CN103800712B - 一种用于预防和/或治疗脑缺血再灌注损伤的中药组合物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于预防和/或治疗脑缺血再灌注损伤的中药组合物及其制备方法。该中药组合物由下述质量份的中药材制成：益母草5‑30份、水蛭1‑6份、三七2‑10份、川牛膝3‑20份、白茅根4‑30份、石菖蒲4‑20份、连翘3‑15份和大黄1‑6份。制备方法包括下述步骤：1)取1/3‑2/3质量的水蛭粉碎成细粉；2)三七粉碎成粗粉，用60％‑95％的乙醇水溶液回流提取，收集提取液及三七药渣，将提取液浓缩成清膏；3)将三七药渣、剩余量的水蛭以及益母草等六味中药材合并，加水煎煮，收集煎液，滤过，将滤液与清膏合并，浓缩成稠膏，烘干，粉碎成细粉，加入水蛭细粉，混匀，即得所述中药组合物。

Description

一种用于预防和/或治疗脑缺血再灌注损伤的中药组合物及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种用于预防和/或治疗脑缺血再灌注损伤的中药组合物及其制备方法。

背景技术

缺血性脑血管疾病由于发病率、致残率及死亡率高而严重威胁人类健康，积极有效的预防和治疗措施的研究具有深远的社会意义。诸如缺血性脑卒中等缺血性脑血管疾病发病率居高不下的病因，以大脑中动脉闭塞造成急性脑缺血为主。目前临床上对急性脑梗塞的治疗仍以西药溶栓为主，以恢复脑血流，减轻脑组织缺血。然而溶栓后产生的脑缺血再灌注损伤，一直是学者们关注的问题。

脑缺血再灌注损伤(Cerebral ischemia reperfusion injury)是指缺血脑组织在恢复血液灌注后，脑组织损伤进一步加重，是引发多种脑血管疾病的重要病理生理机制。其发生机制尚未彻底阐明，目前认为可能与脑组织能量代谢障碍、自由基损伤、钙超载、兴奋性氨基酸(EEA)的过度释放、脑细胞凋亡、炎症反应等有关。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于预防和/或治疗脑缺血再灌注损伤的中药组合物及其制备方法。

本发明所提供的中药组合物由下述质量份的中药材制成：益母草5-30份、水蛭1-6份、三七2-10份、川牛膝3-20份、白茅根4-30份、石菖蒲4-20份、连翘3-15份和大黄1-6份。

所述中药组合物可进一步由如下中药材制成：益母草6-20份、水蛭2-5份、三七2-8份、川牛膝3-16份、白茅根5-20份、石菖蒲4-15份、连翘3-12份和大黄2-5份。

各中药材最优选的质量份为：益母草10份、水蛭2份、三七2份、川牛膝3份、白茅根10份、石菖蒲4份、连翘3份和大黄2份。

本发明的中药组合物是通过将上述配方组成的中药原料经过提取或其他方式加工制成的。随后，以该中药组合物为原料，需要时加入药学上可接受的载体，按照制剂学的常规技术制成各种剂型。所述中药组合物可以通过分别提取中药原料得到，也可以通过共同提取中药原料得到，也可以通过其他方式得到，如：通过粉碎、压榨、研磨、过筛、渗漉、萃取、水提、醇提等方法得到。这些中药组合物可以是浸膏形式的物质，可以是干浸膏也可以是流浸膏，根据制剂的不同需要决定制成不同的浓度。

本发明所提供的中药组合物具体可按照包括下述步骤的方法制备：取处方量的益 母草、水蛭、三七、川牛膝、白茅根、石菖蒲、连翘和大黄；

1)取处方量1/3-2/3质量的水蛭粉碎成细粉；

2)三七粉碎成粗粉，用体积分数为60％-95％的乙醇水溶液回流提取，分别收集提取液及提取后的三七药渣，将所述提取液浓缩成50℃-65℃测定相对密度为

1.00-1.50的清膏；

3)将所述三七药渣、剩余量的水蛭以及益母草等六味中药材合并，加水煎煮，收集煎液，滤过，将滤液与步骤2)中所述清膏合并，浓缩成50℃-65℃测定相对密度为1.00-1.50的稠膏，烘干，粉碎成细粉，加入步骤1)得到的水蛭细粉，混匀，即得所述中药组合物。

其中，步骤2)中所述回流提取可进行2-3次，每次提取的时间可为1-3小时，优选2-3小时；每次提取时，提取溶剂的加入质量是所述药材质量的3-6倍。

步骤2)中提取溶剂优选体积分数为70％-85％的乙醇水溶液，最优选为体积分数为75％的乙醇水溶液。

步骤2)中所述提取液优选浓缩成50℃-65℃测定相对密度为1.20-1.40的清膏，更有选为相对密度为1.20-1.30的清膏。

步骤3)中所述煎煮可进行2-3次，每次煎煮的时间可为1-3小时，优选2-3小时；每次煎煮时，水的加入质量是所述药材总质量的6-10倍。

步骤3)中将所述滤液与步骤2)中所述清膏合并，优选浓缩成50℃-65℃测定相对密度为1.20-1.40的清膏，更优选浓缩成相对密度为1.20-1.30的清膏。

上述中药材均符合中国药典2010年版一部各药材项下的有关规定。

本发明的再一个目的是提供上述中药组合物的应用。

本发明所提供的中药组合物的应用是其在制备预防和/或治疗脑缺血再灌注损伤的药物中的应用。

所述中药组合物更具体的可用于制备下述药物：1)降低脑缺血再灌注损伤的脑梗死体积的药物；2)抑制炎症细胞因子(如TNF-α、IL-1β)的表达的药物；3)抑制黏附分子(如ICAM-1)的表达的药物。

以上述中药组合物为活性成分制成的预防和/或治疗脑缺血再灌注损伤的药物也属于本发明的保护范围。

上述药物，由本发明的中药组合物和药学上可接受的载体组成，其中，中药组合物的质量百分含量为0.1-99.9％。

该药物以单位剂量形式存在，所述单位剂量形式是指制剂的单位，如片剂的每片，胶囊的每粒胶囊，口服液的每瓶，颗粒剂每袋等。

本发明的药物，其口服给药的制剂可含有常用的赋形剂，诸如粘合剂、填充剂、稀释剂、压片剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、调味剂和湿润剂，必要时可对片剂进行包衣。

适用的填充剂包括纤维素、甘露糖醇、乳糖和其它类似的填充剂。适宜的崩解剂包括淀粉、聚乙烯吡咯烷酮和淀粉衍生物，例如羟基乙酸淀粉钠。适宜的润滑剂包括，例如硬脂酸镁。适宜的药物可接受的湿润剂包括十二烷基硫酸钠。

可通过混合，填充，压片等常用的方法制备固体口服组合物。进行反复混合可使活性物质分布在整个使用大量填充剂的那些组合物中。

口服液体制剂的形式例如可以是水性或油性悬浮液、溶液、乳剂、糖浆剂，或者可以是一种在使用前可用水或其它适宜的载体复配的干燥产品。这种液体制剂可含有常规的添加剂，诸如悬浮剂，例如山梨醇、糖浆、甲基纤维素、明胶、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、硬脂酸铝凝胶或氢化食用脂肪，乳化剂，例如卵磷脂、脱水山梨醇一油酸酯或阿拉伯胶；非水性载体(它们可以包括食用油)，例如杏仁油、分馏椰子油、诸如甘油的酯的油性酯、丙二醇或乙醇；如果需要，可含有常规的香味剂或着色剂。

本发明的中药组合物，在制备成药剂时可选择性的加入适合的药学上可接受的载体，所述药学上可接受的载体选自：甘露醇、麦芽糖、葡萄糖、果糖、淀粉、蔗糖、乳糖、纤维素及其衍生物、碳酸钙、碳酸氢钙、表面活性剂、聚乙二醇、环糊精、β-环糊精、磷脂类材料、高岭土、滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁等。

所述药物可为任意剂型。所述剂型为口服剂型，包括但不限于片剂、胶囊剂、口服液、颗粒剂、丸剂、散剂或滴丸剂。

本发明中药组合物具有以下功能主治：活血逐瘀，利水通腑。适用于缺血性中风急性期及恢复期，属痰瘀痹阻证，症见半身不遂、口舌歪斜、言语蹇涩或不语，偏身麻木，腹胀便干便秘，头晕目眩，痰多而粘，舌质暗红、苔黄腻、脉滑数。

附图说明

下面通过具体实施例对本发明进行说明但本发明并不局限于此。

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。下述实施例中所用药材均符合中国药典2010 年版一部各药材项下的有关规定。

实施例1、制备中药组合物

具体实施方式

处方组成：

益母草500克水蛭100克三七100克川牛膝150克

白茅根500克石菖蒲200克连翘150克大黄100克。

以上八味，取1/3量水蛭粉碎成细粉；三七粉碎成粗粉，加入体积分数为75％乙醇水溶液回流提取2次(每次提取时提取剂的加入量是三七质量的3倍)，每次提取2小时，合并提取液，回收乙醇，浓缩成50℃-65℃时相对密度为1.30的清膏；三七药渣与剩余水蛭及益母草等六味药材加水煎煮2次(每次煎煮加水量为药材总量的10倍)，每次煎煮2小时，合并煎液，滤过，滤液与上述三七醇提清膏合并，浓缩至50℃-65℃时相对密度为1.30的稠膏，烘干，粉碎成细粉，加入剩余1/3量水蛭细粉，混匀，即得中药组合物。

以所得中药组合物为活性物质与淀粉混和制粒，用体积分数95％的乙醇作润湿剂，加入适量硬脂酸镁，压片，得到片剂。

实施例2、制备中药组合物

益母草500克水蛭100克三七200克川牛膝300克

白茅根400克石菖蒲400克连翘300克大黄100克。

以上八味，取1/3量水蛭粉碎成细粉；三七粉碎成粗粉，加入体积分数为75％乙醇水溶液回流提取2次(每次提取时提取剂的加入量是三七质量的3倍)，每次提取1小时，合并提取液，回收乙醇，浓缩成50℃-65℃时相对密度为1.00的清膏；药渣与剩余水蛭及益母草等六味加水煎煮提取2次(每次煎煮加水量为药材总量的6倍)，每次1小时，合并煎液，滤过，滤液与上述醇提清膏合并，浓缩至50℃-65℃时相对密度为1.30的稠膏，烘干，粉碎成细粉，加入水蛭细粉，混匀，即得中药组合物。

以所得中药组合物为活性物质，用常规工艺制成胶囊。

实施例3、制备中药组合物

益母草300克水蛭60克三七100克川牛膝200克

白茅根300克石菖蒲200克连翘150克大黄60克。

以上八味，取1/2量水蛭粉碎成细粉；三七粉碎成粗粉，加入体积分数为75％乙醇水溶液回流提取2次(每次提取时提取剂的加入量是三七质量的5倍)，每次提取1.5小时，合并提取液，回收乙醇，浓缩成50℃-65℃时相对密度为1.30的清膏；药渣与剩余水蛭及益母草等六味加水煎煮提取2次(每次煎煮加水量为药材总量的10倍)，每次2小时，合并煎液，滤过，滤液与上述醇提清膏合并，浓缩至50℃-65℃时相对密度为1.30的稠膏，烘干，粉碎成细粉，加入水蛭细粉，混匀，即得中药组合物。以所得中药组合物为活性物质，用常规工艺制成胶囊。

实施例4、制备中药组合物

益母草50克水蛭10克三七20克川牛膝30克

白茅根300克石菖蒲200克连翘150克大黄60克。

以上八味，取1/2量水蛭粉碎成细粉；三七粉碎成粗粉，加入体积分数为75％乙醇水溶液回流提取2次(每次提取时提取剂的加入量是三七质量的6倍)，每次提取2小时，合并提取液，回收乙醇，浓缩成50℃-65℃时相对密度为1.50的清膏；药渣与剩余水蛭及益母草等六味加水煎煮提取2次(每次煎煮加水量为药材总量的10倍)，每次3小时，合并煎液，滤过，滤液与上述醇提清膏合并，浓缩至50℃-65℃时相对密度为1.25的稠膏，烘干，粉碎成细粉，加入水蛭细粉，混匀，即得中药组合物。以所得中药组合物为活性物质，用常规工艺制成颗粒剂。

实施例5、制备中药组合物

益母草300克水蛭60克三七100克川牛膝200克

白茅根40克石菖蒲40克连翘30克大黄10克。

以上八味，取1/3量水蛭粉碎成细粉；三七粉碎成粗粉，加入体积分数为60％乙醇水溶液回流提取2次(每次提取时提取剂的加入量是三七质量的3倍)，每次提取1小时，合并提取液，回收乙醇，浓缩成50℃-65℃时相对密度为1.00的清膏；药渣与剩余水蛭及益母草等六味加水煎煮提取2次(每次煎煮加水量为药材总量的8倍)，每次1小时，合并煎液，滤过，滤液与上述醇提清膏合并，浓缩至50℃-65℃时相对密度为1.00的稠膏，烘干，粉碎成细粉，加入水蛭细粉，混匀，即得中药组合物。以所得中药组合物为活性物质，用常规工艺制成颗粒剂。

实施例6、制备中药组合物

益母草600克水蛭200克三七200克川牛膝300克

白茅根500克石菖蒲400克连翘300克大黄200克。

以上八味，取1/3量水蛭粉碎成细粉；三七粉碎成粗粉，加入体积分数为95％乙醇水溶液回流提取2次(每次提取时提取剂的加入量是三七质量的3倍)，每次提取1.5小时，合并提取液，回收乙醇，浓缩成50℃-65℃时相对密度为1.50的清膏；药渣与剩余水蛭及益母草等六味加水煎煮提取2次(每次煎煮加水量为药材总量的8倍)，每次1.5小时，合并煎液，滤过，滤液与上述醇提清膏合并，浓缩至50℃-65℃时相对密度为1.50的稠膏，烘干，粉碎成细粉，加入水蛭细粉，混匀，即得中药组合物。以所得中药组合物为活性物质，用常规工艺制成颗粒剂。

实施例7、制备中药组合物

益母草200克水蛭50克三七80克川牛膝160克

白茅根200克石菖蒲150克连翘120克大黄50克。

以上八味，取1/2量水蛭粉碎成细粉；三七粉碎成粗粉，加入体积分数为90％乙醇水溶液回流提取3次(每次提取时提取剂的加入量是三七质量的3倍)，每次提取2小时，合并提取液，回收乙醇，浓缩成50℃-65℃时相对密度为1.40的清膏；药渣与剩余水蛭及益母草等六味加水煎煮提取3次(每次煎煮加水量为药材总量的10倍)，每次2小时，合并煎液，滤过，滤液与上述醇提清膏合并，浓缩至50℃-65℃时相对密度为1.40的稠膏，烘干，粉碎成细粉，加入水蛭细粉，混匀，即得中药组合物。以所得中药组合物为活性物质，用常规工艺制成颗粒剂。

实施例8、制备中药组合物

益母草60克水蛭20克三七20克川牛膝30克

白茅根200克石菖蒲150克连翘120克大黄50克。

以上八味，取1/2量水蛭粉碎成细粉；三七粉碎成粗粉，加入体积分数为70％乙醇水溶液回流提取2次(每次提取时提取剂的加入量是三七质量的6倍)，每次提取2小时，合并提取液，回收乙醇，浓缩成50℃-65℃时相对密度为1.20的清膏；药渣与剩余水蛭及益母草等六味加水煎煮提取2次(每次煎煮加水量为药材总量的6倍)，每次1小时，合并煎液，滤过，滤液与上述醇提清膏合并，浓缩至50℃-65℃时相对密度为1.20的稠膏，烘干，粉碎成细粉，加入水蛭细粉，混匀，即得中药组合物。以所得中药组合物为活性物质，用常规工艺制成颗粒剂。

实施例9、制备中药组合物

益母草70克水蛭25克三七30克川牛膝40克

白茅根60克石菖蒲50克连翘40克大黄25克。

以上八味，取1/3量水蛭粉碎成细粉；三七粉碎成粗粉，加入体积分数为80％乙醇水溶液回流提取3次(每次提取时提取剂的加入量是三七质量的3倍)，每次提取2.5小时，合并提取液，回收乙醇，浓缩成50℃-65℃时相对密度为1.35的清膏；药渣与剩余水蛭及益母草等六味加水煎煮提取3次(每次煎煮加水量为药材总量的6倍)，每次2.5小时，合并煎液，滤过，滤液与上述醇提清膏合并，浓缩至50℃-65℃时相对密度为1.35的稠膏，烘干，粉碎成细粉，加入水蛭细粉，混匀，即得中药组合物。以所得中药组合物为活性物质，用常规工艺制成颗粒剂。

实施例10、制备中药组合物

益母草180克水蛭40克三七70克川牛膝150克

白茅根150克石菖蒲80克连翘100克大黄40克。

以上八味，取1/2量水蛭粉碎成细粉；三七粉碎成粗粉，加入体积分数为75％乙醇水溶液回流提取3次(每次提取时提取剂的加入量是三七质量的3倍)，每次提取2小时，合并提取液，回收乙醇，浓缩成50℃-65℃时相对密度为1.25的清膏；药渣与剩余水蛭及益母草等六味加水煎煮提取3次(每次煎煮加水量为药材总量的8倍)，每次2小时，合并煎液，滤过，滤液与上述醇提清膏合并，浓缩至50℃-65℃时相对密度为1.25的稠膏，烘干，粉碎成细粉，加入水蛭细粉，混匀，即得中药组合物。以所得中药组合物为活性物质，用常规工艺制成颗粒剂。

实施例11、药效学试验

动物实验1：对脑缺血再灌注损伤大鼠神经功能影响的实验研究

试验目的：脑缺血再灌注伤后常遗留有神经功能缺失、肢体偏瘫，并造成大脑半球的大面积梗死，往往给患者的工作、学习及生活带来严重干扰，甚至影响其生活质量。本实验参照Zea Longa等改良线栓法建立大鼠局灶脑缺血再灌注损伤(MCAO)模型，脑缺血2小时后再灌注，于大鼠复苏后进行神经功能评分，并于再灌注1d、7d和14d后，分别进行大鼠脑梗死灶体积百分比的计算，以评价本发明药物对大鼠脑缺血再灌注损伤后神经功能及梗死灶恢复的影响。

受试药物：

1、本发明药物：按实施例1制备，每g胶囊相当于5g生药，临用时用水稀释配制成3、6、12％的浓度。

【功能与主治】活血逐瘀，利水通腑。适用于缺血性中风急性期及恢复期，属痰瘀痹阻证，症见半身不遂、口舌歪斜、言语蹇涩或不语，偏身麻木，便干便秘，头晕目眩，痰多而粘，舌质暗红、苔黄腻、脉滑数。

【用法与用量】3粒/次，3次/日。

【规格】0.5g/粒。

2、金纳多，由德国威玛舒培博士药厂生产，批准文号：H20040335，17.5mg/5ml。

【化学成分】银杏叶提取物。

【功能与主治】主要用于脑部、周边等血液循环障碍1.急慢性脑机能不全及其后遗症：中风、注意力不集中、记忆力衰退、痴呆。2.耳部血流及神经障碍：耳鸣、眩晕、听力减退、耳迷路综合征。3.眼部血流及神经障碍：糖尿病引起的视网膜病变及神经障碍、老年黄斑变性、视力模糊、慢性青光眼。4.末梢循环障碍：各种动脉闭塞症、间 歇性跛行症、手脚麻痹冰冷、四肢酸痛。

【药理作用】

自由基的清除作用清除机体内过多的自由基，抑制细胞膜的脂质发生过氧化反应，从而保护细胞膜，防止自由基对机体造成的一系列伤害。对循环系统的调整作用通过刺激儿茶酚胺的释放和抑制降解，以及通过刺激前列环素和内皮舒张因子的生成而产生动脉舒张作用，共同保护动脉和静脉血管的张力。血流动力学改善作用具有降低全血粘稠度，增进红细胞和白细胞的可塑性，改善血液循环的作用，组织保护作用增进缺血组织对氧及葡萄糖的供应量，增加某些神经递质受体的数量，如毒蕈碱样、去甲肾上腺素以及五羟色胺受体。

【用法与用量】每日1～2次，每次10～20ml，加人生理盐水葡萄糖或低分子右旋糖酥输液中静脉滴注注：通常开始用注射液，病情改善后改为片剂或滴剂，口服给药。

【规格】5ml：17.5mg/支。

实验动物：雄性SD大鼠，体重(260±20)g，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供，动物许可证号：SCXK-(军)2007-004。

主要试剂：2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)，由上海灵锦精细化工有限公司提供。

试验方法、试验主要步骤、给药后动物反应、剂量设置、给药方法、试验对照：

1、分组及给药：动物在实验室正常饲养以适应4天后将其随机分为假手术组、模型组、本发明药物三个剂量组以及金纳多组，各组又分为1d、7d和14d组，每组6只，共108只。分别灌胃给药(本发明药物组0.3、0.6、1.2g/kg，金纳多组18.7mg/kg)，给药体积1ml/100g，假手术组和模型组给以1ml/100g的生理盐水。连续给药3d，每日2次，于第4d给药1h造模，术后6h继续给药1次，以后每天坚持给药。大鼠术前12h禁食但不禁水，术后继续常规饲养。

2、脑缺血再灌注模型制备采用改良的Zea Longa线拴法建立大鼠局灶脑缺血再灌注损伤(MCAO)模型。动物以10％水合氯醛(0.40mL·100g-1，ip)麻醉后，将其仰卧位固定于手术台，颈部备皮，消毒皮肤，于颈部正中纵向行约2cm切口，钝性分离皮下筋膜及肌肉组织，充分暴露左侧颈总动脉。分离颈总动脉(Common Carotid Artery，CCA)、颈外动脉(External Carotid Artery，ECA)和颈内动脉(Internal Carotid Artery，ICA)后分别穿以长约10cm的缝线，结扎颈总动脉、颈外动脉，用动脉夹夹闭颈内动脉，于颈内动脉分叉处切一小口，向颈内动脉插入栓线，松开动脉夹，继续进线，当感到有轻微阻力(此时进线距切口的长度约为19～21mm)，表明尼龙线已插至Willie’s环大脑前动脉起始处阻塞了大脑中动脉主干的起始部，颈内动脉打以单结。缺血2h后轻轻拔出栓线，缝合组织和皮肤，即造成缺血再灌注模型。假手术组不进线，其余操作同模型组。

3、检测指标

(1)神经功能评分大鼠脑缺血再灌注22h后，采用Zea Longa评分法[1]，在大鼠清醒后观察并记录神经功能症状：无神经病学征象为0分；提尾时病灶对侧前肢不能完全伸直为1分；向瘫痪侧旋转征象为2分；向病灶对侧跌倒为3分；无自发活动及意识障碍者为4分。

(2)TTC染色计算梗死体积占整脑体积的百分值(V％)大鼠脑缺血再灌注22h后，每组取6只大鼠，麻醉后断头处死，完整取出大脑，去除嗅球、小脑和低位脑干，于-20℃冰箱中速冻4～5分钟，沿冠状从额极向后切5片(每片厚约2mm)。将脑片放入2％TTC磷酸盐缓冲溶液中37℃避光水浴30min染色(染色后正常脑组织呈红色，缺血梗死区呈白色)。取出脑片平铺于载玻片上数码相机摄像。利用图像处理系统Image-pro Plus软件测定每个脑片的梗死面积及该脑片面积，按公式：V％＝(∑s_id/∑s_jd)×100计算梗死体积占整脑体积的百分值(其中：s_i和s_j分别表各个脑片梗死面积和该脑片面积，d表脑片厚度，在此d＝2)，将此计算值作为统计参数。

4、统计学处理

各组计数结果以均数±标准差表示，两组间差异采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，以SPSS10.0软件处理，P＜0.05为差异有显著性意义。

剂量设计、阳性对照药选择以及实验指标设计依据：

1、阳性对照药选择：金纳多主要用于脑部、周边等血液循环障碍，于本品适应症基本一致，因此选其作为对照。

2、剂量设计：

本品0.5g/粒，3粒/次，3次/日，日服用量为4.5g，以60kg体重计0.075g/kg。药效学实验剂量为0.3、0.6、1.2g/kg，分别相当于临床剂量的4、8、16倍，8倍组剂量符合一般中药制剂大鼠与人之间等效剂量大致范围的换算常规，另外按等比设置分别在其上下各设一个组作为高、低剂量组。

金纳多临床用量为每日1～2次，每次10～20ml，其规格为5ml：17.5mg/支，即每日用量上限为40ml，140.4mg，人以60kg体重计算，其剂量为2.34mg/kg，试验剂量采用与本发明药物中剂量组相同的倍数(8倍)，即为2.34×8＝18.72mg/kg。

3、实验指标设计：

采用Zea Longa评分法对大鼠脑缺血再灌注清醒后神经功能症状进行评价，并于再灌注一定时间后，进行大鼠脑梗死灶体积百分比的计算，是评价药物对大鼠脑缺血再灌注损伤后神经功能及梗死灶恢复影响的公认指标，故选择此指标。

试验结果：

1.本发明药物对脑缺血再灌注损伤大鼠神经功能评分的影响

除假手术组外，其余各组大鼠在脑缺血再灌注损伤术后均出现不同程度的行为异常，主要表现为右侧肢体屈曲提尾行走时向右侧转圈或者向右侧倾倒等。本发明药物各组、金纳多组同模型组比较，行为学异常的改善有显著意义，见表1。

表1脑缺血再灌注损伤大鼠的神经功能评分

注：与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01；与假手术组比较^△P＜0.05；^△△P＜0.01；与金纳多组比较^□P＜0.05，^□□P＜0.01

2本发明药物对脑缺血再灌注损伤大鼠脑梗死体积百分比的影响

脑缺血再灌注术后，除假手术组外，其余各组大鼠均发生了不同程度的脑缺血梗死。与模型组比，本发明药物各组、金纳多组脑梗死体积百分比显著下降，并随治疗时间的延长，改善效果更为显著，见表2。

表2脑缺血再灌注损伤大鼠脑梗死体积(n＝6，)

注：与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01；与假手术组比较^△P＜0.05；^△△P＜0.01；与金纳多组比较^□P＜0.05，^□□P＜0.01

试验结论：

本实验结果显示，本发明药物能明显降低脑缺血再灌注损伤大鼠的神经功能评分，明显降低缺血再灌注损伤大鼠的脑梗死体积，说明本发明药物能显著改善缺血再灌注损伤大鼠的肢体运动功能症状，对脑缺血再灌注后的脑组织损伤有明显的保护作用。本发明药物对脑缺血再灌注损伤后的改善作用在实验剂量范围内随治疗时间的延长，症状减轻也愈发明显，且与剂量有较明显的相关性。

动物实验2：本发明药物对大鼠脑缺血再灌注损伤后炎证反应的影响

试验目的：大量动物实验表明，脑缺血再灌注后，在缺血损伤部位有大量细胞因子表达及炎细胞浸润，细胞因子的过度表达可继发性加重脑组织损伤。肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-1β(IL-1β)是两个重要的炎性细胞因子，在脑组织受到脑缺血再灌注损伤时，可由神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞产生。TNF-α和IL-1β不仅可以直接促进中性白细胞(多型核白细胞)向缺血区聚集，介导炎症反应，引起血液流变学改变、脑水肿等，最终导致神经元死亡，故干预炎性细胞因子的表达可减轻脑缺血再灌注损伤。本实验旨在从炎症角度，通过观察本发明药物对脑缺血再灌注损伤大鼠血浆中TNF-α、IL-1β含量的影响，以评价本发明药物对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用及其机制。

受试药物：同动物实验1。

实验动物：同动物实验1。

主要试剂及仪器：

碘[I¹²⁵]肿瘤坏死因子-α放射免疫分析盒，碘[I¹²⁵]白细胞介素-1β放射免疫分析盒，均由解放军总医院科技开发中心放免所提供。

800-1台式电动离心机，由江苏省金坛市医疗仪器厂生产；

Sn-695B型免疫计数器，厂家为上海核所日环光电仪器有限公司。

试验方法、试验主要步骤、给药后动物反应、剂量设置、给药方法、试验对照：

1、分组及给药同动物实验1。

2、脑缺血再灌注模型制备同动物实验1。

3、血浆中TNF-α、IL-1β含量的测定各组大鼠在脑缺血再灌注结束后，将其麻醉，开胸暴露心脏，右心房取血3ml于肝素抗凝离心管中，混匀，4℃下3500r·min^-1离心15min分离血浆，放于-20℃冰箱贮存待测。采用放射免疫方法测定血浆中TNF-α、IL-1β的含量。

4、统计学处理同动物实验1。

剂量设计、阳性对照药选择以及实验指标设计依据：

1、阳性对照药选择：同动物实验1。

2、剂量设计：同动物实验1。

3、实验指标设计：干预炎性细胞因子的表达可减轻脑缺血再灌注损伤，本实验旨在从炎症角度，通过观察本发明药物对脑缺血再灌注损伤大鼠血浆中TNF-α、IL-1β含量的影响，以评价本发明药物对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用及其机制。

试验结果：

1、本发明药物对脑缺血再灌注损伤大鼠血浆中TNF-α含量的影响

脑缺血再灌注结束后，各组大鼠血浆TNF-α含量在各时间段较假手术组均显著升高，随再灌注时间推移均有下降趋势，但除本发明药物治疗14d组外，与假手术组相比均尚存在显著性差异。与模型组比较，本发明药物治疗各组(除7d组外)大鼠血浆TNF-α含量均显著下降，差异有显著性，有一定的量效关系，金纳多治疗各组大鼠血浆TNF-α含量均有所下降，但差异无显著性；与金纳多治疗组相比，本发明药物治疗组TNF-α表达更低，但该两组间的差异无显著性，见表5。

表5脑缺血再灌注损伤大鼠血浆中TNF-α的含量(n＝6，)

注：与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01；与假手术组比较^△P＜0.05；^△△P＜0.01；与金纳多组比较^□P＜0.05，^□□P＜0.01

2、本发明药物对脑缺血再灌注损伤大鼠血浆中IL-1β含量的影响

脑缺血再灌注结束后，同假手术组比较，各组大鼠血浆IL-1β含量在各时间段均升高，并随再灌注时间推移均有下降趋，其中模型组1d和7d组差异较为显著(P＜0.01)，模型组14d组、本发明药物治疗1d组及金纳多治疗1d组亦有显著性差异(P＜0.05)。同模型组比较，本发明药物治疗7d和14d组及金纳多治疗7d和14d组血浆IL-1β含量差异极为显著(P＜0.01)，本发明药物治疗1d的大剂量组亦有显著性差异(P＜0.05)，也有较规律的量效关系，见表6。

表6脑缺血再灌注损伤大鼠血浆中IL-1β的含量(n＝6，)

注：与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01；与假手术组比较^△P＜0.05；^△△P＜0.01；与金纳多组比较^□P＜0.05，^□□P＜0.01

试验结论：

本实验结果显示，脑缺血再灌注损伤后，大鼠血清中TNF-α、IL-1β的含量均迅速升高，并在7d内维持较高水平，14d后有所下降。通过本发明药物治疗后，大鼠血浆中TNF-α、IL-1β的水平均显著下降，并随着治疗时间的延长，治疗效果和量效关系越加显著。该结果表明，本发明药物可通过抑制炎症细胞因子的表达，减轻脑缺血再灌注损伤后的炎症反应，改善脑缺血，保护脑组织损伤。

动物实验3：本发明药物对大鼠脑缺血再灌注损伤后ICAM-1表达的影响

试验目的：脑缺血再灌注后，细胞间粘附分子-1(ICAM-1)的持续表达，可使白细胞向内皮细胞迁移和粘附，并浸润到脑组织，加重脑缺血再灌注损伤，故干预粘附分子的表达，可改变血液流变学，改善缺血部位的微循环障碍，从而减轻脑缺血再灌注损伤。本实验通过观察本发明药物对脑缺血再灌注损伤大鼠血浆中ICAM-1表达的影响，以评价其对脑缺血再灌注损伤的保护作用及其机制。

受试药物：同前。

实验动物：同前。

主要试剂及仪器：

大鼠细胞间粘附因子(sICAM-1)ELISA试剂盒，由解放军总医院科技开发中心放免所提供。

800-1台式电动离心机，由江苏省金坛市医疗仪器厂生产；TW8恒温水浴，由德国优莱博公司生产；Wellscan MK3全自动酶标仪，厂家为芬兰Wellscan MK3酶标仪器公司。

试验方法、试验主要步骤、给药后动物反应、剂量设置、给药方法、试验对照：

1、分组及给药同前。

2、脑缺血再灌注模型制备同前。

3、血浆中ICAM-1含量的测定各组大鼠在脑缺血再灌注结束后，将其麻醉，开胸暴露心脏，右心房取血3ml于肝素抗凝离心管中，混匀，4℃下3500r·min^-1离心15min分离血浆，放于-20℃冰箱贮存待测。采用酶联免疫方法(ELISA)测定血浆中ICAM-1的含量。

4统计学处理同前。

剂量设计、阳性对照药选择以及实验指标设计依据：

1、阳性对照药选择：同前。

2、剂量设计：同前。

3、实验指标设计：脑缺血再灌注后，细胞间粘附分子-1(ICAM-1)持续表达，干预粘附分子的表达，可改变血液流变学，改善缺血部位的微循环障碍，从而减轻脑缺血再灌注损伤。故选择观察该指标以评价本发明药物对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用及其机制。

试验结果：

脑缺血再灌注结束后，同假手术组比较，各组大鼠血浆ICAM-1含量在各时间段均显著升高，其中模型组各组及本发明药物治疗1d和7d组差异较为显著(P＜0.01)。同模型组比较，本发明药物治疗1d和7d组大鼠血浆ICAM-1含量显著下降(P＜0.05)，本发明药物治疗14d组及金纳多治疗各组组血浆IL-1B含量下降更为显著(P＜0.01)，均有较显著的量效关系；但本发明药物治疗各组ICAM-1表达均高于金纳多治疗各组，除14d组外，尚存在显著差异(P＜0.05)，见表7。

表7脑缺血再灌注损伤大鼠血浆中ICAM-1的含量(n＝6，)

注：与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01；与假手术组比较^△P＜0.05；^△△P＜0.01；与金纳多组比较^□P＜0.05，^□□P＜0.01

试验结论：

本实验结果显示，脑缺血再灌注损伤后，大鼠血浆中ICAM-1的含量均迅速升高，并在7d内维持较高水平，14d后有所下降。通过本发明药物治疗后，大鼠血清中ICAM-1的水平均显著下降，均有较显著的量效关系，并随着治疗时间的延长，治疗效果越加显著。

实验结果表明，本发明药物可通过抑制黏附分子的表达，减轻脑缺血再灌注损伤后的炎症反应，改善脑缺血，保护脑组织损伤。

采用上述动物实验1-3的方法对实施例2-10制备的药物进行药效学试验，结果与实施例1均无显著差异。

本发明的组合物的优点：本发明药物能明显降低脑缺血再灌注损伤大鼠的神经功能评分，显著改善脑缺血再灌注损伤大鼠的肢体运动功能症状，明显降低脑缺血再灌注损伤大鼠的脑梗死体积，保护脑组织。且其改善作用在实验剂量范围内随治疗时间的延长，症状减轻也愈发明显，并与剂量有较明显的相关性；脑缺血再灌注损伤后，大鼠血清中TNF-α、IL-1β的含量均迅速升高，并在7d内维持较高水平，14d后有所下降。通过本发明药物治疗后，大鼠血浆中TNF-α、IL-1β的水平均显著下降，并随着治疗时间的延长，治疗效果和量效关系越加显著。脑缺血再灌注损伤后，大鼠血浆中ICAM-1的含量均迅速升高，并在7d内维持较高水平，14d后有所下降。通过本发明药物治疗后，大鼠血清中ICAM-1的水平均显著下降。

上述试验结果表明：本发明药物通过对脑缺血再灌注损伤大鼠的神经功能评分，通过抑制炎症细胞因子的表达，抑制黏附分子的表达，减轻脑缺血再灌注损伤后的炎症反应，改善脑缺血，保护脑组织损伤。

Claims (15)

1.一种用于预防和/或治疗脑缺血再灌注损伤的中药组合物，由下述质量份的中药材制成：益母草5-30份、水蛭1-6份、三七2-10份、川牛膝3-20份、白茅根4-30份、石菖蒲4-20份、连翘3-15份和大黄1-6份。

2.根据权利要求1所述的中药组合物，其特征在于：所述中药组合物由下述质量份的中药材制成：益母草6-20份、水蛭2-5份、三七2-8份、川牛膝3-16份、白茅根5-20份、石菖蒲4-15份、连翘3-12份和大黄2-5份。

3.根据权利要求2所述的中药组合物，其特征在于：所述中药组合物由下述质量份的中药材制成：益母草10份、水蛭2份、三七2份、川牛膝3份、白茅根10份、石菖蒲4份、连翘3份和大黄2份。

4.制备权利要求1-3中任一项所述中药组合物的方法，包括下述步骤：

1)取1/3-2/3质量的水蛭粉碎成细粉；

2)三七粉碎成粗粉，用体积分数为60％-95％的乙醇水溶液回流提取，分别收集提取液及提取后的三七药渣，将所述提取液浓缩成50℃-65℃测定相对密度为1.00-1.50的清膏；

3)将所述三七药渣、剩余量的水蛭以及益母草、川牛膝、白茅根、石菖蒲、连翘和大黄六味中药材合并，加水煎煮，收集煎液，滤过，将滤液与步骤2)中所述清膏合并，浓缩成50℃-65℃测定相对密度为1.00-1.50的稠膏，烘干，粉碎成细粉，加入步骤1)得到的水蛭细粉，混匀，即得所述中药组合物。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤2)中所述回流提取进行2-3次，每次提取的时间为1-3小时；每次提取时，提取溶剂的加入质量是所述药材质量的3-6倍；

步骤2)中提取溶剂为体积分数为70％-85％的乙醇水溶液；

步骤2)中所述提取液浓缩成50℃-65℃测定相对密度为1.20-1.40的清膏。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤2)中所述回流提取每次提取的时间为2-3小时；

步骤2)中提取溶剂为体积分数为75％的乙醇水溶液；

步骤2)中所述提取液浓缩成50℃-65℃测定相对密度为1.20-1.30的清膏。

7.根据权利要求4-6中任一项所述的方法，其特征在于：步骤3)中所述煎煮进行2-3次，每次煎煮的时间为1-3小时；每次煎煮时，水的加入质量是所述药材总质量的6-10倍；

步骤3)中将所述滤液与步骤2)中所述清膏合并，浓缩成50℃-65℃测定相对密度为1.20-1.40的清膏。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：步骤3)中所述煎煮每次煎煮的时间为2-3小时；

步骤3)中将所述滤液与步骤2)中所述清膏合并，浓缩成50℃-65℃测定相对密度为1.20-1.30的清膏。

9.权利要求1-3中任一项所述的中药组合物在制备预防和/或治疗脑缺血再灌注损伤的药物中的应用。

10.一种预防和/或治疗脑缺血再灌注损伤的药物，其特征在于：所述药物的活性成分为权利要求1-3中任一项所述的中药组合物。

11.根据权利要求10所述的药物，其特征在于：所述药物由权利要求1-3中任一项所述的中药组合物和药学上可接受的载体组成。

12.根据权利要求10或11所述的药物，其特征在于：所述药物的剂型为药学上任意可接受的剂型。

13.根据权利要求12所述的药物，其特征在于：所述剂型为口服剂型。

14.根据权利要求13所述的药物，其特征在于：所述口服剂型选自下述任意一种剂型：片剂、胶囊剂、口服液、颗粒剂、丸剂和散剂。

15.根据权利要求14所述的药物，其特征在于：所述口服剂型为滴丸剂。