CN103819534B - 葎草鲜嫩茎叶中同时分级提取葎草叶蛋白和总黄酮的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种葎草鲜嫩茎叶中同时分级提取葎草叶蛋白和总黄酮的方法，先取葎草茎叶，洗净晾干后，测定含水量和湿重，并将其切成片段；再加入蒸馏水后进行匀浆，匀浆后压滤得到葎草浆汁和滤饼；葎草浆汁经过加热、碱沉淀、离心得上清液和沉淀，沉淀经冷冻干燥即得葎草叶蛋白；然后将滤饼和上清液混合，在碱性条件下提取、进行酸沉，离心，将所得沉淀经水洗、乙醇溶解、抽滤后，将滤液浓缩、冷冻干燥即得葎草总黄酮。本发明在一次工艺流程中同时分级提取葎草叶蛋白和葎草总黄酮，操作方便、提取工艺条件准确可靠、得率和纯度高，使葎草中的叶蛋白和黄酮这两种重要的有效成分能同时得以开发利用，提升了葎草资源的开发利用价值。

Description

葎草鲜嫩茎叶中同时分级提取葎草叶蛋白和总黄酮的方法

技术领域

本发明属于植物有效成分提取工艺的方法，具体涉及一种葎草鲜嫩茎叶中同时分级提取葎草叶蛋白和总黄酮的方法。

背景技术

葎草[Humulusscandens(Lour.)Merr.]又名拉拉藤、拉拉秧、五爪龙、大叶五爪龙、割人藤等，为桑科葎草属草本植物，分布于我国除新疆、青海以外的所有省份，资源十分丰富。葎草营养成分较为全面，据分析，葎草鲜草粗脂肪、粗纤维的含量分别为0.6%、2.1%。葎草干物质中含有粗蛋白12.8%～20.46%，总黄酮含量约为2.03%，粗纤维15.4%～23.2%，无氮浸出物33.4%～41.8%，灰分7.1%～9.8%，钙0.84%～1.46%，磷0.26%～0.32%，以及Fe、Mn、Cu、Zn、VC、VE、叶绿素、胡萝卜素等多种微量元素及维生素。此外，葎草还含有木犀草素、葡萄糖甙、胆碱、挥发油、树脂等物质及葎草酮、蛇麻酮、牡荆素、B-葎草烯、石竹烯等多种化学活性物质。从而具有清热解毒、利尿消肿、消炎除湿、健胃化食等多种药理功效。因此，葎草具有很好的开发利用价值。

目前有关葎草叶蛋白提取的工艺只有王桃云等进行了研究（王桃云等，葎草叶蛋白提取工艺的优化，苏州科技学院学报--自然科学版，2005，22-1：59～64），但其提取工艺只试验了单因素对叶蛋白得率的影响，未能进行多因素综合试验，致使工艺的稳定性和重复性较差，另外葎草叶蛋白的得率也较低。

葎草黄酮的提取工艺研究有很多，但多是采用乙醇溶液提取。目前，提取葎草叶蛋白和黄酮的方法各自分开，都是以提取单项物质为目的，这样导致这些工艺存在重复处理、费时，无法对葎草资源进行深度利用，浪费葎草资源等问题。对于从葎草鲜嫩茎叶中同时分级提取叶蛋白和总黄酮的工艺尚无先例，而葎草茎叶中富含蛋白质（干物质百分含量达12.8%～20.46%）和总黄酮（干物质百分含量约为2.03%）。因此，研发出一种从葎草鲜嫩茎叶中同时分级提取叶蛋白和总黄酮的方法，对于提高葎草鲜嫩茎叶加工的效益，深度开发和利用葎草资源具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种葎草鲜嫩茎叶中同时分级提取葎草叶蛋白和总黄酮的方法，使得葎草中的叶蛋白和黄酮这两种重要的有效成分能同时得以开发利用，所得叶蛋白和总黄酮得率、纯度较高，叶蛋白提取率在85%以上、纯度在60%以上，总黄酮提取率在85%以上、纯度在60%以上，工艺条件准确可靠、适用于大规模生产。

葎草鲜嫩茎叶中同时分级提取葎草叶蛋白和总黄酮的方法，包括以下步骤：

步骤1，取葎草茎叶，洗净晾干后，测定含水量和湿重，然后将其切成片段；

步骤2，将步骤1所得葎草茎叶加入9～11倍重量的水中，匀浆4～6min，然后压滤得到葎草浆汁和滤饼；

步骤3，将步骤2所得葎草浆汁先在pH9～11、65～75℃条件下进行加热和碱性沉降，然后离心得上清液和沉淀，沉淀物经冷冻干燥即得葎草叶蛋白；

步骤4，将步骤2所得葎草浆汁和步骤3所得上清液混合，在pH9～11、70～90℃条件下提取30～90min，然后滴加酸液调节pH2～4，离心，所得沉淀经水洗、乙醇溶解、抽滤后，将滤液浓缩、冷冻干燥即得葎草叶总黄酮。

作为上述发明的进一步优选，所述步骤2中匀浆时间为5.5min。

作为上述发明的进一步优选，所述步骤3中碱性沉降pH为10，沉降温度为71℃。

作为上述发明的进一步优选，所述步骤4中提取条件为pH11、温度90℃，提取时间为30min，滴加酸液后混合液pH为3。

本发明与现有技术相比，其显著优点在于：第一，本发明在一次工艺工程中同时分级提取葎草叶蛋白和葎草总黄酮，使得葎草中的叶蛋白和黄酮这两种重要的有效成分能同时得以开发利用，提升了葎草资源的开发利用价值；第二，本发明克服了以往葎草总黄酮制备工艺中采用比色法定量导致测定总黄酮含量偏高且不能直接获取总黄酮的缺点，利用优化的碱提酸沉法获得较高纯度的葎草总黄酮；第三，所得叶蛋白和总黄酮得率、纯度较高，叶蛋白提取率在85%以上、纯度在60%以上，总黄酮提取率在85%以上、纯度在60%以上；第四，采用响应面和正交设计方法优化葎草叶蛋白和葎草总黄酮的提取工艺，确保了提取工艺条件准确可靠，具有安全、经济等特点，适用于大规模生产。

附图说明

图1为提取葎草叶蛋白和葎草总黄酮的工艺流程图；图2为葎草叶蛋白沉降温度与打浆时间对葎草叶蛋白得率的响应面和等值线图；图3为葎草叶蛋白沉降pH与打浆时间对葎草叶蛋白得率的响应面和等值线图；图4为葎草叶蛋白沉降温度与葎草叶蛋白沉降pH对葎草叶蛋白得率的响应面和等值线图。

具体实施方式

实施例1

参照图1所示，葎草鲜嫩茎叶中同时分级提取葎草叶蛋白和总黄酮的方法，包括以下步骤：

步骤1，取8月份采集的鲜嫩葎草茎叶，用蒸馏水洗净，在常温下晾干外表水，测定其含水量和重量后，将其直切成约0.5cm长度片段；

步骤2，将步骤1所得葎草茎叶加入重量10倍的水中，用高速匀浆机将其制作成匀浆状，然后将汁液完全压滤出来；

步骤3，在单因素试验基础上，根据Box-Behnken的中心组合设计原理，以打浆时间、叶蛋白沉降温度和叶蛋白沉降pH三个因素为自变量(分别以X₁，X₂，X₃表示)，以葎草叶蛋白得率为响应值设计了三因素三水平共15个实验点的响应面分析实验，其中15个实验点分为12个析因点和3个零点。

步骤4，以步骤2所得滤渣和步骤3叶蛋白沉淀后离心所得的上清液为原料，在单因素试验基础上，选取对葎草总黄酮制备影响较大的因素，根据正交设计法设计原理，设计四因素三水平的试验，研究碱提pH、提取温度、提取时间及酸沉pH对葎草总黄酮得率的影响；然后将葎草总黄酮沉淀物进行蒸馏水洗涤，乙醇溶解、抽滤、旋转蒸发浓缩和冷冻干燥处理，得到总黄酮。

1.响应面试验

(1)响应面试验具体包括如下几个方面实验：

X₁：打浆时间（4min～6min）对葎草叶蛋白得率的影响

X₂：葎草叶蛋白沉降温度（65℃～75℃）对葎草叶蛋白得率的影响

X₃：葎草叶蛋白沉降pH（9～11）对葎草叶蛋白得率的影响

(2)响应面试验设计表：

表1三因素三水平响应面分析试验设计表

实验以随机次序进行，将实验所得的葎草叶蛋白得率用Design-Expert8.06程序进行分析，并得出响应面分析图、回归拟合方程以及方差分析表。响应面实验设计与结果见表2。

表2响应面中心组合实验方案及结果

(3)模型的建立与方差分析

根据Box-Behnken中心组合设计原理，利用Design-Expert.V8.0.6软件对表2中的实验数据进行多元回归拟合，可得打浆时间、叶蛋白沉降温度和叶蛋白沉降pH与葎草叶蛋白得率之间相互关系的二次多元回归方程:

Y=-36.59859+0.64356*X₁+0.67850*X₂+2.28775*X₃-5.70000E-003*X₁*X₂-0.010863*X₁*X₃-1.74250E-003*X₂*X₃-0.011950*X₁ ²-4.43900E-003*X₂ ²-0.10529*X₃ ²

式中X₁、X₂、X₃的各项系数的绝对值大小直接反映出各因素对葎草叶蛋白得率的影响程度，系数的正负反映出葎草叶蛋白得率增加或减小。对表2中的实验结果进行统计分析，分析结果如表3所示。

表3回归模型方差分析表

由表2可知，模型中一次项中葎草叶蛋白沉降温度(X₂)对方程影响最显著，说明这葎草叶蛋白沉降温度直接关系到葎草叶蛋白得率；二次项中的葎草叶蛋白沉降温度(X₂)和葎草叶蛋白沉降pH(X₃)达到极显著水平，葎草叶蛋白沉降温度(X₂)和葎草叶蛋白沉降pH对葎草叶蛋白的影响也呈二次关系。由F值可知，各因素对葎草叶蛋白得率的影响次序为：葎草叶蛋白沉降温度(X₂)＞打浆时间(X1)＞葎草叶蛋白沉降pH(X₃)。整体模型的Prob>F值小于0.01，表明该回归模型达到极显著水平；回归模型的相关系数R²=0.9758，且失拟项不显著（Prob>F值为0.0652，大于0.05）,说明模型与数据之间拟合度很好，因此可以用该回归方程代替试验真实点对试验结果进行分析。

同时做出中心组合设计试验所得的三组响应面曲面图，参见图2、3、4。

(4)葎草叶蛋白最佳提取条件的预测与检验

响应面图形是特定的响应值Y对应的因素X1、X2、X3构成的一个三维空间在二维平面上的等高图，可以直观地反映各因素的交互作用以及对响应值的影响。图中可看到拟合曲面有最大值，对拟合方程求偏导，可得出模型最大值，即为最优的试验方案。

在实验范围内，通过Design-Expert.V8.0.6软件对回归方程分析预测，得出葎草叶蛋白的最优提取工艺条件为：打浆时间为5.46min，沉降温度为70.95℃，超碱性沉降pH为10，然后再将沉降pH值调节到2进行酸性沉降，理论最高得率为6.64％。

为验证响应面分析法所得结果的可靠性，采用上述优化条件进行试验。考虑到实验的可操作性，将实验条件适度调整为：打浆时间为5.5min，沉降温度为71℃，超碱性沉降pH为10，然后再将沉降pH调节到3进行酸性沉降。在此工艺条件下，葎草叶蛋白得率的平均值为6.75％，与预测得率的误差为1.6％。说明了回归方程的预测值与试验值之间具有较好的拟合度。因此，基于响应面法所得的优化工艺参数准确可靠，具有实用价值。

(5)葎草叶蛋白分析

1）氨基酸测定

标准曲线的制备：将氨基酸标准品放在氨基酸分析上进行分析，直到每种氨基酸都分开有独自的峰即得到准确的标准曲线。

准确称取0.1g左右的样品置于安碚瓶中，加入3mL1:1的盐酸后用酒精喷灯封口，将安瓿瓶置于105℃的恒温干燥箱中消解24h。然后取出安瓿瓶冷却，用切割刀将安瓿瓶的口打开，样品倒入小烧杯中用氢氧化锂把pH调至2.2后定容到50mL。此时的样品过0.22um的滤膜后装入样品瓶中上样进行分析。

氨基酸计算公式： $X=\frac{A\×2\×{10}^9\×V\×M}{A_0\×V_0\×{10}^3}$

式中：A——所得峰面积；

A0——标准品峰面积；

V——样品体积，即50mL；

V₀——上样量，即20ul；

M——对应氨基酸的分子量；

m——样品的质量；

2——标准品中氨基酸的质量分数，单位为nmol；

10^-9——将2nmol转换成2mol的系数；

10^-3——将20ul转换成20mL的系数。

测定结果如表4所示:

表4葎草叶蛋白氨基酸含量测定结果

由表4可知，所得葎草叶蛋白富含17种氨基酸，其中7种人体必需氨基酸及总氨基酸的含量都较高。

2）葎草中总蛋白含量测定

通过凯氏定氮法对所用的葎草原料中的总蛋白含量进行了测定，测得其总蛋白含量为干物质17.6%。

3）葎草叶蛋白纯度、得率及提取率测定

通过凯氏定氮法对所得的葎草叶蛋白的纯度进行了测定，测得其纯度为60%，以葎草叶蛋白粗品得率为6.75％，葎草含水率为75%来计算，葎草叶蛋白的最后得率为干物重的16.2%，即：每100g葎草干物质，可得16.2g葎草叶蛋白，根据葎草中所含总蛋白为干物质的17.6%可知，葎草叶蛋白的提取率达92%。

2.正交设计法优化葎草总黄酮提取工艺

(1)正交试验设计

在单因素试验基础上，以葎草叶蛋白沉降完成后所得的上清液为提取剂，用碱提pH、提取温度、提取时间和酸沉pH值这四个因素，进行四因素三水平的正交实验，以获得优化的葎草总黄酮的提取工艺。实验设计如表5所示。

表5正交试验设计表

(2)正交实验设计与结果

表6正交试验结果表

(备注:K₁、K₂、K₃为同一水平葎草总黄酮得率的平均值；R为极差)

由表6的实验结果及极差分析可知，根据各因素的极值可以看出，各因素对木质素产率的影响大小依次为提取时间＞提取温度＞碱提pH＞酸沉pH。各因素中，提取时间和提取温度对葎草总黄酮得率的影响最为显著。

通过直观分析可知，最优组合条件为A₃B₃C₁D₂，即：碱提pH为11，提取温度为90℃，提取时间为30min，酸沉pH为3。

(3)优化工艺组合验证试验

对正交试验结果直观分析所得的优化组合进行了3组重复验证试验，葎草总黄酮得率分别0.78%、0.76%和0.78%，均值为0.773%。优化后的葎草总黄酮得率比正交试验出现的最好的组合的得率（0.76%）要高，说明直观分析所得优化组合是准确可靠的。

(4)葎草总黄酮提取物分析

1)葎草中总黄酮含量测定

以洗涤干净并阴干的葎草为材料，粉碎，过60目筛，准确称取25.00g葎草粉末，用500mL体积分数95%的乙醇，在80℃下回流提取3次，将3次所得提取液旋转蒸发至近干，用95%的乙醇溶解，定容到1000mL容量瓶，即得葎草提取液。

通过分光光度法，以芦丁为标准品，利用AlCl₃-NaNO₂法对实验所得的葎草提取液的总黄酮含量进行测定，结果表明，葎草总黄酮含量为葎草干物质的2.03%。

2)葎草黄酮提取物纯度、得率及提取率测定

通过分光光度法，以芦丁为标准品，利用AlCl₃-NaNO₂法对实验所得的葎草黄酮提取物的纯度进行了测定，测得其纯度为62%，符合国家二类新药原料以及黄酮类保健食品要求。由葎草黄酮提取物得率为0.773％，含水率为75%，纯度为62%来计算，葎草总黄酮的最后得率为干物重的1.86%，即：每100g葎草干物质，可得1.86g葎草总黄酮，根据葎草中所含总黄酮为干物质的2.03%可知，葎草叶总黄酮的提取率达91.6%。

实施例2

葎草鲜嫩茎叶中同时分级提取葎草叶蛋白和总黄酮的方法，包括以下步骤：

步骤1，将8月份采集到的葎草鲜嫩枝叶10Kg，用蒸馏水洗净，在常温下晾干外表水，接着测定其含水量，测得其含水量为75%。对所取的葎草茎叶称重（湿重），并作为计量依据，将其直切成约0.5cm长度片段，备用。

步骤2，将步骤1处理好的葎草茎叶加入重10倍的蒸馏水中，用高速匀浆机打浆5.5min，将其制作成匀浆状，然后将汁液完全压滤出来。

步骤3，将步骤2所得葎草汁液在71℃、pH10条件下进行碱性沉降，沉降时间为10min，然后离心得上清液和沉淀，沉淀物经冷冻干燥即得葎草叶蛋白。最后得到葎草叶蛋白670g，葎草叶蛋白得率为6.7％，即每100g葎草鲜料可得6.7g葎草叶蛋白。通过凯氏定氮仪对所得的葎草叶蛋白的纯度进行了测定，测得其纯度为61%，结合葎草含水率为75%来计算，葎草叶蛋白的最后得率为干物重的16.3%，即每100g葎草干物质可得16.3g葎草叶蛋白。

步骤4，将步骤2中打浆所得滤渣和步骤3中叶蛋白沉淀后离心所得的上清液混合，在pH11、90℃条件下提取30min，所得提取液用稀盐酸调节其pH为3后，静置12h，然后，在10000rpm条件下离心20min，得葎草总黄酮提取物，接着对总黄酮提取物进行蒸馏水洗涤，乙醇溶解、抽滤、旋转蒸发浓缩和冷冻干燥处理，得到葎草总黄酮78.1g。葎草总黄酮得率为0.781%，即0.781g/100g鲜料。

葎草总黄酮提取物分析：

1.葎草中总黄酮含量测定

以洗涤干净并阴干的葎草为材料，粉碎，过60目筛，准确称取25.00g葎草粉末，用500mL体积分数95%的乙醇，在80℃下回流提取3次，将3次所得提取液旋转蒸发至近干，用95%的乙醇溶解，定容到1000mL容量瓶，即得葎草提取液。

通过分光光度法，以芦丁为标准品，利用AlCl₃-NaNO₂法对实验所得的葎草提取液的总黄酮含量进行测定，结果表明，葎草总黄酮含量为葎草干物质的2.05%。

2.葎草黄酮提取物纯度、得率及提取率测定

通过分光光度法，以芦丁为标准品，利用AlCl₃-NaNO₂法对实验所得的葎草黄酮提取物的纯度进行了测定，测得其纯度为60%，符合国家二类新药原料以及黄酮类保健食品要求。

由葎草黄酮提取物得率为0.773％，含水率为75%，纯度为60%来计算，葎草总黄酮的最后得率为干物重的1.87%，即：每100g葎草干物质，可得1.87g葎草总黄酮，根据葎草中所含总黄酮为干物质的2.05%可知，葎草总黄酮的提取率达91.2%。

实施例3

步骤1，将9月份采集到的葎草鲜嫩枝叶12Kg，用蒸馏水洗净，在常温下晾干外表水，接着测定其含水量，测得其含水量为73%。对所取的葎草茎叶称重（湿重），并作为计量依据，将其直切成约0.5cm长度片段，备用。

步骤2，将步骤1处理好的葎草茎叶加入重10倍的蒸馏水中，用高速匀浆机打浆5.5min，将其制作成匀浆状，然后将汁液完全压滤出来。

步骤3，将步骤2所得葎草汁液在71℃、pH10条件下进行碱性沉降，沉降时间为10min，然后离心得上清液和沉淀，沉淀物经冷冻干燥即得葎草叶蛋白。最后得到葎草叶蛋白813.6g，葎草叶蛋白得率为6.78％，即每100g葎草鲜料可得6.78g葎草叶蛋白。

通过凯氏定氮仪对所得的葎草叶蛋白的纯度进行了测定，测得其纯度为60%，结合葎草含水率为73%来计算，葎草叶蛋白的最后得率为干物重的15.01%，即：每100g葎草干物质，可得15.01g葎草叶蛋白。

步骤4，将步骤2中打浆所得滤渣和步骤3中叶蛋白沉淀后离心所得的上清液混合，在pH11、90℃条件下提取30min，所得提取液用稀盐酸调节其pH为3后，静置12h，然后，在10000rpm条件下离心20min，得葎草总黄酮提取物，接着对总黄酮提取物进行蒸馏水洗涤，乙醇溶解、抽滤、旋转蒸发浓缩和冷冻干燥处理，得到葎草总黄酮98.4g。葎草总黄酮得率为0.82%，即0.82g/100g鲜料。

葎草总黄酮提取物分析

1.葎草中总黄酮含量测定

以洗涤干净并阴干的葎草为材料，粉碎，过60目筛，准确称取25.00g葎草粉末，用500mL体积分数95%的乙醇，在80℃下回流提取3次，将3次所得提取液旋转蒸发至近干，用95%的乙醇溶解，定容到1000mL容量瓶，即得葎草提取液。

通过分光光度法，以芦丁为标准品，利用AlCl₃-NaNO₂法对实验所得的葎草提取液的总黄酮含量进行测定，结果表明，葎草总黄酮含量为葎草干物质的2.12%。

2.葎草黄酮提取物纯度、得率及提取率测定

通过分光光度法，以芦丁为标准品，利用AlCl₃-NaNO₂法对实验所得的葎草黄酮提取物的纯度进行了测定，测得其纯度为62%，符合国家二类新药原料以及黄酮类保健食品要求。由葎草黄酮提取物得率为0.82％，含水率为73%，纯度为62%来计算，葎草总黄酮的最后得率为干物重的1.88%，即：每100g葎草干物质，可得1.88g葎草总黄酮，根据葎草中所含总黄酮为干物质的2.12%可知，葎草总黄酮的提取率达88.7%。

本发明按照上述实施例进行了说明，应当理解，上述实施例不以任何形式限定本发明，凡采用等同替换或等效变换方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.葎草鲜嫩茎叶中同时分级提取葎草叶蛋白和总黄酮的方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤1，取葎草茎叶，洗净晾干后，测定含水量和湿重，然后将其切成片段；

步骤2，将步骤1所得葎草茎叶加入9～11倍重量的水中，匀浆4～6min，然后压滤得到葎草浆汁和滤饼；

步骤3，将步骤2所得葎草浆汁先在pH9～11、65～75℃条件下进行加热和碱性沉降，然后离心得上清液和沉淀，沉淀经冷冻干燥即得葎草叶蛋白；

步骤4，将步骤2所得葎草浆汁和步骤3所得上清液混合，在pH9～11、70～90℃条件下提取30～90min，然后滴加酸液调节pH2～4，离心，所得沉淀经水洗、乙醇溶解、抽滤后，将滤液浓缩、冷冻干燥即得葎草叶总黄酮。

2.根据权利要求1所述的葎草鲜嫩茎叶中同时分级提取葎草叶蛋白和总黄酮的方法，其特征在于：所述步骤2中匀浆时间为5.5min。

3.根据权利要求1所述的葎草鲜嫩茎叶中同时分级提取葎草叶蛋白和总黄酮的方法，其特征在于：所述步骤3中碱性沉降pH为10，沉降温度为71℃。

4.根据权利要求1所述的葎草鲜嫩茎叶中同时分级提取葎草叶蛋白和总黄酮的方法，其特征在于：所述步骤4中提取条件为pH11、温度90℃，提取时间为30min，滴加酸液后混合液pH为3。