.1mmol/Lacetyl-CoA（乙酰辅酶A），0.4mg/mLDTNB，适量的粗酶液；将反应混合物在水浴中加热到37℃，加入终浓度为0.1mmol/L的氯霉素，混匀，立即测定光吸收值A412；以未加氯霉素的反应液为对照。每个样品重复测定三次，取平均值。CAT活性单位的定义:一个活力单位(U)为在上述反应条件下,每分钟乙酰化1μmol氯霉素所需酶量。测定结果如图8所示。重组菌粗酶的氯霉素乙酰转移酶活性均高于CorynebacteriumglutamicumATCC13032的本底活性。启动子P-Tac常用于谷棒表达载体中启动待表达基因，本实例中克隆的启动子中，P-dapA的启动子活性远大于P-Tac，而其余两个则略小于P-Tac。
综上，本发明构建的拥有自主知识产权的谷氨酸棒杆菌启动子探针载体，具有高效且定量化筛选谷氨酸棒菌不同强度启动子活性片段的功能。
Claims (5)
1.一种谷氨酸棒杆菌启动子探针载体的构建方法，其特征在于，以谷氨酸棒杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体为出发质粒，利用PCR-targeting打靶技术插入上游不含启动子的报告基因和作为探针筛选标记的新抗性基因，同时在报告基因上游的MCS位点前端插入终止子；
所述的谷氨酸棒杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体为pXMJ19质粒，利用PCR-targeting打靶技术以及一步克隆法插入上游不含启动子的报告基因CmR和作为探针筛选标记的新抗性基因AmpR，同时在报告基因上游的MCS位点前端插入终止子rrnBT1；
分别以载体pUC18和pXMJ19为模板，用下述引物，分别扩增得到片段AmpR和片段MCS-SD-CmR，再以引物CmR-F和AmpR-R进行overlapPCR，获得片段AmpR-MCS-SD-CmR：
CmR-F:5’-TCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTCGAGATTTTCAGGAGCTAAGGAAG；
CmR-R:5’-TGATGGCAGGTTGGGCGTCGCTTGGTCGGTCATTTCGAAGGGCACCAATAACTGC；
AmpR-F:5’-CTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCGGGTACCATGTGCGCGGAACCCCTATTTGT；
AmpR-R:5’-AAATCTTCTCTCATCCGCCAAAACAGCCAAGCTGAATTCGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTG；
通过PCR-targeting技术将扩增得到的AmpR-MCS-SD-CmR片段打靶替换到载体pXMJ19上，得到质粒pSDCAT。
2.根据权利要求1谷氨酸棒杆菌启动子探针载体的构建方法，其特征在于，通过酶切位点BamHI和KpnI将载体pSDCAT线性化后，通过一步克隆法构建入终止子rrnBT1，得到启动子探针载体pTSDCAT。
3.根据权利要求1所述的谷氨酸棒杆菌启动子探针载体的构建方法，其特征在于，以载体pXMJ19为模板，用下述引物，扩增得到终止子rrnBT1：
rrnBT1-F:5’-GGTTCCGCGCACATGGTACCTAGCGCCGATGGTAGTGTG；
rrnBT1-R:5’-CGACTCTAGAGGATCCCTCCCGGCGGATTTGTCCTACTC。
4.权利要求1～3任一项所述的谷氨酸棒杆菌启动子探针载体的构建方法构建得到的谷氨酸棒杆菌启动子探针载体。
5.权利要求4所述的谷氨酸棒杆菌启动子探针载体在定量筛选谷氨酸棒杆菌不同强度启动子中的应用。
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