CN117054659A - 苯妥英抗原、抗体、试剂盒、检测方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本申请的实施例公开了一种苯妥英抗原、抗体、试剂盒、检测方法及其应用。所述苯妥英抗原具有式(2)所示的结构。本申请的苯妥英抗原特异性强、免疫原性高，苯妥英抗体特异性强、效价高。包含本申请抗体的试剂盒可以实现苯妥英的快速定量化检测，具有操作简便、灵敏度高、特异性强、结果准确、检测成本低等优点。

Description

苯妥英抗原、抗体、试剂盒、检测方法及其应用
技术领域
本申请涉及生物检测技术领域，具体涉及一种苯妥英抗原、抗体、试剂盒、检测方法及其应用。
背景技术
苯妥英的化学结构式如下所示：
苯妥英为一种乙内酰脲类抗癫痫药物，常用于抗心律失常、抗三叉神经痛和抗轻度高血压等。研究表明其有效血药浓度为10～20μg/mL，血药浓度超过20μg/mL易产生毒性反应，出现眼球震颤，超过30μg/mL出现共济失调，超过40μg/mL往往出现严重毒性。基于此，监督临床用药，制定合理的给药方案，确定最佳治疗剂量，保证个体化给药，提高疗效和减少不良反应，加强癫痫患者苯妥英钠用药的血药浓度监测显得十分必要。
临床上测定苯妥英含量的方法主要包括紫外分光光度法、玻碳电极伏安法、毛细管区电泳法、高效液相色谱法等，上述方法存在操作复杂，需要配备专用仪器、检测成本高、耗时等缺点，不能满足现场快速检测的需求，而可应用于全自动生化分析仪的试纸条或试剂盒由于操作简便、成本低、节省时间、适合现场大批量快速检测已成为国内外体外诊断的热点。
CN201620918520.5公开了一种苯妥英钠快速试剂盒，其通过胶体金法定性判断中成药和保健食品中是否含有苯妥英钠，然而，该试剂盒不能定量判断服用苯妥英钠的患者血液中的苯妥英浓度，无法指导医生合理用药。CN201210125535.2公开了一种苯妥因免疫原及其合成方法，以及由该免疫原获得的抗苯妥因特异性抗体、检测试剂及其制备方法，其公开的检测试剂可测定血清中苯妥英浓度，但存在操作步骤复杂，灵敏度相对较低，不适合临床推广的缺点。
因此，本领域亟待开发稳定性好、灵敏度高、特异性强的苯妥英检测方法，尤其是可实现血液或体液中苯妥英浓度的快速、准确的检测需求的检验试剂盒。
发明内容
本申请的一个优选的实施方案的目的是提供一种检测或测定样本中苯妥英的量的试剂盒和方法。
本申请的上述目的是通过制备一种对苯妥英具有高特异性和高免疫原性的抗原而实现。为达到期望的特异性，本申请提供了一种新型的苯妥英半抗原，其是在苯妥英的咪唑烷二酮的氮上发生衍生而生成，所得半抗原与能赋予抗原性的载体偶联后，具有免疫原性，能够刺激机体产生抗体或致敏淋巴细胞。
本申请的目的不限于上述目的，上述未提及的本申请的其他目的和优点可以从以下描述中进行理解，并通过本申请的实施方式更清晰地进行理解。此外，容易理解的是，可以通过权利要求中披露的特征及其组合来实现本申请的目的和优点。
第一方面，根据本申请的实施例，本申请提供了结构如式(1)所示的苯妥英衍生物在制备苯妥英抗原中的应用，
其中，m为3-10之间的整数，优选为5。
第二方面，根据本申请的实施例，本申请提供一种苯妥英抗原，所述苯妥英抗原的结构式如式(2)所示：
其中，m为3-10之间的整数，优选为5；X为载体，优选为蛋白质或多肽载体。可选的，所述蛋白质载体选自血蓝蛋白、牛血清白蛋白、鸡卵白蛋白、兔血清白蛋白中的任意一种。
第三方面，根据本申请的实施例，本申请提供一种对上述苯妥英抗原具有特异性的抗体。可选的，所述抗体为采用如上所述的苯妥英抗原免疫动物后产生的抗体分子，或保留与苯妥英特异性结合能力的抗体片段或抗体衍生物。可选的，所述抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。
第四方面，根据本申请的实施例，本申请提供了如上所述的苯妥英抗原或抗体在非疾病诊断目的的检测苯妥英中的应用，或在制备检测苯妥英的产品中的应用。
第五方面，根据本申请的实施例，本申请提供了一种试剂盒，所述试剂盒含有如上所述的苯妥英抗原。可选的，所述试剂盒还含有如上所述的抗体，所述抗体偶联有信号物质，所述信号物质选自酶、放射性同位素、发光物质或它们的混合物，优选所述信号物质为发光物质。可选的，所述抗体呈冻干所得的固态形态。可选的，所述试剂盒还含有呈冻干所得固体形态的鼠抗人红细胞抗体和至少一种阻断剂。可选的，所述试剂盒检测卡、ID卡和缓冲液，所述检测卡包括底板，所述底板上设有依次搭接的样品垫、包被有检测线和质控线的包被分析膜以及吸水垫；所述样品垫上包被有偶联有所述信号物质的所述抗体，所述检测线上包被有所述苯妥英抗原，所述质控线上包被有X抗鸡IgY，所述X为羊、鼠、兔或猪；可选的，所述样品垫上还包被有鼠抗人红细胞抗体和至少一种阻断剂；可选的，所述ID卡包括基于检测线光信号强度与质控线光信号强度的比值与校准品浓度变化构建的标准曲线。
第六方面，根据本申请的实施例，本申请提供了一种使用如上所述的试剂盒定量检测苯妥英的方法，包括如下步骤：
将待检样本上样于所述样品垫，采用荧光免疫分析仪分析检测结果；
可选的，将待检样本上样于所述样品垫，采用荧光免疫分析仪分析检测结果具体包括：
根据待检样本的类型，将相对应的标准曲线录入所述荧光免疫分析仪；
将所述待检样本加到缓冲液中混匀，得到混合溶液；
将所述混合溶液上样于所述样品垫，静置10～20min后，放置于所述荧光免疫分析仪中，根据所述标准曲线，读取所述待检样本中的苯妥英浓度。
本申请的实施例提供的技术方案可以包括以下有益效果：
本申请提出了一种全新的苯妥英半抗原，并利用苯妥英半抗原制备了免疫原性强的苯妥英抗原及其抗体。其中，本申请的苯妥英抗原特异性强、免疫原性高，苯妥英抗体特异性强、效价高。包含本申请抗体的试剂盒可以实现苯妥英的快速定量化检测，具有操作简便、灵敏度高、特异性强、结果准确、检测成本低等优点。
附图说明
通过阅读参照以下附图所作的对非限制性实施例所作的详细描述，本申请的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为本申请实施例的检测卡的结构示意图。
图2为苯妥英荧光免疫反应标准曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例对本申请作进一步的详细说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释相关发明，而非对该发明的限定。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
需要说明的是，在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
以下针对本申请实施例的苯妥英抗原、抗体、试剂盒、检测方法及应用进行具体说明：
本申请提供了一种可作为半抗原的苯妥英衍生物，其结构式如式(1)所示：
其中，m为3-10之间的整数，优选为5。
本申请提出的苯妥英衍生物作为一种人工半抗原，其具有位于端部的游离的羧基，可以与载体更直接地连接，通过将其与能赋予抗原性的载体偶联后，作为一个整体具有免疫原性，能够刺激机体产生抗体或致敏淋巴细胞，由此提出了其在用于制备苯妥英抗原中的应用。
其中，半抗原是指本身无免疫原性，只具有反应原性的物质。
需要说明的是，本申请中所述的苯妥英衍生物可以以其药学上可接受的盐形式存在，或者以药学上可接受的溶剂化物的形式存在。其中，“药学上可接受的”是指适合于药学上使用的化合物。
需要说明的是，本申请对上述实施例以及下文实施例中所采用的苯妥英衍生物来源没有特别的限制，可以为市售产品或采用本领域技术人员所熟知的制备方法制备得到。
基于上述苯妥英衍生物的新用途，本申请提出了一种苯妥英抗原，所述苯妥英抗原的结构式如式(2)所示：
其中，m为3-10之间的整数，优选为5；
X为载体，优选为蛋白质或多肽载体。
在其中一些实施例中，所述蛋白质或多肽载体选自血蓝蛋白、牛血清白蛋白、鸡卵白蛋白、兔血清白蛋白中的任意一种，优选为牛血清白蛋白。
多肽载体可以是天然多氨基酸片段或人工合成的多氨基酸片段，例如多聚赖氨酸，多聚赖氨酸与半抗原的-COOH结合后，可刺激动物产生高亲和力的抗体。
可以理解的是，载体还可以是大分子聚合物。所述的大分子聚合物包括羧甲基纤维素、聚乙烯比咯烷酮等。大分子聚合物皆可与半抗原结合，加入弗氏佐剂可诱导动物产生高效价的抗体。
作为一种可选的示例，本申请的苯妥英抗原的制备过程如下：
1)活化蛋白：将活化剂与载体溶液混合，活化得到活化载体；
2)载体标记：将与活化载体溶液混合，得到载体标记物溶液；
3)透析沉淀：采用PBS对所述载体标记物溶液进行透析，得到载体标记物沉淀；
4)纯化：将所述载体标记物沉淀冻干后经分子筛分离纯化得到所述抗原。
本申请中的活化剂包括但不限于EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)、磺基-SMCC交联剂，MBS(3-马来酰亚胺基苯甲酸琥珀酰亚胺酯)、NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)、DCC(二环己基碳二亚胺)和CDC(N,N'-二异丙基碳二亚胺)，本领域技术人员可以根据实际需要选择合适的活化剂。活化反应的温度为室温；活化反应时间为1～4h。
载体蛋白可以是血蓝蛋白、牛血清白蛋白、鸡卵白蛋白、兔血清白蛋白中的任意一种，优选为牛血清白蛋白。
基于上述苯妥英抗原，本申请还提供了一种对上述苯妥英抗原具有特异性的抗体，即提供了一种苯妥英抗体，所述抗体为采用如上所述的苯妥英抗原免疫动物后产生的抗体分子，或保留与苯妥英特异性结合能力的抗体片段或抗体衍生物。
其中抗体片段选自抗体的F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv和scFv中的任意一种。抗体衍生物包括例如通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、由已知保护/阻断基团的衍生化、蛋白水解切割、与细胞配体或其它蛋白连接等修饰的抗体。可通过已知技术进行任何许多的化学修饰，包括但不限于特异性化学切割、乙酰化、甲酰化等。
在其中一些实施例中，所述抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。
本申请中所述的采用苯妥用抗原免疫动物的方法，可以采用本领域已知的各种免疫手段。其中，动物包括兔、山羊、小鼠、绵羊、豚鼠以及马中的任一种。
作为一种可选的示例，本申请的苯妥英抗体的制备过程如下：
1、采用皮下多点弗氏佐剂注射方式，对动物进行多次免疫注射，使动物产生免疫反应。2、定期监测动物血清中的抗体效价，效价检测合格后取脾细胞，进行杂交瘤细胞融合，筛选单克隆杂交瘤细胞。3、将杂交瘤细胞在体外条件下做大规模培养，或注射到小鼠腹腔内增殖，从而可以由细胞培养液或小鼠腹水中提取出适当量的单克隆抗体。
本申请提出的上述苯妥英抗原抗体可应用于非疾病诊断目的的检测样本是否含有苯妥英或对样本中苯妥英的量进行检测，或应用于制备检测苯妥英的产品。其中所述样本为生物流体。优选地，所述生物流体选自血液、血清、血浆、抗凝血、细胞培养上清、唾液、精液、羊水、组织裂解液、粪便、尿液、支气管灌洗液、肺泡灌洗液、痰液中的至少一种，优选所述生物流体选自血液、血清、血浆、唾液或尿液。优选地，所述样本是来自人体液。
由此，本申请还提供了一种试剂盒，所述试剂盒含有如上所述的苯妥英抗原。
在其中一些实施例中，所述试剂盒含有如上所述的抗体。采用该试剂盒检测或测定样本中的苯妥英的方法包括将样本与本申请的抗体接触，检测或测定被结合的偶联物，根据标准曲线推导出样本中的苯妥英的存在或量。优选所述抗体为单克隆抗体。
在其中一些实施例中，所述抗体偶联有信号物质，所述信号物质选自酶、放射性同位素、发光物质或它们的混合物。
信号物质具有能够被肉眼直接观察或被仪器检测或探测到的特性例如发光、显色、放射性等特性的一类物质，通过该特性可以实现对相应目标物的定性或定量检测。其中，酶为催化底物显色的酶，包括但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱酯酶以及6-磷酸葡萄糖脱氧酶。放射性同位素包括但不限于212Bi、131I、111In、90Y、186Re、211At、125I、188Re、153Sm、213Bi、32P、94mTc、99mTc、203Pb、67Ga、68Ga、43Sc、47Sc、110mIn、97Ru、62Cu、64Cu、67Cu、68Cu、86Y、88Y、121Sn、161Tb、166Ho、105Rh、177Lu、172Lu和18F。发光物质可以是生物发光材料、化学发光材料、荧光材料以及纳米颗粒。化学发光试剂包括但不限于鲁米诺及其衍生物、光泽精、甲壳动物荧光素及其衍生物、联吡啶钌及其衍生物、吖啶酯及其衍生物、二氧环乙烷及其衍生物、洛粉碱及其衍生物和过氧草酸盐及其衍生物。荧光材料包括但不限于荧光素类染料及其衍生物(例如包括但不限于异硫氰酸荧光素(FITC)羟基光素(FAM)、四氯光素(TET)等或其类似物)、罗丹明类染料及其衍生物(例如包括但不限于红色罗丹明(RBITC)、四甲基罗丹明(TAMRA)、罗丹明B(TRITC)等或其类似物)、Cy系列染料及其衍生物(例如包括但不限于Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy3等或其类似物)、Alexa系列染料及其衍生物(例如包括但不限于AlexaFluor350、405、430、488、532、546、555、568、594、610、33、647、680、700、750等或其类似物)和蛋白类染料及其衍生物(例如包括但不限于藻红蛋白(PE)、藻蓝蛋白(PC)、别藻蓝蛋白(APC)、多甲藻黄素-叶绿素蛋白(preCP)等)。纳米颗粒包括但不限于胶体、有机纳米颗粒、磁性纳米颗粒、量子点纳米颗粒和稀土络合物纳米颗粒。
优选所述信号物质为发光物质，更优选为荧光材料。
示例性地，采用荧光材料标记抗体的过程如下：
1)活化荧光材料表面基团：将荧光材料溶液与EDC溶液、NHS溶液混合，对荧光材料表面基团进行活化，然后离心分离沉淀，备用；
2)标记：向步骤1)的沉淀中加入抗体，在超声环境下进行标记，然后离心分离沉淀备用；
3)封闭：向步骤2)的沉淀中加入封闭液，在超声环境下进行封闭处理，然后离心分离沉淀备用；
4)重悬：加入标记保存液，吹吸混匀并超声重悬，得到抗体-荧光材料偶联物。
优选的，步骤1)中，所述EDC与NHS溶液按照体积比0.1～5∶1～50混合，所述EDC溶液的浓度为80～150mg/mL；所述NHS溶液的浓度为80～150mg/mL；活化时间为5～60min。
优选的，步骤2)中，于10000～15000rpm，1～5℃，离心10～30min分离沉淀。
优选的，步骤3)中，封闭液包括第二缓冲液，还包括质量浓度为0.05～10％的BSA和/或酪蛋白；超声振荡1～60min后，于13500rpm，4℃离心10min分离沉淀。
优选的，步骤4)中，标记保存液包括第二缓冲液，还包括质量浓度为0.05～10％BSA和/或酪蛋白，还包括质量浓度为0.05～10％蔗糖和/或海藻糖，质量浓度为0.05～10％的抑菌剂，优选的，抑菌剂为PC300。
优选的，荧光材料为荧光微球。
优选的，所述第二缓冲液包括甘氨酸和/或磷酸盐，所述第二缓冲液的浓度为0.001～0.5M，pH为6～9。
优选的，所述步骤1)中所述荧光材料的固含量S＝1～5％；
优选的，所述步骤4)中的荧光材料与抗体的质量比为1～5∶5～50。
在其中一些实施例中，所述抗体呈冻干所得的固态形态，例如冻干微球的形式，由此可提高试剂稳定性，使得试剂盒无需冷藏，常温储存即可。
示例性地，冻干抗体的过程如下：
吸取所需量的抗体-荧光材料偶联物，按一定比例加入冻干保护液，备用。
打开冻干机，下载配方。
当冻干机达到预冻温度时，将抗体-荧光材料偶联物制备成微球或其他形态，放入冻干机中，按照冻干机设定的程序进行冻干，获得冻干后的抗体-荧光材料偶联物。
在其中一些实施例中，所述试剂盒还含有呈冻干所得固体形态的鼠抗人红细胞抗体和至少一种阻断剂，其能够消除样本中血红蛋白及嗜异性抗体的干扰，提高检测准确性及灵敏度。
在其中一些实施例中，所述试剂盒包括检测卡、ID卡和缓冲液，所述检测卡包括底板，所述底板上设有依次搭接的样品垫、包被有检测线和质控线的包被分析膜以及吸水垫；所述样品垫上包被有偶联有所述信号物质的所述抗体，所述检测线上包被有所述苯妥英抗原，所述质控线上包被有X抗鸡IgY，所述X为羊、鼠、兔或猪；可选的，所述样品垫上还包被有鼠抗人红细胞抗体和至少一种阻断剂。
具体地，所述试剂盒包括一固相载体，示例性地，所述固相载体为侧流式试纸条，该试纸条可以包括吸水基体(例如硝化纤维)和/或其他适用的材料。基体可以具有样本装载区域、标记区域和检测区域。这些类型的试纸条在本领域是公知的。具体地，如图1所示，所述试纸条包括底板(例如PVC)，底板10的正面包括多个区，如样本装载区域，标记区域，检测区域和吸水区域，样本装载区域包括样品垫，标记区域包括标记垫，检测区域包括包被分析膜(如NC膜)，吸水区域包括吸水垫，其中，标记垫上包被有荧光材料标记的苯妥英抗体，即抗体-荧光材料偶联物，NC膜设有包被苯妥英抗原的检测线(T线)和包被羊抗鸡IgY的控制线(C线)。
检测过程中，样本通过毛细作用在试纸条上移动，同时样品中的待测物(苯妥英)和T线上抗原竞争地与释放出的抗体-荧光材料偶联物发生免疫反应，因而随着样品中待测物含量的升高，结合于T线上的抗体-荧光材料偶联物量减少，而游离的标记物和抗体-荧光材料-待测物则会越过T线而结合至C线。反应完成后，T线上标记物与样本中苯妥英的浓度有一定的对应关系，浓度越高，相应T线上的荧光强度越弱。检测结果通过荧光免疫分析仪进行分析，T线和C线上的荧光物质在激发光下发出可见光信号，T线和C线的信号比值与样本中的苯妥英浓度呈反比，通过仪器内部的标准曲线，分析可得出待测样本中苯妥英的含量。
需要说明的是，所述固相载体不限于试纸条，还可以是试管、EP管、多孔板、微量反应板凹孔或微球等。
在其中一些实施方式中，所述侧流式试纸条置于卡壳中以检测卡的形式呈现，所述卡壳与样品垫相对应的位置开设加样孔，待检样本可通过所述加样孔施加到样品垫上。
在其中的一些实施方式中，所述试剂盒进一步还配套有ID卡，所述ID卡中预先配置有标准曲线，使得用户能够根据所述标准曲线的曲线数据读取待检样本的检测结果。其中，标准曲线是基于检测线光信号强度与质控线光信号强度的比值与校准品浓度变化构建的，ID卡中可存储有多种标准曲线，使得用户可根据待检测样本类型选择与样本类型相对应的标准曲线，提升试剂盒的通用性以及提升检测结果的准确性。
在其中的一些实施方式中，所述试剂盒还配套有缓冲液，用于在待检样本浓度过高时稀释样本。所述缓冲液可以为PBS缓冲液。
在其中的一些实施方式中，所述试剂盒进一步包括本领域常规使用的其他试剂/成分，例如包被液、封闭液和保存液等。
本申请提供了一种使用如上所述的试剂盒定量检测苯妥英的方法，包括如下步骤：
将待检样本上样于所述样品垫，采用荧光免疫分析仪分析检测结果；
将待检样本上样于所述样品垫可以是将试纸条插入待检样本或者是将待检样本滴在样品垫上。
可选的，将待检样本上样于所述样品垫，采用荧光免疫分析仪分析检测结果具体包括：
根据待检样本的类型，将相对应的标准曲线录入所述荧光免疫分析仪；
将所述待检样本加到缓冲液中混匀，得到混合溶液；
将所述混合溶液上样于所述样品垫，静置10～20min后，放置于所述荧光免疫分析仪中，根据所述标准曲线，读取所述待检样本中的苯妥英浓度。
更具体地，包括以下步骤：
1)录入标准曲线：将ID卡与荧光免疫分析仪连接，根据样本类型，将与样本类型相对应的标准曲线录入荧光免疫分析仪；
2)取样：将待检样本与缓冲液充分混匀，得到混合溶液；
3)加样：将混合溶液加到试剂盒的加样孔中，静置10～20min；
4)测试：将添加了样本的试剂盒放入荧光免疫分析仪中读取数据；
5)计算结果：将荧光免疫分析仪对试剂盒进行检测的数据进行数据分析，根据标准曲线计算得到被检样本的苯妥英浓度。
实施例1
苯妥英抗原的制备：
1)活化载体蛋白：按照体积比5∶1将EDC溶液与载体蛋白溶液混合，活化2h得到活化的载体蛋白，其中EDC溶液的浓度为50g/L，载体蛋白溶液的浓度为20g/L；
2)载体蛋白标记：苯妥英半抗原与载体蛋白按照摩尔比1∶10，将苯妥英半抗原与活化的载体蛋白溶液混合，反应8h得到载体蛋白标记物溶液，备用；
3)透析：用0.005M的PBS对步骤2)得到载体蛋白标记物进行透析，得到载体蛋白标记物沉淀；
4)纯化：将所述步骤3)中的载体蛋白标记物沉淀进行冻干，用S100的分子筛进行分离纯化得到抗原。
实施例2
苯妥英抗原的制备：
1)活化载体蛋白：按照体积比4∶1.5将EDC溶液与载体蛋白溶液混合，活化2h得到活化的载体蛋白，其中EDC溶液的浓度为60g/L，载体蛋白溶液的浓度为25g/L；
2)载体蛋白标记：苯妥英半抗原与载体蛋白按照摩尔比1∶15，将苯妥英半抗原与活化的载体蛋白溶液混合，反应4h得到载体蛋白标记物溶液，备用；
3)透析：用0.01M的PBS对步骤2)得到载体蛋白标记物进行透析，得到载体蛋白标记物沉淀；
4)纯化：将所述步骤3)中的载体蛋白标记物沉淀进行冻干，用S200的分子筛进行分离纯化得到抗原。
实施例3
苯妥英抗原的制备：
1)活化载体蛋白：按照体积比3∶2将EDC溶液与载体蛋白溶液混合，活化2h得到活化的载体蛋白，其中EDC溶液的浓度为70g/L，载体蛋白溶液的浓度为30g/L；
2)载体蛋白标记：苯妥英半抗原与载体蛋白按照摩尔比1∶20，将苯妥英半抗原与活化的载体蛋白溶液混合，反应0.25h得到载体蛋白标记物溶液，备用；
3)透析：用0.1M的PBS对步骤2)得到载体蛋白标记物进行透析，得到载体蛋白标记物沉淀；
4)纯化：将所述步骤3)中的载体蛋白标记物沉淀进行冻干，用S300的分子筛进行分离纯化得到抗原。
实施例4
抗苯妥英特异性抗体的制备：
(1)用PBS分别将上述合成的苯妥英抗原稀释至1.0mg/mL，得到抗原溶液，然后用1.0mL抗原溶液与弗氏完全佐剂混合，对实验动物兔进行注射。
(2)2～3周后，再用1.0mL相同的抗原溶液与弗氏不完全佐剂对上述实验动物兔注射一次，之后每隔四周注射一次，共计注射4次。
(3)定期监测动物血清中的抗体效价，效价检测合格后取脾细胞，和预先培养好的Sp2/0骨髓瘤细胞(该细胞购买于武汉大学的中国典型培养物保藏中心)在PEG的作用下进行融合，得到融合细胞。
(4)使用HAT培养基在96孔细胞培养板上培养融合细胞，7天后取融合细胞的上清进行ELISA检测，挑取OD450﹥1.5孔内细胞作为阳性融合细胞，得到的阳性细胞融合细胞采用有限稀释法进行亚克隆，克隆4次，得到分泌强阳性的抗苯妥英的单克隆体的杂交瘤细胞。
(5)10周龄的BALB/c小鼠，注射石蜡7天后，将步骤(4)得到的杂交瘤细胞扩大培养后注入小鼠的腹部。7天后从小鼠的腹部采集富含单克隆抗体的腹水。
采用ProteinA亲和层析法，用1×PBS平衡柱子，将步骤(5)得到的腹水分别过柱后，再用1×PBS清洗柱子，最后用0.1M甘氨酸洗脱柱子。收集洗脱液，经SDS-PAGE鉴定纯化的单克隆抗体，结果显示采用实施例1-3所制备的抗原所制备的抗体的纯度均为98％以上。
实施例5
抗体-荧光材料偶联物的制备：
采用实施例1的抗原所制备的抗体制备抗体-荧光材料偶联物，制备方法如下：
1)活化荧光材料表面基团：按照体积比0.1∶1将EDC溶液、NHS溶液混合，然后加入荧光微球溶液，对荧光微球表面基团进行活化，然后离心分离沉淀，EDC溶液浓度为80mg/mL，NHS溶液的浓度为100mg/mL，所述荧光微球固含量为1％；
2)标记：向步骤1)的沉淀中加入抗体，抗体按照荧光微球与抗体质量比为5∶5添加抗体，在超声状态下震荡5min进行标记，然后离心分离沉淀；
3)封闭：向步骤2)的沉淀中加入封闭液，在超声状态下进行封闭处理，然后离心分离沉淀，所述封闭液包括0.05M的甘氨酸溶液和1％(w/w)的BSA；超声振荡5min后，于12000rpm4℃离心10min分离沉淀。；
4)重悬：加入标记保存液液，吹吸混匀并超声重悬，得到抗体-荧光材料偶联物，所述标记保存液包括0.05M的甘氨酸溶液、1％(w/w)BSA、0.1％(w/w)的蔗糖和1％(w/w)的PC300。
实施例6
抗体-荧光材料偶联物的制备：
采用实施例1的抗原所制备的抗体制备抗体-荧光材料偶联物，制备方法如下：
1)活化荧光材料表面基团：按照体积比0.1∶5将EDC溶液、NHS溶液混合，然后加入荧光微球溶液，对荧光微球表面基团进行活化，然后离心分离沉淀，EDC溶液浓度为100mg/mL，NHS溶液的浓度为120mg/mL，所述荧光微球固含量为1％；
2)标记：向步骤1)的沉淀中加入抗体，抗体按照荧光微球与抗体质量比为2∶5添加，在超声状态下震荡10min进行标记，然后离心分离沉淀；
3)封闭：向步骤2)的沉淀中加入封闭液，在超声状态下进行封闭处理，然后离心分离沉淀，所述封闭液包括0.1M的甘氨酸溶液，还包括5％(w/w)的BSA；超声振荡10min后，于12000rpm，4℃离心10min分离沉淀。；
4)重悬：加入标记保存液液，吹吸混匀并超声重悬，得到抗体-荧光材料偶联物，所述标记保存液包括0.1M的甘氨酸溶液、5％(w/w)BSA、5％(w/w)的蔗糖和5％(w/w)的PC300。
实施例7
抗体-荧光材料偶联物的制备：
采用实施例1的抗原所制备的抗体制备抗体-荧光材料偶联物，制备方法如下：
1)活化荧光材料表面基团：按照体积比3∶1将EDC溶液、NHS溶液混合，然后加入荧光微球溶液，对荧光微球表面基团进行活化，然后离心分离沉淀，EDC溶液浓度为120mg/mL，NHS溶液的浓度为100mg/mL，所述荧光微球固含量为3％；
2)标记：向步骤1)的沉淀中加入抗体，抗体按照荧光微球与抗体质量比为1∶5添加，在超声状态下震荡20min进行标记，然后离心分离沉淀；
3)封闭：向步骤2)的沉淀中加入封闭液，在超声状态下进行封闭处理，然后离心分离沉淀，所述封闭液包括0.5M的甘氨酸、10％(w/w)的BSA；超声振荡20min后，于12000rpm4℃离心20min分离沉淀。；
4)重悬：加入标记保存液液，吹吸混匀并超声重悬，得到抗体-荧光材料偶联物，所述标记保存液包括0.5M的磷酸钠溶液、5％(w/w)BSA、10％(w/w)的海藻糖和10％(w/w)的PC300。
实施例8
抗体-荧光材料偶联物的制备：
采用实施例1的抗原所制备的抗体制备抗体-荧光材料偶联物，制备方法如下：
1)活化荧光材料表面基团：按照体积比3∶10将EDC溶液、NHS溶液混合，然后加入荧光微球溶液，对荧光微球表面基团进行活化，然后离心分离沉淀，EDC溶液浓度为150mg/mL，NHS溶液的浓度为150mg/mL，所述荧光微球固含量为4％；
2)标记：向步骤1)的沉淀中加入抗体，抗体按照荧光微球与抗体质量比为1∶10添加，在超声状态下震荡30min进行标记，然后离心分离沉淀；
3)封闭：向步骤2)的沉淀中加入封闭液，在超声状态下进行封闭处理，然后离心分离沉淀，所述封闭液包括0.5M的磷酸钠，还包括1％(w/w)的酪蛋白；超声振荡30min后，于12000rpm4℃离心20min分离沉淀。；
4)重悬：加入标记保存液液，吹吸混匀并超声重悬，得到抗体-荧光材料偶联物，所述标记保存液包括1M的甘氨酸溶液、1％(w/w)的酪蛋白、0.05％(w/w)的蔗糖和1％(w/w)的PC300。
实施例9
抗体-荧光材料偶联物的制备：
采用实施例2的抗原所制备的抗体制备抗体-荧光材料偶联物，制备方法如下：
1)活化荧光材料表面基团：按照体积比0.1∶5将EDC溶液、NHS溶液混合，然后加入荧光微球溶液，对荧光微球表面基团进行活化，然后离心分离沉淀，EDC溶液浓度为80mg/mL，NHS溶液的浓度为100mg/mL，所述荧光微球固含量为1％；
2)标记：向步骤1)的沉淀中加入抗体，抗体添加量为荧光微球与抗体质量比为1∶25，在超声状态下震荡45min进行标记，然后离心分离沉淀；
3)封闭：向步骤2)的沉淀中加入封闭液，在超声状态下进行封闭处理，然后离心分离沉淀，所述封闭液包括第二缓冲液，还包括5％(w/w)的酪蛋白；超声振荡45min后，于12000rpm，4℃离心20min分离沉淀。；
4)重悬：加入标记保存液液，吹吸混匀并超声重悬，得到抗体-荧光材料偶联物，所述标记保存液包括0.5M的甘氨酸溶液、5％(w/w)BSA、5％(w/w)的蔗糖和5％(w/w)的PC300。
实施例10
抗体-荧光材料偶联物的制备：
采用实施例3的抗原所制备的抗体制备抗体-荧光材料偶联物，制备方法如下：
1)活化荧光材料表面基团：按照体积比1∶10将EDC溶液、NHS溶液混合，然后加入荧光微球溶液，对荧光微球表面基团进行活化，然后离心分离沉淀，EDC溶液浓度为100mg/mL，NHS溶液的浓度为80mg/mL，所述荧光微球固含量为2％；
2)标记：向步骤1)的沉淀中加入抗体，抗体按照荧光微球与抗体质量比为1∶50添加，在超声状态下震荡60min进行标记，然后离心分离沉淀；
3)封闭：向步骤2)的沉淀中加入封闭液，在超声状态下进行封闭处理，然后离心分离沉淀，所述封闭液包括0.1M的磷酸盐溶液，还包括10％(w/w)的酪蛋白；超声振荡60min后，于12000rpm4℃离心30min分离沉淀。；
4)重悬：加入标记保存液液，吹吸混匀并超声重悬，得到抗体-荧光材料偶联物，所述标记保存液包括0.05M的磷酸盐溶液、5％(w/w)的BSA、10％(w/w)的蔗糖和10％(w/w)的PC300。
实施例11
苯妥英检测试剂盒的制备及苯妥英检测：
1、检测卡的制备
如图1所示，检测卡包括底板10，所述底板10上设有依次搭接的样品垫20、标记垫30、包被有检测线60和质控线70的包被分析膜40以及吸水垫50；
在样品垫20上分别包被实施例5-10所制备的抗体-荧光材料偶联物；
在标记垫30上包被鼠抗人红细胞单克隆抗体及种异嗜性抗体阻断剂；
在检测线60上包被有所述苯妥英抗原，所述质控线70上包被有羊抗鸡IgY。
2、标准曲线的制作
通过在空白样品中加入适量苯妥英标准溶液，使其含量在一定梯度范围内变化，取不同浓度的校准品滴加到试纸条的样品垫，通过荧光免疫分析仪读取检测信号值，根据定标浓度与仪器信号值关系曲线建立标准曲线，标准曲线如图2所示。
3、苯妥英检测
1)标准曲线录入：将标准曲线录入荧光免疫分析仪；
2)取样：采集样本与pH为7.0的磷酸盐缓冲液充分混匀，得到混合溶液；
3)加样：将混合溶液加到样品垫上，静置10～20min；
4)测试：将添加了样本的试纸条放入荧光免疫分析仪中读取数据；
5)计算结果：将荧光免疫分析仪对试纸条进行检测的数据进行数据分析，计算得到被检测样本的苯妥英浓度。
其中，以包被了实施例5的抗体-荧光材料偶联物的试纸条为例，用同一批试纸条分别检测了8.5μg/mL(QC1)和17μg/mL(QC2)的苯妥英质控品，每个质控品测试10次，计算平均变异系数(CV值)，用于表征批内精密度，实验结果如下表所示。
QC1(μg/mL) QC2(μg/mL)
1 8.35 16.56
2 8.53 17.17
3 8.55 18.06
4 8.92 18.77
5 8.33 16.78
6 8.02 17.50
7 8.21 16.75
8 9.15 17.07
9 8.87 18.49
10 8.68 16.35
平均值 8.56 17.35
标准差 0.35 0.83
CV 4.10％ 4.80％
可以看出，CV值范围在4.1％～4.8％之间，CV值均小于5％，说明试纸条有较高的精密度。
进一步通过实验发现包被了实施例6-10的抗体-荧光材料偶联物的试纸条的CV值均小于5％，说明本申请所制备的试剂盒具有较高的精密度。
实施例12
参照实施例11的方法制备检测卡，不同的是检测卡包括底板10，所述底板10上设有依次搭接的样品垫20、包被有检测线60和质控线70的包被分析膜40以及吸水垫50；
在样品垫20上包被有实施例5的抗体-荧光材料偶联物，还包被有鼠抗人红细胞抗体和种异嗜性抗体阻断剂。
在检测线60上包被有所述苯妥英抗原，所述质控线70上包被有羊抗鸡IgY。
实施例13
参照实施例11的方法制备检测卡，不同的是检测卡包括冻干微球1和底板10，所述底板10上设有依次搭接的样品垫20、包被有检测线60和质控线70的包被分析膜40以及吸水垫50，所述冻干微球1是将实施例5所得抗体-荧光微球偶联物冻干所得，所述冻干微球1设置在上。
在样品垫20上包被有鼠抗人红细胞单克隆抗体及种异嗜性抗体阻断剂；
在检测线60上包被有所述苯妥英抗原，所述质控线70上包被有羊抗鸡IgY。
实施例14
参照实施例11的方法制备检测卡，不同的是检测卡包括冻干微球1、冻干微球2和底板10，所述底板10上设有依次搭接的样品垫20、包被有检测线60和质控线70的包被分析膜40以及吸水垫50，所述冻干微球1是将实施例5所得抗体-荧光微球偶联物冻干所得，所述冻干微球2为鼠抗人红细胞单克隆抗体及种异嗜性抗体阻断剂，所述冻干微球1和2均设置在样品垫20上。
在检测线60上包被有所述苯妥英抗原，所述质控线70上包被有羊抗鸡IgY。
用实施例12-14的试剂盒分别检测了8.5μg/mL(QC1)和17μg/mL(QC2)的苯妥英质控品，每个质控品测试10次。结果显示，CV值范围在4.1％～4.8％之间，CV值均小于5％，说明上述试剂盒具有较高的精密度。
对比例1
采用市售苯妥英检测试剂盒对8.5μg/mL(QC1)和17μg/mL(QC2)的苯妥英质控品进行检测，每个质控品测试10次，结果显示，其变异系数(CV)接近15.00％，远高于本申请的试剂盒，本发明制备的试剂盒变异系数(CV)≤5.00％，本发明提高了苯妥英定量检测的精密度。
本申请提出的苯妥英抗原特异性强、免疫原性高，且价格仅为市售抗原的十分之一，采用该抗原制备的苯妥英抗体特异性强、效价高。
包含本申请抗体的试剂盒可以实现苯妥英的快速定量化检测，操作简便、灵敏度高、特异性强、结果准确、检测成本低，并且可常温储存和单人份包装，解决了现有的试剂盒包装大，需2-8℃冷藏保存，使用不便捷的缺点。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本申请的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本申请的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本申请的限制，本领域的普通技术人员在本申请的范围内可以对上述实施例进行修改、替换和变型。

Claims (14)

1.结构如式(1)所示的苯妥英衍生物在制备苯妥英抗原中的应用，
其中，m为3-10之间的整数，优选为5。
2.一种苯妥英抗原，其特征在于，所述苯妥英抗原的结构式如式(2)所示：
其中，m为3-10之间的整数，优选为5；
X为载体，优选为蛋白质或多肽载体。
3.根据权利要求2所述的苯妥英抗原，其特征在于，所述蛋白质载体选自血蓝蛋白、牛血清白蛋白、鸡卵白蛋白、兔血清白蛋白中的任意一种。
4.一种权利要求2或3所述的苯妥英抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将活化剂与载体溶液混合，得到活化载体；
将与活化载体溶液混合，得到载体标记物溶液；
采用PBS对所述载体标记物溶液进行透析，得到载体标记物沉淀；
将所述载体标记物沉淀冻干后经分子筛分离纯化得到所述抗原。
5.一种对权利要求2或3所述苯妥英抗原具有特异性的抗体。
6.根据权利要求5所述的抗体，其特征在于，所述抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。
7.权利要求2或3所述的苯妥英抗原，或权利要求5或6所述的抗体在非疾病诊断目的的检测苯妥英中的应用，或在制备检测苯妥英的产品中的应用。
8.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求2或3所述的苯妥英抗原。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有权利要求5或6所述的抗体。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述抗体偶联有信号物质，所述信号物质选自酶、放射性同位素、发光物质或它们的混合物，优选所述信号物质为发光物质。
11.根据权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，所述抗体呈冻干所得的固态形态。
12.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有呈冻干所得固体形态的鼠抗人红细胞抗体和至少一种阻断剂。
13.根据权利要求8-12任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测卡、ID卡和缓冲液，所述检测卡包括底板，所述底板上设有依次搭接的样品垫、包被有检测线和质控线的包被分析膜以及吸水垫；
所述样品垫上包被有偶联有所述信号物质的所述抗体，所述检测线上包被有所述苯妥英抗原，所述质控线上包被有X抗鸡IgY，所述X为羊、鼠、兔或猪；
可选的，所述样品垫上还包被有鼠抗人红细胞抗体和至少一种阻断剂；
可选的，所述ID卡包括基于检测线光信号强度与质控线光信号强度的比值与校准品浓度变化构建的标准曲线。
14.一种使用权利要求8-13任一项所述的试剂盒定量检测苯妥英的方法，其特征在于，包括如下步骤：
将待检样本上样于所述样品垫，采用荧光免疫分析仪分析检测结果；
可选的，将待检样本上样于所述样品垫，采用荧光免疫分析仪分析检测结果具体包括：
根据待检样本的类型，将相对应的标准曲线录入所述荧光免疫分析仪；
将所述待检样本加到缓冲液中混匀，得到混合溶液；
将所述混合溶液上样于所述样品垫，静置10～20min后，放置于所述荧光免疫分析仪中，根据所述标准曲线，读取所述待检样本中的苯妥英浓度。
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