CN103820377A - 一种产Kdo2-lipidA的基因工程菌及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种产Kdo2-lipidA的基因工程菌及其构建方法和应用，属于遗传工程领域。所述基因工程菌为WJW00，所述基因工程菌为无抗性E.coliW3110△rfaD，其中rfaD发生缺失突变失活。本发明构建的菌株Kdo₂-lipidA结构正确，生长状况良好，没有引入任何外源抗性基因序列，更有利于大规模工业化生产。

Description

一种产Kdo2-lipidA的基因工程菌及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及一种产Kdo₂-lipidA的基因工程菌及其构建方法和应用，是一种无抗性的Kdo₂-lipidA大肠杆菌生产菌。

技术背景

Kdo₂-lipidA是体现革兰氏阴性菌毒力的疏水性成分，其可以被宿主免疫细胞表面的TLR4/MD2所识别，是感染宿主的毒力因子。随着人们对其致病机制的深入研究，脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）、Kdo₂-lipidA和类脂A广泛用于动物免疫实验。Kdo₂-lipidA携带类脂A毒力因子，可以达到刺激细胞相同的反应，但是通过基因工程构建的类脂A结构菌株只能在低温下生长，且生长状况非常差。通过化学降解方法提取类脂A的过程繁琐，成本又高。而LPS具有较多缺点，如分子较大，在反应体系中分散不均一，并且细胞刺激反应前后LPS不易于被检测等。而Kdo₂-lipidA分子较小，分散均一，也易被ESI/MS等方法检测。同时，1μgKdo₂-lipidA相当于10μgLPS所引起的反应，而且同样实验反应的花费也仅为LPS的一半。因此，通过基因工程构建一株可以产Kdo₂-lipidA的大肠杆菌可以解决上述问题。目前，Kdo₂-lipidA的生产菌主要是WBB06菌株。现有菌株的缺点在于：第一、WBB06生长状态较野生型差很多，最终菌体量少；第二、WBB06菌带有氨苄青霉素和四环素抗性标记；第三、WBB06的基因组序列并不清晰，即遗传背景不清楚。本发明是构建了一株不带任何抗性标记，遗传背景很清晰，且生长状况较好的生产Kdo₂-lipidA的大肠杆菌基因工程菌。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种无任何抗性标记，生长状况良好的产Kdo₂-lipidA的新型基因工程菌，以适应大规模生产。

为解决上述技术问题，本发明提供的基因工程菌为E.coliW3110△rfaD，即WJW00，其中rfaD发生缺失突变失活。

本发明还提供了一种构建上述基因工程菌的方法，将人工构建的rfaD敲除片段电转化入含pKD46质粒的E.coliW3110，获得突变株E.coliW3110ΔrfaD-Fkan，再化转入pCP20质粒，通过位点特异性重组敲除卡那霉素抗性基因；去除pCP20质粒后获得无抗性产Kdo₂-lipidA的基因工程菌。

所述位点特异性重组为FLP酶介导的FRT位点特异性重组，最终42℃培养去除pCP20质粒，获得无抗性产Kdo₂-lipidA的基因工程菌。

所述rfaD基因敲除片段的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。

SEQINNO.1:

tccgttacac cttcagcaac ggttttgaac ggtttgtcgt aacccgccgc gcgcagattt   60

gtcagatctg cctgagtgaa cgcctgatag cggcctttca gtttatccgg gaacggaatg  120

tattcgatct ggcctttctt gtgataagcc agcgtagcat cagctaccgc ctggaaggat  180

tccgcacgac cagtaccgag attgaagatg ccggaaacgc cattttccag gaaccacaga  240

ttcacatcag ccacgaattc gtgtaggctg gagctgcttc gaagttccta tactttctag  300

agaataggaa cttcggaata ggaacttcaa gatcccctta ttagaagaac tcgtcaagaa  360

ggcgatagaa ggcgatgcgc tgcgaatcgg gagcggcgat accgtaaagc acgaggaagc  420

ggtcagccca ttcgccgcca agctcttcag caatatcacg ggtagccaac gctatgtcct  480

gatagcggtc cgccacaccc agccggccac agtcgatgaa tccagaaaag cggccatttt  540

ccaccatgat attcggcaag caggcatcgc catgggtcac gacgagatcc tcgccgtcgg  600

gcatgcgcgc cttgagcctg gcgaacagtt cggctggcgc gagcccctga tgctcttcgt  660

ccagatcatc ctgatcgaca agaccggctt ccatccgagt acgtgctcgc tcgatgcgat  720

gtttcgcttg gtggtcgaat gggcaggtag ccggatcaag cgtatgcagc cgccgcattg  780

catcagccat gatggatact ttctcggcag gagcaaggtg agatgacagg agatcctgcc  840

ccggcacttc gcccaatagc agccagtccc ttcccgcttc agtgacaacg tcgagcacag  900

ctgcgcaagg aacgcccgtc gtggccagcc acgatagccg cgctgcctcg tcctgcagtt  960

cattcagggc accggacagg tcggtcttga caaaaagaac cgggcgcccc tgcgctgaca 1020

gccggaacac ggcggcatca gagcagccga ttgtctgttg tgcccagtca tagccgaata 1080

gcctctccac ccaagcggcc ggagaacctg cgtgcaatcc atcttgttca atcatgcgaa 1140

acgatcctca tcctgtctct tgatcagatc ttgatcccct gcgccatcag atccttggcg 1200

gcaagaaagc catccagttt actttgcagg gcttcccaac cttaccagag ggcgccccag 1260

ctggcaattc cggttcgctt gctgtccata aaaccgccca gtctagctat cgccatgtaa 1320

gcccactgca agctacctgc tttctctttg cgcttgcgtt ttcccttgtc cagatagccc 1380

agtagctgac attcatccgg ggtcagcacc gtttctgcgg actggctttc tacgtgttcc 1440

gcttccttta gcagcccttg cgccctgagt gcttgcggca gcgtgagctt caaaagcgct 1500

ctgaagttcc tatactttct agagaatagg aacttcgaac tgcaggtcga cggatccccg 1560

gaattaattc tcatgtttga cagcttatca ctgatcagtg aattaatggc aagctttact 1620

tgccgtccca ctcggtggtg gaagagcacg cgccttcgtg gaaaatcgct tcgacatcgc 1680

cgaactcttc gccagccata atctggatca ggaagtcttc cttatccata tagtctgcga 1740

tattcagatc caccaggttc acaaacttgg tgccgtcttt caggttgtcc accaccagaa 1800

tatcggtgatgcctttatcattcagggctttaacgatgttgctgccgata aagc           1854

本发明要解决的另一个技术问题是提供一种利用所述基因工程菌生产Kdo₂-lipidA的方法。其中发酵方法为常规发酵方法，Kdo₂-lipidA的提取方法为：

将过夜培养的菌液按初始OD₆₀₀=0.02转接到200mLLB液体培养基中，37℃培养至菌体对数期后期时，8000rpm离心10min收集菌体，0.1MNaCl溶液洗涤菌体一次后用Bligh-Dyer一相体系（氯仿/甲醇/1.0MNaCl溶液，1:2:0.8，v/v/v）76mL悬浮菌体，磁力搅拌1h，2000rpm离心30min分相，取上相，弃沉淀，加入20mL氯仿和20mL1.0MNaCl溶液配成Bligh-Dyer二相体系（氯仿/甲醇/1.0MNaCl，2:2:1.8，v/v/v），2000rpm离心30min，取下相移入旋蒸瓶中，旋转蒸发；最后加入氯仿/甲醇溶液（2:1，v/v）将Kdo₂-lipidA洗出。

Kdo₂-lipidA的检测、分析：

薄层层析（TLC）检测：将样品点于Gel60TLC板上，Kdo₂-lipidA展层剂为氯仿/甲醇/水/氨水（25:15:4:2，v/v/v/v）。层析结束后吹干板上残留的展层剂，用溶于乙醇的10%硫酸进行碳化，置于加热板上显色。

ESI/MS分析：类脂样品溶于氯仿/甲醇溶液（2:1，v/v）中，在WATERSSYNAPTQ-TOFMassSpectrometer质谱仪上进行质谱检测。采用ESI离子源，阴离子检测模式，检测范围小于m/z2500。ESI/MS/MS分析：在ESI/MS分析后对Kdo₂-lipidA结构特征峰进行二级质谱分析，仍为ESI离子源，阴离子检测模式，设定合适的碰撞电压-50V，检测范围小于m/z2500。

本发明提供的基因工程菌在保持Kdo₂-lipidA结构单一、正确，且没有引入任何抗性标记，菌株生长状态良好，更有利于大规模工业化生产。

附图说明

图1基因工程菌WJW00脂多糖结构的SDS-PAGE银染分析

图2基因工程菌WJW00脂多糖结构的TLC分析；(a)采用Kdo₂-lipidA提取方法，野生型大肠杆菌W3110，基因工程菌WJW00及WBB06菌株总脂质样品的TLC分析；(b)采用类脂A提取方法，野生型大肠杆菌W3110，基因工程菌WJW00及WBB06菌株脂质样品的TLC分析；

图3基因工程菌WJW00的Kdo₂-lipidA样品的ESI/MS分析；(a)基因工程菌WJW00的总脂质样品的ESI/MS分析；(b)基因工程菌WJW00的Kdo₂-lipidA结构的ESI/MS分析。

图4菌株W3110、WJW00和WBB06生长曲线

具体实施方式

实施例1突变株E.coliW3110△rfaD的构建

1、rfaD基因敲除片段的获得

采用化学全合成或PCR分步扩增的方法获得rfaD基因敲除片段，其两端为rfaD基因上下游同源臂、中间为带有FRT位点的kan片段。rfaD基因敲除片段的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。将rfaD基因敲除片段克隆到pBlueScriptIISK(+)，获得重组质粒pBlueScript IISK(+)-rfaDU-Fkan-rfaDD。以该质粒为模板，可以扩增获得敲除片段rfaDU-Fkan-rfaDD。

2、敲除感受态的制备及电转化

接种带有Red重组辅助质粒pKD46（DatsenkoKA,Wanner BL.One-Step inactivation ofchromosomal genes in Escherichia coli K-12using PCR products.Proc Natl Acad Sci USA,2000,97(12):6640-6645）的大肠杆菌W3110（ATCC39936）于含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，30℃，200rpm过夜培养。按2%接种量转接100mLLB液体培养基，30℃，200rpm培养至OD₆₀₀=0.2时加入L-阿拉伯糖（终浓度为30mmol/L）诱导重组酶的表达，继续培养至OD₆₀₀=0.5，将培养液冰浴半小时后转入预冷的50mL离心管中，4℃，8000rpm离心10min收集菌体，沉淀用预冷的10%甘油洗涤3次，最后用1mL10%甘油悬浮，每管80μL分装至预冷的无菌EP管中。

将500-1000ngrfaD敲除片段加入感受态细胞中，混匀，冰浴15min，1.5kv电击5ms，30℃孵育2h，涂布30μg/mL卡那霉素的LB固体平板，30℃培养，挑取转化子于含30μg/mL卡那霉素及100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，PCR验证结果。

3、突变株抗性标记的去除

将PCR验证阳性的菌株接种含30μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，42℃过夜培养，将培养液划线30μg/mL卡那霉素的LB固体平板，37℃培养，挑取单菌落验证其对氨苄青霉素的敏感性，将含有卡那霉素抗性并对氨苄青霉素敏感的菌株命名为W3110△rfaD::kan并保藏。以此为出发菌株做感受态，转入pCP20质粒（CherepanovPP,WackernagelW.Genedisruption in Escherichia coli:Tc^R and Km^Rcassettes with the option of Flp-catalyzed excision ofthe antibiotic-resistance determinant.Gene,1995,158(1):9-14），42℃热激表达FLP酶，将阳性菌株于含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，加入L-阿拉伯糖（终浓度为30mmol/L）诱导Flp重组酶的表达，介导FRT位点特异性重组，PCR验证挑选转化子。将PCR验证正确的菌株42℃热激后划线LB平板，挑取单菌落验证其对氨苄青霉素及卡那霉素的敏感性，选取对两种抗生素均敏感的菌株命名为W3110△rfaD并保藏。

实施例3突变菌株E.coliΔrfaD的脂多糖结构分析

1、突变菌株E.coliΔrfaD脂多糖的提取

突变菌株E.coliΔrfaD、野生型W3110及WBB06的LPS提取脂多糖提取方法采取经典的热酚法。接种5mLLB培养基，过夜培养培养2h，OD=0.5时IPTG诱导4h）。取1.5mL菌液12000rpm离心3min收集菌体。用100μL1×TAEBuffer彻底悬浮菌体。再加入200μL溶液Ⅰ（3gSDS；0.6gTrizmabase（Tris）；6.4mL2MNaOH；100mLddH2O），55-60℃温育70min或沸水浴15min。然后按体积比1：1加入等体积的苯酚/氯仿混匀，12000rpm，3min离心取上相，重复2～3次。加入200μLddH2O，50μL3M的NaAc（pH5.2）混匀，2倍体积无水乙醇沉淀LPS（12000rpm、3min）。将沉淀溶解在200μL溶液Ⅱ中（50mMTris-HCLpH8.0；100mMNaAc），2倍体积无水乙醇沉淀LPS。将所得沉淀溶解在50μL水中（LPS的浓度约为2mg/mL(100ug)）。

2、SDS-PAGE银染分析

采用常规制胶方法配置4%浓缩胶+15%分离胶浓度的聚丙烯凝胶。取一定量的LPS溶液（10μL）加入等体积的电泳上样缓冲液（50MTris-HCLpH6.8；2%SDS；10%蔗糖；0.01%溴酚蓝），100℃水浴5min。点样10μL，电泳，浓缩胶和分离胶的电流分别为12mA和25mA。条带跑出大约10cm时结束电泳，染色。电泳完毕后，取下凝胶至去离子水中冲洗2遍，然后开始固定，40%乙醇，4%乙酸震荡过夜。氧化：40%乙醇，4%乙酸，0.7%过碘酸22℃处理20min。水洗：ddH₂O洗涤三次，每次5min。染色：溶液Ⅲ处理10min。（4mL浓氨水+56mL0.1MNaOH+200mLddH₂O+10mL20%AgNO₃+ddH2O=300mL）。水洗：ddH₂O洗涤三次，每次5min。显色：溶液Ⅳ处理1min。（10mg柠檬酸+0.1mL10%乙酸+200mLddH₂O）。水洗：ddH₂O洗涤三次，每次5min。比较各菌株的LPS条带大小，分析结构。SDS-PAGE银染结果表明，E.coliΔrfaD的LPS大小和WBB06一致，较野生型W3110的LPS小，当回补后LPS大小回复为野生型大小。

实施例4突变菌株E.coliΔrfaD的Kdo₂-lipidA结构分析

1、突变菌株E.coliΔrfaD的Kdo₂-lipidA提取及薄层层析（TLC）分析

Kdo₂-lipidA的提取方法采用氯仿/甲醇/1.0MNaCl溶液混合相萃取法。将过夜培养的菌液按初始OD₆₀₀=0.02转接到200mLLB液体培养基中，37℃培养至菌体对数期后期时，8000rpm离心10min收集菌体，0.1MNaCl溶液洗涤菌体一次后用Bligh-Dyer一相体系（氯仿/甲醇/1.0MNaCl溶液，1:2:0.8，v/v/v）76mL悬浮菌体，磁力搅拌1h，2000rpm离心30min分相，取上相并加入20mL氯仿和20mL1.0MNaCl溶液配成Bligh-Dyer二相体系（氯仿/甲醇/1.0MNaCl溶液，2:2:1.8，v/v/v），2000rpm离心30min，取下相移入旋蒸瓶中，旋转蒸发。加入氯仿/甲醇溶液（2:1，v/v）将Kdo₂-lipidA洗出。接着进行薄层层析（TLC）检测，将样品点于Gel60TLC板上，展层剂为氯仿/甲醇/水/氨水（25:15:4:2，v/v/v/v）。层析结束后吹干板上残留的展层剂，用溶于乙醇的10%硫酸进行碳化，置于加热板上显色（结果如图2(a)）。

TLC结果显示该方法提取野生型大肠杆菌只有磷酸而无Kdo₂-lipidA，而突变株E.coliΔrfaD和WBB06菌株一致，不仅存在磷脂点，还有Kdo₂-lipidA点。

2、野生型菌株W3110、突变菌株E.coliΔrfaD和WBB06的类脂A提取及薄层层析（TLC）分析

类脂A的提取方法采用氯仿/甲醇/水溶液混合相萃取法。类脂A的提取采用氯仿/甲醇/水混合相萃取法。将过夜培养的菌液按初始OD₆₀₀=0.02转接到200mLLB液体培养基中，37℃培养至OD₆₀₀=1时8000rpm离心10min收集菌体，ddH₂O洗涤菌体一次后用Bligh-Dyer一相体系（氯仿/甲醇/水，1:2:0.8，v/v/v）悬浮菌体，磁力搅拌1h，2000rpm离心30min分相，使用一相体系洗涤细胞碎片2-3次。加入27mL12.5mM的醋酸钠（PH4.5）溶液，超声震荡10min，100℃水浴30min裂解糖链。冷至室温后加入30mL氯仿和30mL甲醇配成Bligh-Dyer二相体系（氯仿/甲醇/水，2:2:1.8，v/v/v），2000rpm离心10min，取下相移入旋蒸瓶中，旋转蒸发。加入氯仿/甲醇溶液（2:1，v/v）将类脂A洗出。接着进行薄层层析（TLC）检测，将样品点于Gel60TLC板上，展层剂为氯仿/甲醇/水/氨水（40:25:4:2，v/v/v/v）。层析结束后吹干板上残留的展层剂，用溶于乙醇的10%硫酸进行碳化，置于加热板上显色（结果如图2(b)）。

TLC结果显示野生型大肠杆菌类脂A（泳道1）成分明显，而突变株WJW00和WBB06的类脂A（泳道2、3）除了淡淡的磷脂点无类脂A成分点，证明突变菌株用类脂A提取的方法已经获得不了菌株的类脂A，说明其结构已经不再是完整的LPS，而是疏水性更强的Kdo₂-lipidA了。

以上TLC结果证明WJW00突变株和WBB06一致，可产生Kdo₂-lipidA结构的LPS.

3、Kdo₂-lipidA结构的ESI/MS和ESI/MS/MS分析

类脂样品溶于氯仿/甲醇溶液（2:1，v/v）中，在WATERSSYNAPTQ-TOFMassSpectrometer质谱仪上进行质谱检测。采用ESI离子源，阴离子检测模式，检测范围小于m/z2500。突变株WJW00的LPS结构为Kdo₂-lipidA，m/z值为2236.2，而野生型大肠杆菌LPS结构为含有核心糖结构，采用Kdo₂-lipidA提取方法不能获得相应结构和类脂A结构。对WJW00工程菌株的Kdo₂-lipidA特征峰2236.2进行ESI二级质谱，MS/MS结果显示除2236.2特征峰外，有m/z=2016.2和m/z=1796.3两个特征峰，分别对应Kdo₂-lipidA丢失一个和两个Kdo糖分子的结构分子量。一个Kdo糖分子的分子量为220.进一步说明WJW00基因工程菌可以生产Kdo₂-lipidA。

实施例5菌株生长状态比较

在LB固体平板上活化W3110、WJW00和WBB06三菌株，分别挑取三个单菌落接至5mLLB液体培养基中。尽管WBB06有氨苄氯霉素抗性盒四环素抗性，为了避免抗生素对菌体生长的影响，因此在LB液体中都不加抗生素。试管培养6h后OD₆₀₀约为2.5时转接，按照初始OD₆₀₀=0.02转接到盛有50mLLB液体培养基的250mL三角瓶中，37℃培养28h，取不同时间点的菌液，测定菌液OD。重复三次，取平均值。突变株WJW00无抗性标记，无污染隐患，生长状况良好，更有利于大规模工业化生产。

虽然本发明以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (6)

1.一种产Kdo₂-lipidA的基因工程菌，其特征在于所述基因工程菌为无抗性E.coliW3110△rfaD，其中rfaD发生缺失突变失活。

2.权利要求1所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于包括如下步骤：

将人工构建的rfaD敲除片段电转化入含pKD46质粒的E.coliW3110，获得突变株E.coliW3110ΔrfaD-Fkan，再化转入pCP20质粒，通过位点特异性重组敲除卡那霉素抗性基因；去除pCP20质粒后获得无抗性产Kdo₂-lipidA的基因工程菌。

3.权利要求2所述的方法，其特征在于位点特异性重组为FLP酶介导的FRT位点特异性重组，最终42oC培养去除pCP20质粒，获得无抗性产Kdo₂-lipidA的基因工程菌。

4.权利要求2或多所述的方法，其特征在于所述rfaD基因敲除片段的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

5.权利要求1所述基因工程菌在发酵生产Kdo₂-lipidA的应用。

6.权利要求5所述的应用，其特征在于以权利要求1构建的基因工程菌为生产菌株，采用常规发酵后，对Kdo₂-lipidA进行提取，提取方法为：收集发酵后的菌体，0.1MNaCl溶液洗涤菌体一次后用Bligh-Dyer一相体系76mL悬浮菌体，磁力搅拌1h，2000rpm离心30min分相，取上相，弃沉淀，加入20mL氯仿和20mL1.0MNaCl溶液配成Bligh-Dyer二相体系，2000rpm离心30min，取下相移入旋蒸瓶中，旋转蒸发；最后加入氯仿/甲醇溶液（2:1，v/v）将Kdo₂-lipidA洗出；所述Bligh-Dyer一相体系成分为氯仿/甲醇/1.0MNaCl溶液体积比为1:2:0.8。

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