CN103813803A - 2-羟基马尿酸衍生物及其它们的合成方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及供新的2-羟基马尿酸类似物，以及它们的合成和使用方法。这种类似物被设计有一种被保护的或自由官能基团，例如自由的硫醇（-SH）基团或被保护的硫醇基团，为了与靶蛋白，多肽，固相或可检测的标记在温和条件下偶联而提供化学连接。

Description

2-羟基马尿酸衍生物及其它们的合成方法和用途
交叉引用
本发明主张美国临时申请，申请号：61/540,940，申请日：2011年9月29日的优选权，该临时申请的所有内容，包括所有表格、附图和权利要求都被全部引用。
技术领域
本发明涉及新的2-羟基马尿酸类似物，用于制备尤其包括蛋白质，多肽，和标记的它的轭合物；该轭合物包括这种2-羟基马尿酸类似物，和它们的合成方法和用途。
背景技术
本发明背景的陈述仅仅是为了帮助读者理解本发明，而不构成对本发明现有技术的描述或阐述。
阿司匹林（乙酰水杨酸）属于非甾体抗炎药（NSAIDs）物。阿司匹林在体内迅速被代谢成水杨酸，然后水杨酸被进一步代谢成各种化合物，包括2-羟基马尿酸和多种葡糖苷酸共轭物。2-羟基马尿酸（也称为水杨尿素）：
Figure BDA0000474679530000011
2-羟基马尿酸是水杨酸的甘氨酸共轭物，代表排泄尿中阿司匹林的主要（代谢）产物。
已经报道了通过确定阑尾炎疑似患者的尿液中的阈值为10毫克/升的2-羟基马尿酸，可以检测出阑尾炎。该阈值已通过定性，半定量或定量的方法被确定，包括HPLC（高压液相色谱），TLC（薄层色谱法），放射免疫测定法，比色测试，NMR（核磁共振），质谱，电泳，酶等试验方法。
对于2-羟基马尿酸的结合测定的发展，本领域技术人员必须考虑到样品可能含有水杨酸和阿司匹林的其它代谢产物。因此，免疫原性和标记轭合物被设计用于当前的2-羟基马尿酸，以一种特异识别和区分具有略微分子结构差异的方式。用于制备这些轭合物的类似物也应被设计成可以在温和条件下与各种蛋白质，多肽和标记便捷的连接。
发明内容
本发明的目的是提供新的2-羟基马尿酸类似物，以及它们的合成和使用方法。这种类似物被设计有一种活性硫醇（-SH）基团，来提供与靶蛋白，多肽或标记的适宜的基团便捷偶联的化学连接。
第一方面，本发明涉及化合物（或它的盐），其具有以下通式：
其中R1是一个提供官能基团的化学连接，官能基团可以选自：受保护或未受保护的巯基基团，受保护的或未受保护的胺基基团，伯胺反应基团，巯基反应基团，光反应基团，羧基反应基团，精氨酸反应基团，和羰基反应基团。
在某些优选的实施方案中，R1是具有下列结构式的连接基团
Figure BDA0000474679530000022
其中，
W是C0-4未被取代的烷基；
X可以是C或O；
Y可以是随意取代的C0-4烷基或N（H）-C0-6烷基，Y也可以任意选择存在或不存在；Z是一个功能基团，它可以选自：受保护的或未受保护的巯基基团，受保护的或未受保护的胺基团，伯胺反应基团，巯基反应基团，光反应基团，羧基反应基团，精氨酸反应基团，和羰基反应基团。
为了特异目标分子的附着，这里描述了各种化学连接，通常以此为目的开发结合测定试剂（例如免疫测定）。因此，为了固定固相，半抗原轭合到免疫载体分子上，抗体可检测标记轭合物的制备，免疫毒素和其他标记蛋白和核苷酸试剂等，通过选定的化学连接分子可以被偶联。这种化学连接常给目的分子提供一个或多个结合到多肽的氨基酸侧链上的官能基团。基于其他特征，这些“连接试剂”可以被分类：
1.功能基团和特异的化学性；
2.交联的长度和组成；
3.该官能团（次）是否发生化学或光化学反应;和
4.合成的连接是否容易裂解。
可使用化学连接靶向的活性基团包括伯胺，巯基，羰基，碳水化合物和羧酸。此外，用交联剂如光敏苯基叠氮化物，许多活性基团可被非选择性地偶联。
本领域技术人员对官能基团的选择可以是多种多样的，这取决于与蛋白质，多肽或标记桥联所需的长度和组成，以及所述活性基团是否是游离的或受保护的形式。在后者的情况下，本领域已知各种各样的硫醇保护剂。参见例如：标准的工作参考书，例如：格里斯和瓦茨编著的《有机合成的保护基团》第三版本（Greene and Wuts,PROTECTIVE GROUPS IN ORGANICSYNTHESIS,3rd edition,John Wiley&Sons Inc.,1999）,本文已完整的引用于参考文献中。如本发明所描述所述，优选的Z的末端具有硫醇或受保护的硫醇。合适的巯基保护剂包括双硫代氨基甲酸酯，硫酯，硫醚，硫代内酯，对称的和非对称的二硫化物，和亚氧硫基或亚磺酰。
在优选的实施方案中，官能基团是5-或6-元环硫代内酯，可以任意取代的C1-4烷基巯基，或具有以下结构的可以任意取代的硫代酯：
Figure BDA0000474679530000041
其中，R3选取：可以任意取代的C1-4烷基，可以任意取代的C1-4烷氧基，和可以任意取代的芳基。
在这里所述的每个实施例中，取代物（多个取代物）存在的时候，可以独立地从以下进行选自：C1-6烷基的直链或支链，苄基，卤素，三卤甲基，C1-6烷氧基，-NO2，-NH2，-OH，=O，-COOR'，其中R'是H或低级烷基，-CH2OH，和-CONH2。
在这些实施例中，其中R1为连接基团，提供未受保护的巯基，最优选的X是C0-4未被取代的烷基，最优选的Y不存在或是N或H，最优选的Z是C1-4烷基硫醇。在特别优选的实施例中，优选的Z具有以下结构：
---CH2SH,---CH2CH2SH或
Figure BDA0000474679530000043
。
在一个相关的方面，本发明涉及使上述化合物形成二聚体的方法，其中本发明的两种化合物中的巯基或受保护的巯基通过二硫键连接形成二聚体。
从以上描述的各种实施例中最优选的化合物可以是以下的一种或多种或它们的盐：
Figure BDA0000474679530000042
Figure BDA0000474679530000051
一个相关的方面，本发明涉及的试剂包含一种或多种前述化合物（或它们的盐），通过R1和/或R2的终端硫羟基与蛋白质，多肽，标记或其他分子共价连接，这里被称为“2-羟基马尿酸类似物轭合物”。这些轭合物具有以下通式的：
其中，R2是一个化学连接和P是蛋白质，多肽，标记或其他分子，其中，R2和P共价连接。在示例性实施例中，R2上的硫醇和存在于P上的硫醇之间形成的二硫键来提供所述共价键。
在某些优选的实施例中，R2是具有以下结构的连接基团：
Figure BDA0000474679530000062
其中
W是C0-4未被取代的烷基；
X可以是C或O;
Y是可以任选取代的C0-4烷基或N（H）-C0-6烷基，Y也是可以任意选择存在或不存在的；
Z为提供的巯基与P上的巯基共价结合的一个基团。
Figure BDA0000474679530000063
Figure BDA0000474679530000071
在本发明的化合物包含未受保护巯基的情况下，该化合物可直接连接到一个适宜的靶蛋白，多肽，标记或其它分子上，通过靶分子上天然存在的硫醇，或者通过附加任何定向硫醇偶联基团到靶分子上添加一个巯基，来形成轭合物。下文了描述了硫醇定向耦联基团的示例，在本领域中，为了靶分子与上述化合物轭合，这种偶联基团合并到靶分子上的方法是众所周知的。本发明的化合物包含一个受保护巯基的情况下，除去保护基团，得到游离巯基，然后以类似的方式将其连接到靶分子的任何一个硫醇定向偶联基团中。
靶标分子上优选的偶联基团是马来酰亚胺，是根据下面的反应式被链接上去：
Figure BDA0000474679530000072
其中，R-SH是本发明的一个含有游离巯基（要么是一个游离巯基要么是下述的去保护的受保护巯基）的化合物，L是一个化学连接，P是靶标蛋白，多肽，标记或其他分子。优选的L是C1-10亚烷基的直链或包含0-4个杂环炭骨架（非取代基）支链的C1-10亚烷基，从1到4的取代基可以被独立随意被下列基团取代，这些取代基团选自：C1-6的烷基直链或支链，-NO2，-NH2，=O，卤素，三卤甲基，C1-6烷氧基，-OH，-CH2OH，和–C(O)NH2。
在某些实施方案中，P是一种蛋白质，最优选的是抗原蛋白，用所谓的“半抗原-载体”免疫来提高本发明中化合物上表位免疫反应。常见的载体蛋白包括牛血清白蛋白，血蓝蛋白，卵清蛋白等。半抗原与载体蛋白的偶联条款可以在《抗体》的78-87页中找到（参见：ALABORATORY MANUAL,E.Harlow and D.Lane,eds.,Cold Spring Harbor Laboratory(ColdSpring Harbor,NY,1988)，其被引用于参考文献中。
可选地，优选的P是可检测的标记。优选的可检测标记物可以包括分子或更大的结构，该结构本身是可检测的（例如，荧光基团，电化学标记，金属螯合物，胶乳粒子等），以及那些通过产生可检测反应产物被间接检测到的分子（例如，酶如辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶等），或通过与本身是可检测的分子特异结合（例如，生物素，亲和素，链亲和素，地高辛，麦芽糖，寡聚组氨酸，2,4–二硝基苯，苯砷酸，单链DNA，双链DNA等）。接下去会描述与这样的可检测标记轭合的实例，特别优选的可检测标记物是荧光胶乳颗粒。
适宜靶标分子并于不意味着受限于上述列表。在下文中进一步描述了示例性实施例。此外，适宜靶标的许多其他类型，包括本领域已知的肽类激素，治疗性蛋白质，抗体，抗体片段，单链可变域片段，小分子，核酸，寡糖，多糖，环状多肽，类肽物，适配体和固相介质。
虽然轭合靶标可与本发明的2-羟基马尿酸类似物以1:1偶联，单个靶标也包括超过1个轭合位点，因此不只1个本发明的化合物与之轭合。在优选的实施例中，轭合靶标包括至少10个2-羟基马尿酸类似物基团与之共价结合，更优选至少30个，还更优选至少50个，最优选至少100个。
在其它相关方面，本发明涉及本发明产品的制备方法和本发明2-羟基马尿酸类似物轭合物的使用方法。
所述方法包括包含一个游离巯基的本发明的一个或多个化合物与包含一个或多个定向巯基偶联基团的一种或多种靶标分子接触，在一定条件下，游离巯基（多个）与定向巯基偶联基团（多个）轭合，以形成一个或多个轭合物。发生这些反应的条件取决于所选择的定向巯基偶联基团（多个），这是本领域技术人员公知的。下面描述这些条件的实施例。
所述方法进一步包含在所述的接触步骤之前，从一个或多个本发明化合物的被保护巯基上的脱保护步骤，和/或附加一个或多个定向巯基偶联基团到蛋白质，多肽，标记，或其他分子来形成一个恰当的轭合物靶标。在后一种情况下，可以包括双官能团交联剂的使用，其在分子的一个位点提供一个适宜的定向巯基偶联基团，第二个偶联基团用于附着蛋白质，多肽，标签或其它目的分子。众多的双官能团交联剂是那些本领域技术人员公知的。
关于这种2-羟基马尿酸类似物轭合物的使用，本发明涉及一种抗体的制备方法。这些方法包括使用一种或多种轭合物作为免疫原，来激发免疫应答。如上所述，针对具有以下结构的免疫原，抗体可以被孵育出：
Figure BDA0000474679530000091
其中，R2是一个化学连接和P是一个载体多肽，其中R2和P共价连接，优选的R2上的巯基和P上的巯基之间通过形成二硫键（连接）。
在某些实施例中，在合适的免疫手册中包含了本发明的一种或多种轭合物的管理方法，和从动物体液中分离适宜抗体的方法。可以在《抗体》中找到制备免疫原，免疫动物，和抗血清的采集的示例性操作步骤（参见：A LABORATORY MANUAL,E.Harlow and D.Lane,eds.,Cold Spring Harbor Laboratory(Cold Spring Harbor,NY,1988)pp.55-120），其在此被引用作为参考文献。可选择的，本发明的2-羟基马尿酸类似物轭合物可选择利用噬菌体展示方法，通过选择表面展示适宜抗体的噬菌体，然后分离编码适宜抗体中的至少一个可变结构域的核酸序列。噬菌体展示方法在本领域技术人员中是众所周知的。这样的方法可以用免疫的或未免疫的动物作为核苷酸源，来形成噬菌体展示文库。以这种方式制备的抗体可作为治疗分子和/或在受体结合测定中作为受体找到更好的用途。
优选的，这些抗体与2-羟基马尿酸结合的亲和力，比与水杨酸和/或龙胆酸结合的亲和力至少大5倍以上，更优选至少大10倍以上，还更优选地至少大30倍以上，以及最优选至少大50倍以上。
以这种方式制备的抗体可被作为特异性结合试剂，在确定样品中的2-羟基马尿酸浓度的免疫测定中使用。例如，方法可包含执行一个竞争性免疫测定，该测定中的轭合物具有以下结构；
Figure BDA0000474679530000101
其中，R2是一个化学连接，P是一个可检测的标记，其中R2和P共价连接，R2上的巯基和P上的巯基之间优选的通过二硫键连接，该轭合物与上述样品中的2-羟基马尿酸竞争结合抗体，其中上述测定中获得的信号表明了上述样品中2-羟基马尿酸的浓度；并从试验信号中确定上述样品中2-羟基马尿酸的浓度。
优选地，相比于10微克/毫升，更优选的1000微克/毫升的水杨酸和/或龙胆酸的信号，免疫测定为10微克/毫升的2-羟基马尿酸提供了一个至少5倍的信号，更优选至少10倍，更优选地至少30倍，并且最优选至少为50倍或更多的信号。
如上所述，这种测定可在主体阑尾炎的诊断方法中找到用处。这些方法包括如本文所述执行一个竞争性免疫测定法；相关的2-羟基马尿酸浓度来确定主体中阑尾炎的存在或不存在。
本发明的其它实施例将会在下面的详细描述，示例性实施例和权利要求中呈现。
详细描述
本发明部分涉及氨基酸类似物和它们的生产、以及通途，特别是制备包含2-羟基马尿酸类似物的可交联巯基与另一个分子偶联，这样的轭合物用于检测2-羟基马尿酸的免疫测定试剂的制备。本发明的类似物尤其适用于制备抗体和标记，用于2-羟基马尿酸受体结合测定来区分水杨酸和2-羟基马尿酸。
为了清楚起见，还提供了关于本发明化合物的下面这些术语的定义。
本文所用的术语“芳基”是指可任意取代的芳族基团，其至少具有一个共轭π电子体系的环，至多含有两个共轭或稠环体系。芳基包括羧酸芳基，杂环芳基和联芳基，所有这些基团都可以被任选取代。优选的，所述芳基也可以被任意苯基任意地取代，被吡啶基任意取代，被苯丙噻喃基任意取代，被咔唑任意取代，被萘基任意取代，被四氢萘基任意取代。而最优选的“芳基”具有5个或6个环原子（是最优选苯基）的单环碳芳香环，所述芳基或杂芳基Ar基团（在本文所述的交联剂上通过加工一个环原子形成为亚芳基或亚杂芳基）通常可包含多达10个环原子，尽管本领域技术人员认为超过10个环原子的芳基都在本发明的范围之内。由Ar包围的环系统可包含最多4个杂原子，独立地选自N，S和O。
单环芳基包括，但不限于：苯基，噻唑基，呋喃基，吡喃基，2H-吡咯基，噻吩基，吡咯基，咪唑基，吡唑基，吡啶基，吡嗪基，嘧啶基，和哒嗪基。融合双环Ar基团包括，但不限于：苯并噻唑，苯并咪唑，3H-吲哚基，吲哚基，吲唑基，嘌呤基，喹嗪基，异喹啉基，喹啉基，酞嗪基，萘啶，喹唑啉基，噌啉基，异噻唑基，喹喔啉基，中氮茚基，异吲哚基，苯并噻吩基，苯并呋喃基，苯并异，和苯并吡喃基。
本文所用，术语“杂原子”是指非碳非氢的原子，如N，O和S。
所述芳基也可以被任意取代，通过用另一个化学基团替代一个或多个氢原子。优选的取代基包括直链或支链（例如异丙基）的C1-6烷基，卤素，三卤甲基，烷氧基，NO2，NH2，OH，-COOR'，其中R'是H或低级烷基，CH2OH，和CONH2。
如本文所用，术语“烷基”是指饱和脂肪烃，包括直链和支链基团。优选地，所述烷基具有1至20个碳原子。更优选地，它是一种中等烷基（具有1至10个碳原子）。最优选地，它是低级烷基（具有1至4个碳原子）。该烷基可被取代或不能被取代。
如本文所用，术语“烷氧基”指的是同时具有-O-烷基和-O-环烷基；优选的烷氧基是指低级烷氧基，最优选的是甲氧基或乙氧基。
如本文所用，术语“硫代内酯”是一个具有5或6个环原子的环状烃，其中一个为杂原子S，并且杂原子与被=O取代的碳原子相邻。
如本文所用，术语“硫代酯”指具有R-S-C(O)-R’结构的有机化合物。
如这里所用，术语“烷基硫醇”指含有一个-SH基团的烷基。硫醇类也被称为“硫代醇”和“巯基”。
这里所用的术语“抗体”是指一种肽或衍生的多肽，衍生、仿照或基本上编码自能够特异结合抗原或表位的一个或多个免疫球蛋白基因或其片段。（参见：Fundamental Immunology,3rdEdition,W.E.Paul,ed.,Raven Press,N.Y.(1993);Wilson(1994)J.Immunol.Methods175:267-273;Yarmush(1992)J.Biochem.Biophys.Methods25:85-97.）。术语抗体包括抗原结合部分，即，“抗原结合位点”（例如，片段，子序列，互补决定区域（CDR）），其保留结合抗原能力，包括（i）Fab片段，由VL，VH，CL和CH1结构域组成的单价片段;（ⅱ）一个F（ab'）2片段，二价片段包括在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段;（ⅲ）由VH的和CH1结构域组成的一个Fd片段;（ⅳ）一个Fv片段，由抗体单臂的VL和VH结构域组成，（ⅴ）一个dAb片段(Ward et al.,(1989)Nature341:544-546)，包括一个VH结构域，以及（vi）单个互补性决定区（CDR）。引用在参考文献中的单链抗体也被包括在术语“抗体”中。
这里所用的术语“多肽”是指通过肽键连接的具有氨基酸序列的分子。该术语包括蛋白质，融合蛋白，寡肽，环肽，和多肽衍生物。抗体和抗体衍生物在单独的部分讨论，但本发明的目的是，抗体和抗体衍生物被视为多肽及其衍生物的一个子类。术语蛋白是指一种多肽，被分离自天然资源，或产生自使用重组DNA技术的分离的cDNA，并具有至少约200个氨基酸长度的氨基酸序列。
这里所用的术语“核苷酸”应是通用的多脱氧核苷酸（含有2'-脱氧-D-核糖或其修饰的形式），聚核糖核苷酸（含有D-核糖或其修饰的形式），以及多核苷酸的任何其他的类型，多核苷酸是嘌呤或嘧啶碱基的N-糖苷，或修饰过的嘌呤或嘧啶碱基。
这里所用，术语“适配体”是一个单链或双链的寡脱氧核糖核苷酸，寡核糖核苷酸或其修饰过的衍生物，其能特异性结合并改变靶标分子的生物学功能。靶标分子被定义为蛋白质，肽和它们的衍生物。适配体是能够在生理条件下结合靶标分子。区别于反义效应中适配体通过与蛋白质，肽及它们的衍生物结合诱导产生作用，适配体的作用是在与核酸相互作用中不被诱导或在生理条件下不与核酸结合。
这里所用，术语“多糖”是指包含超过10个由糖苷连接的单糖残基的分子，而术语“寡糖”是指包含2-10个由糖苷连接的单糖残基的分子。
术语“小分子”包括任何分子量小于约5,000道尔顿（Da），优选的小于约2500道尔顿，更优选地小于1000道尔顿，最优选小于约500道尔顿的分子。
官能团
化学交联剂是制备抗体-可检测标记轭合物，免疫毒素和其他标记的蛋白和核酸试剂的有价值的工具。这些试剂可基于如下所述被分类：
1.官能团和化学特异性；
2.交联桥的长度和成分；
3.交联基团是否是相似（同型双功能）或不同（异型双功能）；
4.该团体是否发生化学或光化学反应；
5.该试剂是否可裂解的；和
6.该试剂是否可被放射性标记或用另一标签标记；
7.该试剂是否可与PEG横桥或其它聚合物结合。
本发明的示例化合物提供了一个可用的硫醇作为附着点，目的是准备提供一个合适的巯基反应位点。通过巯基（硫醇）偶联的交联试剂是可从许多商业来源获得的。马来酰亚胺，烷基和芳基卤化物和α-卤代酰基与巯基反应形成硫醚键，而吡啶基二硫化物与巯基反应，以产生混合的二硫化物。吡啶基二硫化物产物是可分解的。这样的试剂可以有双官能团的，试剂的第二个位点在修饰一个靶标轭合物以纳入硫醇反应位点时是有用的。除了硫醇，可使用交联剂靶向的反应性基团包括伯胺，羰基，碳水化合物和羧酸。此外，许多反应基团可用交联剂非选择性地偶联如光敏苯基叠氮化物。因此，两步法将蛋白与本发明的2-羟基马尿酸类似物偶联，该蛋白可以容忍对其胺基的修饰。合适的试剂，参见2003年至2004年皮尔斯应用手册和登记号为1600926（参见：Pierce2003-2004Applications Handbook and Catalog#1600926），其在此被引用作为参考。一端是胺反应活性，另一端是巯基反应活性的交联剂是相当普遍的。如果使用异型双功能试剂，最不稳定的基团一般先反应以确保交联的有效性和避免不必要的聚合反应。
许多因素必须考虑，以确定交联剂与靶标的最佳摩尔比。根据实践应用，轭合程度是一个重要因素。例如，制备免疫原轭合物时，高共轭程度通常希望能增加抗原的免疫原性。然而，轭合到抗体或酶时，为了确保了该蛋白的生物学活性被保留，从低到中等程度的共轭可能是最佳的。蛋白质的表面活性基团的数目也是要考虑的重要因素。如果有大量的靶标基团，可以使用较低的交联剂与蛋白质比率。至于潜在靶标的数量有限时，需要更高的交联剂与蛋白质比率。对于小分子量蛋白质，这转化为每克更多交联剂。
通过在互作反应之前或之后进行的交联研究，分析与特定的相互作用有关的蛋白质的构象变化。通过比较所用的不同臂长的交联剂，分析轭合成功的（实例）。当蛋白构象改变，受阻碍的氨基酸变得可用于交联时，用一些具有不同活性基团和/或间隔臂的交联剂是令人满意的。
具有可变长度的间隔臂或具有可变长度的桥联与反应末端连接的交联剂是可供使用的。该桥联最明显的优点是它具有能够处理链接基团的空间位阻能力。因为空间位阻效应决定了用于交联的潜在反应位点之间的距离，在反应中桥联的不同长度也需要被考虑。较短的间隔臂通常用于分子内的交联研究，而含较长间隔臂的交联剂更有适用于分子间交联。
交联剂中包含聚合物部分（例如，聚乙二醇（“PEG”）的均聚物，聚丙二醇均聚物，其它烷基-聚环氧乙烷，双聚环氧乙烷和共聚物或聚（烯化氧）的共聚物）在某些情况下是有利的。（参见美国专利5,643,575,5,672,662,5,705,153,5,730,990,5,902,588,and5,932,462;和Topchieva et al.,Bioconjug.Chem.6:380-8,1995）。例如，美国专利5672662公开了一种双官能团的交联剂，其包括PEG聚合物部分和一个单酯键。据说这样的分子，在水中的半衰期约为10至25分钟。
设计交联剂涉及选择要采用的官能基团。功能性基团的选择是完全依赖于物种上用于交联的可用的靶位点。一些物种（如蛋白质）存在多个可用的靶标位点（例如，赖氨酸ε-氨基基团，半胱氨酸巯基基团，谷氨酸的羧基基团等），为了最好地保存目标的生物学特性，有经验的选择一个特定的官能基团（例如，抗体的结合亲和力，酶的催化活性，等）。
1.通过胺基团偶联
亚氨酸酯和N-羟基琥珀酰亚胺（“NHS”）酯通常作为特异的胺官能基团。NHS酯与伯胺或仲胺反应，得到稳定的产品。在生理pH下偶联很高效，并且NHS-酯交联剂在溶液中比其亚氨酸酯同类更稳定。在一步法或两步法反应中，同型双功能NHS-酯轭合物通常用于交联含胺的蛋白质。NHS-酯的理论靶标是伯胺。在蛋白质N-末端的易受影响的α-胺基与NHS-酯反应形成酰胺。但是，由于蛋白质的α-胺并不总是可用，氨基酸侧链的反应就变得重要了。有5个氨基酸它们的侧链有氮，只有赖氨酸的ε-氨基能与NHS-酯发生显著反应。当NHS-酯交联剂与伯胺发生反应，形成共价酰胺键，释放出N-亚胺。
2.通过巯基偶联
马来酰亚胺，烷基和芳基卤化物，α-卤代酰基和吡啶基二硫化物通常作为特异的巯基官能基团。当反应混合物的pH保持在6.5和7.5之间，马来酰亚胺基团是特异的巯基基团。在pH为7时，马来酰亚胺与巯基的反应比其与胺快1000倍。马来酰亚胺不与酪氨酸，组氨酸或甲硫氨酸反应。当不存在足够数量的游离巯基时，可以通过减少可获得的二硫键产生。
3.通过羧基基团偶联
碳化二亚胺偶联羧基到伯胺或酰肼上，导致形成酰胺键或腙键。碳二亚胺不同于其他轭合反应，碳化二亚胺和被偶联的分子间不形成交叉桥；相反，有效的羧基基团和有效的胺基团之间形成肽键。蛋白质的羧基末端可以被靶向，以及谷氨酸和天冬氨酸的侧链。在存在过量交联剂的情况下，可能会发生聚合反应，因为蛋白质同时含有羧基和胺。不形成交叉桥，酰胺键与肽键是一样的，因此不破坏的蛋白质，逆转交联是不可能的。
4.无选择性标记
光亲和试剂是一种化学惰性化合物，但暴露于紫外光或可见光时变成有反应活性。芳基叠氮化是光亲和试剂，可以被波长为250-460毫微米之间的光分解，形成有反应活性的芳氮烯。该芳基氮烯可以无选择性反应形成共价键。还原剂必须谨慎使用，因为它们能减少叠氮基团。
5.特异碳基交联剂
羰基（醛和酮）在pH为5-7时与胺和酰肼反应。羰基与酰肼的反应比其与胺更快，这在特定站点交联时非常有用。羰基不容易在蛋白质中存在，但是，用偏高碘酸钠轻度氧化糖基可将邻位羟基转化为醛或酮。
可交联的2-羟基马尿酸类似物的示例性应用
1.载体蛋白-半抗原/肽/多肽轭合物用作免疫原
在这个免疫学研究领域众多公司提供可获得的市售产品。有许多交联剂用于制备这些轭合物，最好的选择是依赖半抗原上的活性基团和半抗原-载体轭合物具有的能在其注射后成功地作为免疫原的能力。碳化二亚胺是生产肽载体轭合物的很好的选择，因为蛋白质和多肽通常同时包含多个羧基与伯胺。其它的交联剂也可用于制造免疫原轭合物。
佐剂是天然的或合成化合物的混合物，当其与抗原施用，增强免疫应答。佐剂被用于（1）刺激抗原产生非固有免疫原性的免疫应答，（2）增加免疫应答的强度，（3）优先刺激要么细胞的要么体液应答（即，通过抗体产生保护免受疾病困扰）。佐剂有四种主要作用模式：增强抗原的摄取和定位，延长抗原的释放，激活巨噬细胞，刺激T细胞和B细胞。最常用的辅助剂可分为六类：矿物盐，油乳剂，细菌产物，皂甙，合成产物和细胞因子。在免疫学方法手册中有佐剂及其应用的更广泛的讨论（参见：IMMUNOLOGY METHODS MANUAL,vol.2,I.Lefkovits,ed.,Academic Press,San Diego,CA,1997,ch.13），在此其被完整的引用。
小分子，如2-羟基马尿酸通常不具有免疫原性，即使在有佐剂的情况下施用。为了这些化合物能产生免疫应答，往往有必要将它们连接到蛋白质或其他化合物，被称为载体，也就有了免疫原性。连接到载体蛋白质上的小分子免疫原被称为半抗原。半抗原也被偶联到载体蛋白用于免疫测定。载体蛋白提供了附着半抗原到固体支持物的方法，如微滴定板或硝酸纤维素膜。附着到琼脂糖时它们可用于抗半抗原抗体的纯化。它们也可以被用来创建多价抗原，其能形成大的抗原-抗体复合物。在选择的载体蛋白时，记住动物能对载体蛋白形成抗体也能对附着的半抗原形成抗体。因此，载体蛋白的选择是重要的，选择与测定样品中的蛋白质无关的载体蛋白进行免疫。如果半抗原同时在免疫和测定法中被轭合，两种载体蛋白应尽可能不同。这样就允许使用抗血清，不必从抗载体抗体中分离出抗半抗原抗体。
血蓝蛋白（KLH）是软体动物中发现的呼吸蛋白。它的尺寸很大使得它非常具有免疫原性，并且大量可用于轭合的有效的赖氨酸残基使它成为非常有用的半抗原的载体，如2-羟基马尿酸。哺乳动物和软体动物之间的系统发育的距离增加了免疫原性，降低哺乳动物样品中抗KLH载体的抗体与天然存在的蛋白质之间交叉反应的风险。
2.固相固定
2-羟基马尿酸类似物和/或本发明的轭合物可以被固定在固相基质上，用作亲和载体或样品分析。类似地，用2-羟基马酸类似物和/或本发明的轭合物制造或选择的抗体或其结合片段也可以被固定在固相基质上。在这里所用术语“固相”泛指各种各样的材料，包括固体，半固体，凝胶，薄膜，膜，网，毡，复合材料，颗粒，纸和那些通常被本领域技术人员用来隔离分子的类似物。固相可以是无孔的或多孔的。合适的固相包括那些已被开发的和/或用作固相结合分析中的固相。（参见：chapter9of Immunoassay,E.P.Dianiandis and T.K.Christopouloseds.,Academic Press:New York,1996），其被包含引用在参考文献中。合适的固相例子包括薄膜，纤维素纸，玻璃珠（包括聚合物，胶乳和顺磁性颗粒），玻璃，硅晶基质，微粒，纳米颗粒，Tenta胶，Agro胶，PEGA凝胶，SPOCC凝胶和多孔板（参见：Leon et al.,Bioorg.Med.Chem.Lett.8:2997,1998;Kessler et al.,Agnew.Chem.Int.Ed.40:165,2001;Smith et al.,J.Comb.Med.1:326,1999;Orain et al.,Tetrahedron Lett.42:515,2001;Papanikos et al.,J.Am.Chem.Soc.123:2176,2001;Gottschling et al.,Bioorg.Med.Chem.Lett.11:2997,2001.）。
上述那些表面可以被修饰来提供连接位点，例如被溴乙酰化，硅烷基化（silation），用硝酸增加氨基基团，和附着中介蛋白，树枝状聚合物和/或星形聚合物，以提供连接位点。这个列表并不意味着受限制于此，并且本领域技术人员已知的现有技术中的任何方法都可以使用。
3.可检测标记轭合物
生物测定需要检测的方法，结果定量中最常用的方法之一是与共轭一种酶、荧光团或其它可检测的标记给所研究的分子（例如，使用本发明的一个或多个2-羟基马尿酸类似物），其被一个与该分子有亲和力的受体分子固定用于检测。针对所研究分子的受体（例如，用本发明的类似物或缀合物制造或选择的抗体或结合片段）可选择的轭合一种酶，荧光团或其它可检测的标记。酶轭合物是所使用的轭合物中最常见的。可检测的标记包括那些分子其本身是可检测（例如，荧光基团，电化学标记，金属螯合物等），以及那些分子其产生可检测反应产物被间接检测到（例如，酶，如辣根过氧化物酶，碱性的来间接地检测分子磷酸等），或通过特异结合的分子（例如，生物素，洋地黄毒苷，麦芽糖，寡聚组氨酸，2,4-二硝基苯，苯砷酸盐，单链DNA，双链DNA，等等），这个分子本身是可检测的。
特别优选的可检测标记物是荧光胶乳粒子，如那些在美国专利5763189，6238931和6251687，以及国际公开WO95/08772所描述的，每一个被完整的引用在此作为参考文献。下面说明这样的颗粒的示例性轭合物。
2-羟基马尿酸类似物在受体结合测定中的用途
2-羟基马尿酸类似物和本发明的轭合物有利于在受体结合测定法中应用。受体结合测定法包括任何测定方法，其信号依赖于被分析物与同源受体的特异性结合，也包括免疫测定，受体-配体测定法，和核酸杂交测定。
分析物的存在或存在数量，一般用针对每个标记的特异性抗体和特异性结合检测来确定。任何适宜的免疫测定法都可被采用，例如，酶联免疫测定（ELISA），放射免疫测定（RIA）的，竞争性结合测定法，等。抗体与标记物的特异性免疫结合可以被直接或间接地检测出来。直接标记包括附着到抗体上的荧光或发光标签，金属，染料，放射性核素，等。间接标记包括在本领域中公知的各种酶，例如碱性磷酸酶，辣根过氧化物酶等。
许多方法和装置是本领域技术人员公知的可用于实践受体结合测定法。见，例如，美国专利6143576;6113855;6019944;5985579;5947124;5939272;5922615;5885527;5851776;5824799;5679526;5525524;和5480792，每一个被完整的引用在此作为参考文献，包括所有表格，附图和权利要求。这些装置和方法利用可检测标记分子和在各种三明治，竞争性或非竞争性测定形式中的固相抗体，以产生与目的被分析物的存在或存在数量有关的信号。
本领域的技术人员还认识到机械仪器，包括但不限于贝克曼（Beckman Access），雅培AXSYM(Abbott AxSym)，罗氏ELECSYS(Roche ElecSys)，德灵Stratus系统(Dade BehringStratus systems)是免疫测定分析仪中能够进行这样的免疫测定法（的仪器）。此外，某些方法和装置，例如生物传感器和光学免疫测定，也可以采用，用来确定被分析物存在或存在数量，而不需要被标记的分子。见，例如，美国专利5631171;和5955377，每一个被完整的引用在此作为参考文献，包括所有表格，附图和权利要求书。如本文所述，优选的测定法是利用2-羟基马尿酸类似物轭合物所产生的抗体（其中所述抗体被结合到固相或可检测标记上），和/或2-羟基马尿酸类似物轭合到可检测的标记上，和/或2-羟基马尿酸类似物轭合到固相上。
根据本发明形式最简单的测定装置，包括一个包含受体的固体表面，该受体能特异性结合的一种或多种目的被分析物（例如，2-羟基马尿酸）。例如，抗体可用本发明的交联剂固定在各种固体支持物上面，例如磁性或色谱矩阵颗粒，测定板的表面（例如微量滴定孔），固体基底材料块或膜（如塑料，尼龙，纸）等。用类似的方式，测定装置包含固定着这里所述的一种或多种2-羟基马尿酸类似物的固体表面。
多种被分析物的分析可以用一个测试样品单独或同时进行。为了单独或有序测定标记，适当的装置包括临床实验室分析仪，如ELECSYS（Roche公司），AXSYM（Abbott），访问（Beckman），在ADVIA CENTAUR（拜耳）免疫测定系统，NICHOLS ADVANTAGE
Figure BDA0000474679530000191
（尼科尔斯研究所）免疫测定系统等。优选的装置或蛋白芯片可在单一的表面同时执行多个分析物的分析。特别有用的物理格式，包括表面具有多个不连续的，可定位的位置用于多个不同被分析物的检测。这种格式包括蛋白质微阵列，或“蛋白质芯片”(参见：Ng and Ilag,J.CellMol.Med.6:329-340(2002))以及某些毛细管装置（见，例如，美国专利号6,019,944）。在这些实施例中，每个位置的每一个不连续的表面位置包含用来固定一种或多种被分析物的抗体（例如，标记物）。表面可选择地包含固定在表面不连续位置上的一种或多种离散微粒（例如，微粒或纳米颗粒），其中所述微粒包括在检测中用来固定的被分析物（例如，标记物）的抗体。
具体实施例子
实施例子1：N,N'-(2,2'-(2,2'-硫代二(乙烷-2,1-取代基)二(氨代))二(2-氧化乙烷-2,1-取代基))二(2-水杨酰胺)(2-羟基马尿酸-胱胺)的合成。
在混合物2-羟基马尿酸（1克，5.12毫摩尔），胱胺二盐酸盐（0.58克，2.56毫摩尔）和O-（7-氮杂苯并三唑-1-基）-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸盐（HATU，1.9克，5.12毫摩尔）的无水四氢呋喃（10ml）溶液中加入二异丙基乙胺（DIEA，1.79毫升，10.25毫摩尔）。将所得混合物加热至60℃，加热1小时。反应混合物冷却至室温，然后真空浓缩至干燥。油性残留物用乙酸乙酯（100mL）和5％碳酸氢钠（2×100毫升）萃取。分离有机层，然后用1N HCl（2×100mL）洗涤。分离有机层并在室温下过夜。用乙酸乙酯重结晶，得到0.84克（65％）白色固体。1H NMR（DMSO-D6）δ12.23（2H，S），9.07（2H，T），8.21（2H，T），7.87（2H，D），7.40（2H，T），6.90（4H，M），3.90（4H，D），3.37（4H，Q），2.79（4H，t）。
实施例子2：2-羟基-N-（2-氧代-2-（2–氧化四氢噻吩-3-基氨基）乙基）苯甲酰胺（2-羟基马尿酸-HCTL）的合成
Figure BDA0000474679530000202
在混合物2-羟基马尿酸（1克，5.12毫摩尔），DL-高半胱氨酸硫内酯盐酸盐（0.79克，5.12毫摩尔）和O-（7-氮杂苯并三唑-1-基），N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸盐（HATU，1.9克，5.12毫摩尔）的无水四氢呋喃（10ml）溶液中加入二异丙基乙胺（DIEA，1.79毫升，10.25毫摩尔）。所得混合物加热至60℃1小时。反应混合物冷却至室温，然后真空浓缩至干燥。油性残留物用乙酸乙酯（100mL）和5％碳酸氢钠（2×100毫升）萃取。分离有机层，然后用1N HCl（2×100毫升），盐水（100毫升）洗涤，用硫酸镁干燥，过滤并在真空下蒸发，得到1.2g（80％）。1H NMR(DMSO-d6)δ12.25(1H,s),9.10(1H,t),8.40(1H,d),7.88(1H,d),7.41(1H,t),6.91(2H,m),4.65(1H,m),3.95(2H,m),3.39(1H,m),3.29(1H,m),2.43(1H,m),2.11(1H,m)。
实施例子3：2-羟基-N-（2-氧化四氢噻吩-3-基）苯甲酰胺（水杨酸-HCTL）的合成
水杨酸（1.38克，10毫摩尔）和1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺（EDC，1.95毫升，11毫摩尔）的混合物溶解在乙腈（20mL）中。向混合物中加入DL-高半胱氨酸硫内酯盐酸盐（1.84克，12毫摩尔）。在室温下搅拌反应混合物过夜。然后混合物被真空浓缩至干燥。油性残余物用乙酸乙酯（3×100毫升）和pH=3的磷酸缓冲液（100毫升）萃取。合并的有机层用盐水（100毫升）洗涤，用硫酸镁干燥，过滤并在真空下蒸发得1.6g（68％）粘稠的固体。部分产物（100毫克）通过硅胶柱色谱法纯化，用乙酸乙酯/己烷洗脱（15:85，V/V），得到24毫克白色固体。1H NMR(DMSO-d6)δ12.25(1H,s),9.14(1H,s),7.84(1H,d),7.41(1H,t),6.90(2H,m),4.87(1H,m),3.46(1H,m),3.35(1H,m),2.53(1H,m),2.33(1H,m).
实施例子4：KLH-SMCC的合成。
血蓝蛋白（KLH，Calbiochem公司＃374817，50毫克/毫升溶于丙三醇）通过40毫升GH25柱以除去丙三醇，GH25柱用pH7.50.1M磷酸钾，0.1M硼酸盐，0.15M氯化钠缓冲液平衡。加入1.5摩尔倍（1.5-fold molar）过量的N-乙基马来酰亚胺溶液，混合物于室温温育30分钟。涡旋加入200摩尔倍过量的溶解在蒸馏水中的50mM硫代-SMCC（皮尔斯＃22322）。持续涡旋30秒后，然后室温孵育10分钟。涡旋加入100摩尔倍过量的溶解在乙腈中的80mM SMCC（皮尔斯＃22360）。加入1M KOH溶液，以保持pH值在7.2和7.4之间。室温下搅拌混合物90分钟。温育90分钟后，KLH-SMCC用GH25凝胶柱进行纯化，该GH25凝胶柱用pH7.00.1M磷酸钾，0.02M硼酸盐，0.15M氯化钠缓冲液平衡。
实施例子5：2-羟基马尿酸衍生物的轭合物
2-羟基马尿酸衍生物被轭合到如下所述的KLH-SMCC上。首先，将S-乙酰基化2-羟基马尿酸衍生物通过碱水解脱保护以提供游离的巯基。衍生物（4-8毫克）溶解在0.8毫升DMF水溶液（70:30V/V）和200微升1M KOH中，室温温育10分钟。过量的碱用磷酸/盐酸缓冲液中和至pH值为7。然后，2-摩尔倍过量的2-羟基马尿酸衍生物（基于在特定批次的KLH-SMCC中SMCC的浓度）加入KLH-SMCC，室温搅拌该混合物90分钟。轭合物用PBS彻底透析纯化。
实施例子6：免疫法检测2-羟基马尿酸
利用美艾利圣地亚哥（Alere San Diego,Inc.）生产的微流体设备，检测尿液中2-羟基马尿酸的竞争性测定被开发，基本如WO98/43739，WO98/08606，WO98/21563和WO93/24231所描述。用一个半抗原-KLH轭合物作为免疫原，通过噬菌体展示法开发出了抗-2-羟基马尿酸的抗体。通过抗体上游离的半胱氨酸残基，此抗体被轭合至一个0.13微米的马来酰亚胺化的胶乳粒子上。检测试剂由0.50微米的荧光能量转移胶乳粒子组成（基本上如在美国专利5763189，6238931和6251687，以及国际公开WO95/08772），胶乳粒子根据实施例6制造。130nL抗体颗粒轭合物（含有0.22％固体）点样到微流体装置的诊断槽上，和170nL2-羟基马尿酸颗粒轭合物（含有0.4％固体）被施加到设备的反应室。分析物用去离子水溶解，然后被稀释于人血浆池来达到所需的最终浓度。210微升样品被施加到装置的样品添加区，用TRIAGE（Biosite公司注册）读取荧光前，允许其运行大于15分钟。通过从设备原点的距离函数集成荧光而得到荧光信号。该测定可以检测到10微克/毫升的2-羟基马尿酸，但不会明显地检测到浓度高达1毫克/毫升的与2-羟基马尿酸紧密相关化合物的龙胆酸和水杨酸。
上述的实施例用于说明本发明。这些实施例不以任何方式限制本发明的范围。
虽然本发明已经提供了足够的细节描述和示例，使得本领域技术人员能够制造和使用它，在不违背本发明范围和精神的情况下，各种选择，修改和改进是显而易见的。
本领域技术人员将很容易理解，本发明适用于执行对象并获得提到的，也包括固有的结果和优点。这里所提到的例子是优选的实施例，具有示范性，但本发明对本发明的范围做任何限制。这里出现的修改和其他用途本领域技术人员是熟知的。这些修改都包含在本发明的精神内并定义在本权利要求的范围内。
显然本领域技术人员可以在不违背本发明范围和精神的情况下，本发明所公开的是可以做出不同的替换和修改的。
本说明书中提到的所有专利和出版物表示本发明属于本领域技术人员的普通技术水平。这里所有专利和出版物以相同程度被引用并入参考文献，如同每个单独的出版物被明确和单独地说明被引用并入参考文献一样。
这里所述的本发明可以在缺乏任何一种元素或多种元素，一种限制或多种限制的情况下实现，这里这种限制没有特别说明。例如这里每一个实例中术语“包含”，“实质由……组成”和“由……组成”可以用两者之一的其余2个术语代替。这里采用的术语和表达方式所为描述方式，而不受其限制，这里也没有任何意图来指明此书描述的这些术语和解释排除了任何等同的特征，但是可以知道，可以在本发明和权利要求的范围内做任何合适的改变或修改。可以理解，本发明所描述的实施例子都是一些优选的实施例子和特点，任何本领域的一般技术人员都可以根据本发明描述的精髓下做一些更改和变化，这些更改和变化也被认为属于本发明的范围和独立权利要求以及附属权利要求所限制的范围内。
其他的实施方式都在如下的权利要求中。

Claims (26)

1.一种化合物或该化合物的盐，所述的化合物具有如下通式：
Figure FDA0000474679520000011
其中，R1为连接基团，其具有如下结构：
Figure FDA0000474679520000012
其中，
W是C0-4未被取代的烷基；
X可以是C或O；
Y可以是随意取代的C0-4烷基或N（H）-C0-6烷基，Y也可以任意选择存在或不存在；
Z是一个功能基团，它可以选自：受保护的或未受保护的巯基基团，受保护的或未受保护的胺基团，伯胺反应基团，巯基反应基团，光反应基团，羧基反应基团，精氨酸反应基团，和羰基反应基团。
2.一种化合物或该化合物的盐，所述的化合物具有如下通式：
Figure FDA0000474679520000013
其中，R1为如下结构的连接基团：
Figure FDA0000474679520000014
其中，
W是C0-12的取代的，非取代的，直链或支链的烷基；
X是可选择存在C或O;
Y为可选择存在的C0-12的烷基或者N(H)–C0-6的烷基；和
Z为在末端提供巯基或者保护的巯基。
3.根据权利要求2所述的化合物或该化合物的盐，其中，R1为硫内酯，二硫化合物或硫酯。
4.根据权利要求2所述的化合物或该化合物的盐，其中，R1为具有5个环的硫内酯。
5.根据权利要求2所述的化合物或该化合物的盐，其中，X是-C(O)-,Y是N(H)–C0-6的烷基和Z是硫内酯。
6.根据权利要求2所述的化合物或该化合物的盐，其中，R1具有这样的结构：-CH2C(O)N(H)-Z。
7.根据权利要求2所述的化合物或该化合物的盐，其中，Z是烷基硫醇。
8.根据权利要求2所述的化合物或该化合物的盐，其中，该化合物或该化合物的盐选自以下这些结构：
Figure FDA0000474679520000021
9.一种二聚化合物，该化合物包括权利要求1-8所述的两个化合物，其中，该二聚化合物通过所述的两种化合物中的巯基或受保护的巯基通过二硫键连接形成。
10.根据权利要求9所述的二聚化合物，该二聚化合物选自以下化合物：
11.一种共轭物质，其包括：如权利要求1-8所述的一种或多种化合物，该化合物质与蛋白、多肽、可被检测的标记、核酸或固相共价结合。
12.根据权利要求11所述的共轭物质，其中，所述的官能团为巯基-反应基团，该基团选自：马来酰亚胺，烷基卤化物，芳基卤，α-卤代酰基，吡啶基二硫化物。
13.根据权利要求12所述的共轭物质，其中，所述的官能团为巯基-反应基团，其中，所述的化合物与蛋白、多肽、可被检测的标记、核酸或固相共价结合形成如下结构：
Figure FDA0000474679520000032
其中，R-S是本发明的通过巯基链接的化合物，L是一个化学连接，和P是所述的蛋白、多肽、可被检测的标记、核酸或固相，其中，L是C1-10亚烷基的直链或包含0-4个杂环炭骨架支链的C1-10亚烷基，1到4的取代基可以被独立随意地被下列基团所取代，这些取代基团选自：C1-6的烷基直链或支链，-NO2，-NH2，=O，卤素，三卤甲基，C1-6烷氧基，-OH，-CH2OH，和–C(O)NH2。
14.根据权利要求12所述的共轭物质，其中，可被检测的标记选自于：酶、荧光团、生物素、抗生物素的蛋白、链球菌生物素，地高辛，麦芽糖，寡聚组氨酸，2,4–二硝基苯，苯砷酸，和荧光乳胶颗粒，纳米金颗粒。
15.根据权利要求12所述的共轭物质，其中，所述的蛋白为血蓝蛋白、牛血清蛋白或牛甲状腺球蛋白。
16.根据权利要求12所述的共轭物质，其中，与化合物结合的固相选自于：薄膜，纤维素纸，聚合物珠子、乳胶颗粒、顺磁性颗粒、金颗粒、玻璃基质、硅基质、塑料基质和多孔盘。
17.一种制备共轭物质的方法，包括：让权利要求1-8所的一种或多种化合物与蛋白、多肽、可检测的标记、核酸或者固相接触，所述的蛋白、多肽、可检测的标记、核酸或者固相包括一个或多个巯基-反应基团，在一定条件下，该通过化合物上的巯基基团让所述的化合物与所述的蛋白、多肽、可检测的标记、核酸或者固相共价结合。
18.根据权利要求17所述的方法，其中，所述的化合物包括保护的硫醇基团，和所述的方法进一步包括在接触步骤之前或接触的同时进行脱保护。
19.根据权利要求17所述的方法，其中，所所述的方法进一步包括，在接触步骤之前，向所述的蛋白、多肽、可检测的标记、核酸或者固相引入所述的一个或多个巯基-反应基团。
20.根据权利要求19所述的方法，其中，所述的一个或多个巯基-反应基团选自于：马来酰亚胺，烷基卤化物，芳基卤，α-卤代酰基，吡啶基二硫化物，和引入步骤包括：让所述的蛋白、多肽、可检测的标记、核酸或者固相与包括一个或多个巯基-反应基团的二价交联试剂耦合。
21.一种对2-羟基马尿酸进行免疫应答刺激的方法，包括：用权利要求11所述的共轭物来免疫动物。
22.根据权利要求21所述的方法，进一步包括分离特异结合2-羟基马尿酸的抗体，其中该抗体与2-羟基马尿酸的亲和力至少10倍大于该抗体与水杨酸的亲和力。
23.根据权利要求22所述的方法，所述的一种或多种抗体直接从动物中分离获得。
24.一种检测样品中2-羟基马尿酸的方法，包括：执行竞争免疫测定，其中共轭物具有如下结构：
Figure FDA0000474679520000051
其中，R2是一化学连接，P是可检测的标记，其中，R2和P共价连接，其中，所述的共轭物与样本中的2-羟基马尿酸竞争结合一抗体，从测试中获得的信号表示样本中2-羟基马尿酸的浓度；和
从所获得信号确定样本中2-羟基马尿酸的浓度。
25.一种检测样品中2-羟基马尿酸的方法，包括：执行竞争免疫测定，其中，2-羟基马尿酸竞争结合具有如下结构的免疫原产生的抗体：
其中，R2是一化学连接，P是载体多肽，其中，R2和P共价连接，其中，从测试中获得的信号表示样本中2-羟基马尿酸的浓度；和
从所获得信号确定样本中2-羟基马尿酸的浓度。
26.一种诊断主体阑尾炎的方法，包括：对来自主体的样本执行权利要求24-25之一的竞争免疫测试；
和让2-羟基马尿酸的浓度与主体中存在或不存在阑尾炎相关联。
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