CN103805709A - 边鸡肌纤维特性的分子遗传标记及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及家禽育种领域，具体涉及一种边鸡肌纤维特性的分子遗传标记及应用。本发明公开了作为边鸡肌纤维特性的分子遗传标记的应用。所述应用是扩增得到MSTN基因（162bp）的目的片段，目的片段经限制性内切酶BbvI酶切，凝胶电泳后用银染显色，得到DNA的酶切图谱，根据图谱中条带的数量和大小对待测样本的肌纤维特性进行判断；可以根据制定的育种目标选择MSTN基因中不含BbvI酶切位点的个体（AA型）或含有BbvI酶切位点的纯合型样本（GG型）。本发明方法简单快捷，且不受外界环境的影响，可以用于边鸡肌纤维特性的分子遗传标记，进行标记辅助选择。

Description

边鸡肌纤维特性的分子遗传标记及应用
技术领域
本发明涉及家禽育种领域，具体涉及一种用分子遗传标记分析边鸡肌纤维特性的方法。
背景技术
大量研究发现畜禽的肌肉品质与其肌肉组织学特性有显著的相关性，特别是肌纤维密度、肌纤维直径对肌肉品质的影响非常显著，而肌纤维特性大多是数量性状，一般受微效多基因控制。staunllsl证实肌纤维直径和肌纤维密度等性状主要由遗传因素所决定，遗传力较高。在肌纤维的形成过程中，肌细胞的增殖、分化由一些正向调控因子和负向调控因子进行双向调节。肌纤维特性是一个活体无法测量的性状，因而要找到一个能够在畜牧生产上切实应用分析肌纤维特性的有效方法，必须寻找控制肌纤维特性性状的主基因或与其连锁的遗传标记，然后通过这些标记或基因实现对目标性状的活体和早期选育。
肌肉生长抑制素（myostatin,MSTN）基因，研究证实它具有抑制骨骼肌生长的作用，是骨骼肌生长的负调控因子，主要通过抑制MyoD家族成员的转录活性负向调控肌细胞的生长发育。McPherron和Lee通过基因敲除技术使小鼠的MSTN基因C端生物活性区缺失，得到的突变纯合体小鼠，研究表明突变小鼠肌肉肥大的原因既有肌细胞的增生也有肌纤维的肥大。因而研究鸡肌肉生长抑制素基因的突变对肌纤维特性状的影响，进而用于标记辅助选择具有很大的可能性。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种利用分子标记分析边鸡肌纤维特性的方法，该方法利用MSTN基因BbvI酶切图谱对边鸡肌纤维特性进行标记辅助选择，不受环境影响。
本发明公开了MSTN基因作为边鸡肌纤维特性的分子遗传标记的应用。
基于上述应用的分析边鸡肌纤维特性的方法是：提取待测样本的基因组DNA，经序列如SEQ ID NO：1-2所示的特异性引物扩增得到162bp的目的片段，目的片段经限制性内切酶BbvI酶切，凝胶电泳后用银染显色，得到DNA的酶切图谱，根据图谱中条带的数量和大小对待测样本的肌纤维特性进行判断并选留符合育种目的的个体。仅有162bp条带的为肌纤维密度低、肌纤维直径长和肌纤维面积大的纯合型样本，仅有127bp条带的为肌纤维密度高、肌纤维直径短和肌纤维面积小的纯合型样本。
本发明的原理是：利用前期研究发现的MSTN基因外显子1的BbvI酶切位点，针对该位点设计特异性引物扩增边鸡基因组DNA，扩增产物经BbvI酶切产生3种基因型（GG、GA和AA）。该单核苷酸突变能稳定遗传，选择的检测方法简单快捷，且不受外界环境的影响，可以用于边鸡肌纤维特性的分子遗传标记，进行标记辅助选择。
所述分子遗传标记在应用于育种筛选时，可以根据制定的育种目标选择MSTN基因中不含BbvI酶切位点的个体（AA型）或含有BbvI酶切位点的纯合型样本（GG型）。
附图说明
图1是MSTN基因BbvI酶切产物图，Marker为GM331。
图2是边鸡腿肌10×40倍组织切片。
图3是边鸡腿肌10×10倍组织切片。
具体实施方式
实施例1
1.试验材料
第7世代边鸡核心群母鸡血样299份、公鸡血样81份，所建立的第一世代AA和GG系母鸡各30只均采自山西省农科院畜牧兽医研究所。用肝素钠作为抗凝剂，从第7世代边鸡核心群母鸡静脉各采集血样0.5mL，采用常规苯酚-氯仿法抽提基因组DNA，测定DNA的浓度后备用。
2.引物设计和PCR扩增
2.1酶切引物的设计
根据GenBank中鸡MSTN基因序列（GenBank登录号为AF346599）针对外显子1的BbvI位点设计1对引物，扩增产物大小为162bp。引物序列如下：
P1：F:5′-GCATTAGCAGGGACGTTAT-3′（SEQ ID NO：1）
R:5′-ACTCCGTAGGCATTGTGAT-3′（SEQ ID NO：2）
2.2PCR扩增
PCR扩增反应为25μL体系，包括：上、下游引物（10μmol/L）2μL；dNTPs（2mmol/L）2.5μL；Taq DNA聚合酶（5U/μL）0.2μL；DNA模板（50ng/μL）2μL；Mg2+（25mmol/L）1.5μL；10×PCR缓冲液2.5μL；超纯水14.3μL。PCR扩增反应程序：94℃变性6min；94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸30s，进行30个循环；最后72℃延伸10min；10℃保存。
PCR反应完成后，用10%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增结果，硝酸银染色，UV凝胶成像系统进行凝胶成像。
2.3PCR-RFLP检测及选育
PCR产物用BbvI酶切，以检测多态性。酶切反应总体积为20μL，超纯水16.5μL，BbvI酶(10u/μL)0.5μL，10×buffer2μL，37°C酶切2h，酶切产物用交联度为（Acr:Bis）29:1的10%的非变性聚丙烯酰胺凝胶检测，200V电泳5h，硝酸银染色。酶切图谱如图1所示，显示3种基因型，仅有162bp目的片段的样本不含BbvI酶切位点，命名为AA型；仅有127bp的为含有BbvI酶切位点的纯合型，命名为GG型；同时含有162bp和127bp的为杂合型样本，命名为GA型。当编码区234bp处为G时，BbvI酶切产生127bp和35bp的片段；当C.234bp处为A时，无BbvI酶切位点。
根据边鸡公母鸡MSTN基因BbvI酶切图谱中条带的数量和大小辨别扩增产物中是否含有BbvI酶切位点。根据基因型判定结果分别选留AA型公母鸡以及GG型公母鸡作为种鸡。人工受精后采集种蛋，建立AA和GG系边鸡群体。
2.4边鸡AA和GG系母鸡肌纤维特性的比较
在16周龄时，分别屠宰30只建立的AA和GG系母鸡，制作腿肌的石蜡切片。通过万能视屏成像系统装置，在10×40倍下随机选取5个视野拍摄，用Image-Pro Plus软件统计肌纤维的数目，计算肌纤维的密度(表1)。结果表明，AA和GG系边鸡腿肌的肌纤维密度分别为221.19根/mm2和292.27根/mm2，AA型边鸡肌纤维密度极显著的低于GG系(P<0.01)。
通过万能视屏成像系统装置，在10×10倍下拍摄一个清晰的视野，用Image-Pro Plus软件随机选取50根肌纤维进行测定，分析肌纤维的直径和横截面积（表1）。结果表明，AA型边鸡腿肌的肌纤维直径为66.72μm，横截面积为3897.70μmm2，GG型边鸡腿肌的肌纤维直径为58.82μm，横截面积为3107.58μmm2；AA型边鸡的肌纤维直径和横截面积都显著的高于GG型（P<0.05）。
在育种时可以根据制定的育种目标选择MSTN基因中不含BbvI酶切位点的个体（AA型）或含有BbvI酶切位点的纯合型样本（GG型）。MSTN基因BbvI酶切位点可作为边鸡肌纤维特性的分子遗传标记用于辅助选择。
表1边鸡母鸡AA和GG系肌纤维特性的比较
肌纤维特性 AA系（n=30） GG系（n=28）
肌纤维密度(根/mm2) 221.19±16.51B 292.27±17.09A
肌纤维直径(μm) 66.72±2.33a 58.82±2.41b
肌纤维面积(μmm2) 3897.70±267.69a 3107.58±276.77b
注：同行数据不同大写字母表示差异极显著（P<0.01），不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。
 SEQUENCE LISTING
<110>扬州大学
<120>边鸡肌纤维特性的分子遗传标记及应用
<130>
<160>2
<170>PatentIn version3.3
<210>1
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
gcattagcag ggacgttat19
<210>2
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
actccgtagg cattgtgat19

Claims (2)

1.肌肉生长抑制素基因MSTN作为边鸡肌纤维特性的分子遗传标记的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，提取待测样本的基因组DNA，经序列如SEQ ID NO：1-2所示的特异性引物扩增得到162bp的目的片段，目的片段经限制性内切酶BbvI酶切，凝胶电泳后用银染显色，得到DNA的酶切图谱，根据图谱中条带的数量和大小对待测样本的肌纤维特性进行判断并选留符合育种目的的个体；其中仅有162bp条带的为肌纤维密度低、肌纤维直径长和肌纤维面积大的纯合型样本，仅有127bp条带的为肌纤维密度高、肌纤维直径短和肌纤维面积小的纯合型样本。
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