CN103820387A

CN103820387A - 锗基石墨烯的成骨促进用途

Info

Publication number: CN103820387A
Application number: CN201410086554.8A
Authority: CN
Inventors: 狄增峰; 王刚; 李金华; 刘宣勇; 陈达; 郭庆磊; 叶林; 张苗; 丁古巧; 谢晓明
Original assignee: Shanghai Institute of Microsystem and Information Technology of CAS
Current assignee: Shanghai Institute of Microsystem and Information Technology of CAS
Priority date: 2014-03-11
Filing date: 2014-03-11
Publication date: 2014-05-28

Abstract

本发明提供一种锗基石墨烯的成骨促进用途。锗基石墨烯能够明显促进骨髓间充质干细胞早期的碱性磷酸酶表达及后期的骨钙素表达，具有明显的促进骨髓间充质干细胞向成骨方向分化的能力。可以将锗基石墨烯负载到硬组织植入体表面并植入人体或动物体，提高成骨性能和使用效果，促进植入体与骨头的骨整合，促进新骨头的长出。也可以将锗基石墨烯作为成骨促进成分用于治疗骨缺损药物的制备，或者将锗基石墨烯作为成骨促进成分用于治疗骨质疏松药物的制备。此外，锗基石墨烯中的Ge元素还具有抗癌抗衰老的保健功能。

Description

锗基石墨烯的成骨促进用途

技术领域

本发明设计锗基石墨烯的新用途，特别是涉及一种锗基石墨烯的成骨促进用途。

背景技术

近年来，干细胞逐渐成为骨组织工程研究的热点，利用骨组织工程不仅可修复大面积的骨缺损，而且可按需塑形及大量制备，是一种理想的创伤修复方法。干细胞是一种未分化的原始细胞，具有自我更新和分化潜能，一旦生理需要，这些原始细胞就可以按照发育途径，产生分化成熟的细胞，有着巨大的医学应用前景。根据存在部位的不同，干细胞可以分为以下两种类型：胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞在一定条件下可以分化成为人体几乎所有的细胞，具有分化的全能性，但是对周围环境的依赖性较强，在条件不适宜的情况下，容易发生恶性转化而具有成瘤性。成体干细胞也可分化成数种或多种细胞类型，具有分化的多能性，且可以稳定传代和安全性好。

骨髓间充质干细胞和脂肪来源的间充质干细胞是两类已被证实具有多向分化能力的成体干细胞。易于分离获取，且对组织损伤较小，体外培养扩增能力强，早在上个世纪八十年代，大量体内和体外研究均证实了间充质干细胞具有成骨分化潜能，是骨组织工程种子细胞的重要来源。目前对间充质干细胞的研究取得了很大进展，但是仍有很多问题摆在人们面前，其中重要的一点便是：间充质干细胞定向成骨诱导分化的效率较低。

2004年，英国曼彻斯特大学的两位科学家使用微机械剥离的方法发现了石墨烯，并于2010年获得了诺贝尔物理学奖。石墨烯，即石墨的单原子层，是碳原子按蜂窝状排列的二维结构。自从石墨烯被发现以后，由于其优异的性能和巨大的应用前景引发了物理、材料科学和生物医学等领域的研究热潮。锗对人体的影响主要是可以恢复疲劳；防止了贫血；帮助新陈代谢等等。很多地方被当作医疗辅助用具。正常人体中，不会缺乏此类的微量元素，但是现代工业文明的环境下，长期受到化学污染的人体，使得锗元素离子活性有衰退的迹象，适当补充这种微量元素有助于身体机能的健康，另外锗可能对肿瘤有疗效。然而目前，还没有发现锗基石墨烯具有成骨促进用途。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的缺陷，提供锗基石墨烯的新用途。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种锗基石墨烯的成骨促进用途。

可选地，所述成骨促进用途是促进骨髓间充质干细胞早期的碱性磷酸酶表达，促进骨髓间充质干细胞向成骨方向分化。

可选地，所述成骨促进用途是促进骨髓间充质干细胞后期的骨钙素表达，促进骨髓间充质干细胞向成骨方向分化。

可选地，将所述锗基石墨烯作为成骨促进成分用于治疗骨缺损药物的制备。

可选地，将所述锗基石墨烯作为成骨促进成分用于治疗骨质疏松药物的制备。

可选地，所述锗基石墨烯包括一锗层及形成于所述锗层上的石墨烯。

可选地，所述石墨烯为单层、双层或多层石墨烯。

可选地，所述锗基石墨烯的制备方法是：提供一锗层，利用化学气相沉积法在所述锗层上形成石墨烯，得到锗基石墨烯；或者将预先制备好的石墨烯转移至所述锗层上，得到锗基石墨烯。

可选地，所述锗基石墨烯的制备条件是：温度800～910℃，氢气流量2～100sccm，碳源流量0.01～50sccm，石墨烯生长时间1～200min。

可选地，所述成骨促进用途是将锗基石墨烯负载到硬组织植入体表面并植入人体或动物体，以促进所述硬组织植入体与骨头的骨整合及促进新骨头的长出。

可选地，采用如下方法将锗基石墨烯负载到硬组织植入体表面：通过在所述硬组织植入体表面溅射一锗层，并通过化学气相沉积法在所述锗层上形成石墨烯。

可选地，所述硬组织植入体的材料为钛或钛合金。

如上所述，本发明的锗基石墨烯的成骨促进用途，具有以下有益效果：锗基石墨烯能够明显促进骨髓间充质干细胞早期的碱性磷酸酶表达及后期的骨钙素表达，具有明显的促进骨髓间充质干细胞向成骨方向分化的能力。可以将锗基石墨烯负载到硬组织植入体表面并植入人体或动物体，提高成骨性能和使用效果，促进植入体与骨头的骨整合，促进新骨头的长出。也可以将锗基石墨烯作为成骨促进成分用于治疗骨缺损药物的制备，或者将锗基石墨烯作为成骨促进成分用于治疗骨质疏松药物的制备。此外，锗基石墨烯中的Ge元素还具有抗癌抗衰老的保健功能。

附图说明

图1显示为锗基石墨烯的结构剖视图。。

图2显示为锗及两种生长温度制备的锗基石墨烯的拉曼图。

图3显示为不同温度制备的石墨烯的透光率。

图4显示为锗样品及锗基石墨烯样品促进碱性磷酸酶表达的结果。

图5显示为锗样品组及锗基石墨烯样品组促进骨钙素表达的结果。

图6a～6c显示为锗样品组骨钙素的免疫荧光染色结果。

图7a～7c显示为锗基石墨烯样品组骨钙素的免疫荧光染色结果。

元件标号说明

1 锗层

2 石墨烯

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

请参阅图1至图7c。需要说明的是，本实施例中所提供的图示仅以示意方式说明本发明的基本构想，遂图式中仅显示与本发明中有关的组件而非按照实际实施时的组件数目、形状及尺寸绘制，其实际实施时各组件的型态、数量及比例可为一种随意的改变，且其组件布局型态也可能更为复杂。

实施例1锗基石墨烯的制备

本实施例中利用化学气相沉积法（CVD）在Ge上制备石墨烯，工艺流程如下：

提供一锗层，将所述锗层放置于生长腔室中，将锗层加热至预设温度，并在生长腔室中通入氢气及碳源以在所述锗层上生长石墨烯，得到锗基石墨烯。

本实施例中，所述生长腔室以管式炉为例进行说明，其中锗层的尺寸为10毫米×10毫米×175微米，生长温度为800～910℃，氢气流量为2～100sccm，碳源流量0.01～50sccm，石墨烯生长时间1～200min。碳源可以采用CH₄，C₂H₂，C₂H₄或CO等，或者固态碳源。本实施例中，所述锗基石墨烯的制备条件优选为：生长温度为910℃，氢气流量为50sccm，甲烷流量0.1sccm，石墨烯生长时间100min，制备得到的锗基石墨烯包括一锗层及形成与所述锗层上的石墨烯。图1显示为该锗基石墨烯的结构剖视图，包括锗层1及所述锗层1表面的石墨烯2。

在另一实施例中，可以将上述锗基石墨烯分割为更小的尺寸，如微米级。

在另一实施例中，也可以提供更大尺寸的锗层，如晶圆级锗层，并采用上述方法在该晶圆级锗层上形成石墨烯，得到晶圆级的锗基石墨烯，并根据应用的需求将该晶圆级锗基石墨烯分割成所需的尺寸，有利于量产，提高生产效率。

在另一实施例中，也可以将采用化学气相沉积法、离子注入法等方法在其它衬底上预先制备的石墨烯转移至锗层上得到锗基石墨烯。

在另一实施例中，所述锗层可以具有弯曲的外形，或采用圆柱体锗等其他形状。

实施例2锗基石墨烯的表征

本实施例中采用拉曼对实施例1中制备的锗基石墨烯进行了表征，并测试了其上石墨烯的透光率。

图2显示为锗（Ge）及两种生长温度制备的锗基石墨烯（G/Ge）的拉曼图，其中D峰表示锗上石墨烯的缺陷。由图2中可看出，910℃生长的锗基石墨烯（G/Ge910℃）的D峰低于890℃生长的锗基石墨烯（G/Ge890℃），说明生长温度越高，锗上石墨烯质量越好。

图3显示为不同温度制备的石墨烯的透光率，其中910℃生长的石墨烯对于550nm波长可见光的透光率为97.50%，890℃生长的石墨烯对于550nm波长可见光的透光率为97.12%。已知单层Graphene的透光率为97.7%，所以可以判断实施例1中制备的石墨烯为单层。

需要指出的是，本发明的锗基石墨烯中石墨烯不限于单层，在其它实施例中可以通过改变生长时间等参数制备得到双层或多层石墨烯。

实施例3钛上锗基石墨烯的制备

钛及钛合金人造骨头与关节用于人体具有优异的耐腐蚀性，生物学反应也很小，是一种理想的人体植入物。世界各国的相关研究和大量的临床治疗实例，从深度和广度上认可钛及钛合金是迄今为止最理想的人体植入物金属材料，被当今医疗外科业列为继不锈钢、钴基合金之后崛起的第三代金属。

本实施例中，通过在钛金属表面溅射一层锗层，然后将表面形成有锗层的钛金属放置于生长腔室中并加热至预设温度，再在生长腔室中通入氢气及碳源以在所述锗层上生长石墨烯，得到钛上锗基石墨烯，即将锗基石墨烯负载到钛金属上。具体的生长条件与实施例一中相同，此处不再赘述。

在其它实施例中，所述钛金属也可以用钛合金取代。所述钛金属及钛合金可以作为硬组织植入体用于骨缺损的治疗，钛金属和钛合金的形状构造可以根据具体需求进行定制。

将锗基石墨烯负载到硬组织植入体表面并植入人体或动物体，可以提高成骨性能和使用效果，促进植入体与骨头的骨整合，促进新骨头的长出。同时锗元素还具有抗癌、抗衰老等保健作用。

实施例4锗基石墨烯对碱性磷酸酶（ALP）基因表达的影响

本实施例中采用两组样品进行碱性磷酸酶基因表达测试：Ge及G/Ge。其中，样品Ge为纯锗，样品G/Ge为锗基石墨烯，其采用实施例1中的方法制备，生长温度为910℃。两组样品均负载在钛片上。具体操作过程如下：

采用实时定量聚合酶链反应技术检测在样品Ge和样品G/Ge培养4天后骨髓间充质干细胞的碱性磷酸酶基因表达。细胞接种密度约为2×104个/毫升。37°C恒温培养箱中培养1天后，把钛片转入新的24孔板，每孔加入1毫升杜尔伯科改良伊格尔培养液，培养过程中每两天换一次培养液。细胞接种到试样表面4天后，用磷酸盐缓冲溶液清洗试样表面3次，提取试样表面细胞中的总核糖核酸，具体提取步骤如下：

（1）使用1毫升Trizol裂解细胞。

（2）加入0.2毫升氯仿，振荡15秒，室温放置3分钟。

（3）24°C下10000×重力加速度离心15分钟，样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。核糖核酸主要在水相中，水相体积约为500微升。

（4）把水相转移到新管中，加入0.5毫升异丙醇，混匀，室温放置10分钟。

（5）4°C下10000×重力加速度离心10分钟后，在管侧和管底出现的胶状沉淀即为核糖核酸。

（6）移去上清后，用1毫升75%乙醇洗涤核糖核酸沉淀。在4°C下不超过7500×重力加速度离心5分钟，弃上清。

（7）室温下将沉淀放置5～10分钟后，获得干燥的核糖核酸沉淀，即为试样表面细胞中的总核糖核酸。将提取出的核糖核酸溶解于二乙基焦磷酰胺水中，并用紫外可见分光光度计测定核糖核酸溶液的浓度和纯度。采用互补脱氧核糖核酸合成试剂盒，将不同时间点不同试样表面细胞中提取的核糖核酸（1微克）在20微克标准反应体系中转录成为互补脱氧核糖核酸。用实时定量聚合酶链反应系统检测碱性磷酸酶的基因表达水平。每组实验均重复3次。

碱性磷酸酶的表达是成骨分化的早期指标，图4显示为锗样品及锗基石墨烯样品促进碱性磷酸酶表达的结果，其中，数据采用SPSS14统计软件进行数据统计学处理，P<0.05为差异具有统计学意义。如图4所示，相比纯锗，锗上石墨烯结构能够明显促进骨髓间充质干细胞早期的碱性磷酸酶表达，具有明显的促进骨髓间充质干细胞向成骨方向分化的能力。

实施例5锗基石墨烯对骨钙素（OCN）基因表达的影响

与实施例4相同，本实施例中也采用两组样品进行骨钙素基因表达测试：Ge及G/Ge。其中，样品Ge为纯锗，样品G/Ge为锗基石墨烯，其采用实施例1中的方法制备，生长温度为910℃。两组样品均负载在钛片上。具体操作过程如下：

实验样品的成骨相关功能基因表达用定量聚合酶链反应检测。细胞接种密度为2×10⁴/孔，在含10%胎牛血清的杜尔伯科改良伊格尔培养液中培养14天。用Trizol溶解样品表面细胞收集细胞内总核糖核酸，每组八个样品表面的细胞收集到一起以得到足够多的核糖核酸。每组1微克的总核糖核酸用试剂盒反转录为互补核糖核酸。成骨相关基因骨钙素的表达水平在实时定量聚合酶链反应检测系统上检测。

骨钙素的表达是成骨分化的后期标志，图5显示为锗样品组及锗基石墨烯样品组促进骨钙素表达的结果，如图所示，相比纯锗，锗上石墨烯结构能够明显促进骨髓间充质干细胞后期的骨钙素表达，具有明显促进骨髓间充质干细胞向成骨方向分化的能力。

图6a～6c显示为锗样品组骨钙素的免疫荧光染色结果，图7a～7c显示为锗基石墨烯样品组骨钙素的免疫荧光染色结果。其中，图6a及图7a分别显示为两组样品细胞核的免疫荧光染色结果，图6b及图7b分别显示为两组样品细胞核上附着的骨钙素的免疫荧光染色结果，图6c及图7c分别显示为两组样品的染色合图。由图可知，骨钙素的免疫荧光染色结果与定量结果一致，即相比纯锗，锗上石墨烯结构能够明显促进骨髓间充质干细胞后期的骨钙素表达，具有明显促进骨髓间充质干细胞向成骨方向分化的能力。

综上所述，本发明提供了锗基石墨烯的成骨促进新用途，锗基石墨烯能够明显促进骨髓间充质干细胞早期的碱性磷酸酶表达及后期的骨钙素表达，具有明显的促进骨髓间充质干细胞向成骨方向分化的能力。可以将锗基石墨烯负载到硬组织植入体表面（如钛表面）并植入人体或动物体，提高成骨性能和使用效果，促进植入体与骨头的骨整合，促进新骨头的长出。也可以将锗基石墨烯作为成骨促进成分用于治疗骨缺损药物的制备，或者将锗基石墨烯作为成骨促进成分用于治疗骨质疏松药物的制备。此外，锗基石墨烯中的Ge元素还具有抗癌抗衰老的保健功能。所以，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims

1.一种锗基石墨烯的成骨促进用途。

2.根据权利要求1所述的锗基石墨烯的成骨促进用途，其特征在于：所述成骨促进用途是促进骨髓间充质干细胞早期的碱性磷酸酶表达，促进骨髓间充质干细胞向成骨方向分化。

3.根据权利要求1所述的锗基石墨烯的成骨促进用途，其特征在于：所述成骨促进用途是促进骨髓间充质干细胞后期的骨钙素表达，促进骨髓间充质干细胞向成骨方向分化。

4.根据权利要求1所述的锗基石墨烯的成骨促进用途，其特征在于：将所述锗基石墨烯作为成骨促进成分用于治疗骨缺损药物的制备。

5.根据权利要求1所述的锗基石墨烯的成骨促进用途，其特征在于：将所述锗基石墨烯作为成骨促进成分用于治疗骨质疏松药物的制备。

6.根据权利要求1～5任意一项所述的锗基石墨烯的成骨促进用途，其特征在于：所述锗基石墨烯包括一锗层及形成于所述锗层上的石墨烯。

7.根据权利要求6所述的锗基石墨烯的成骨促进用途，其特征在于：所述石墨烯为单层、双层或多层石墨烯。

8.根据权利要求6所述的锗基石墨烯的成骨促进用途，其特征在于，所述锗基石墨烯的制备方法是：提供一锗层，利用化学气相沉积法在所述锗层上形成石墨烯，得到锗基石墨烯；或者将预先制备好的石墨烯转移至所述锗层上，得到锗基石墨烯。

9.根据权利要求8所述的锗基石墨烯的成骨促进用途，其特征在于，所述锗基石墨烯的制备条件是：温度800～910℃，氢气流量2～100sccm，碳源流量0.01～50sccm，石墨烯生长时间1～200min。

10.根据权利要求1所述的锗基石墨烯的成骨促进用途，其特征在于：所述成骨促进用途是将锗基石墨烯负载到硬组织植入体表面并植入人体或动物体，以促进所述硬组织植入体与骨头的骨整合及促进新骨头的长出。

11.根据权利要求10所述的锗基石墨烯的成骨促进用途，其特征在于，采用如下方法将锗基石墨烯负载到硬组织植入体表面：通过在所述硬组织植入体表面溅射一锗层，并通过化学气相沉积法在所述锗层上形成石墨烯。

12.根据权利要求11所述的锗基石墨烯的成骨促进用途，其特征在于：所述硬组织植入体的材料为钛或钛合金。