CN103773672B - 一种检测人精子活动力和化学趋向性的方法及其装置 - Google Patents

一种检测人精子活动力和化学趋向性的方法及其装置 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于检测人精子活动力和化学趋向性的方法及其装置，所述装置包括底座和与底座相配合的盖子，底座的顶面凹设有样本室、引诱室和对照室，其中，引诱室和对照室之间通过第二通道相连，样本室与第二通道的中点之间通过第一通道相连，第二通道的长度为8～15cm，第一通道的长度为5～8cm；在第二通道的中点两侧，所述第二通道内均匀设置有隔栏，隔栏将第二通道分成若干个分隔室，隔栏的高度小于第二通道的高度。通过模拟女性生殖器官的相对解剖学位置，模拟精子在女性生殖道内的自然选择过程；一方面通过长距离的运动淘汰掉活动力差的精子；另一方面在分隔室内填装化学引诱剂，对精子的化学趋向性进行检测。

Description

一种检测人精子活动力和化学趋向性的方法及其装置
技术领域
本发明属于辅助生殖技术领域，具体涉及一种检测人精子活动力和化学趋向性的方法及其装置。
背景技术
辅助生殖技术是指对配子、胚胎或者基因物质进行体内外系统操作而获得新生命的技术。采用辅助生殖技术不仅可以治疗不孕不育症，而且可以通过该技术观察胚胎发育过程，揭示生殖奥秘，从而使生殖医学成为21世纪生命科学研究的核心。
辅助生殖技术中，筛选形态功能正常、无遗传缺陷的精子是必需步骤。常规的精子分离筛选技术包括上游法、迁移沉淀法、密度梯度离心法、玻璃棉过滤法、玻璃法、交联葡聚糖柱法和跨膜迁移法等多种。其原理主要是基于精子活动，粘附或过滤，目的是为了获得运动的或形态正常精子，分离出能体外受精的精子。
但常规的精子筛选技术忽视了女性生殖道对精子的自然选择过程，人类在受精过程中，数以百万计的精子经过射精储存在宫颈附近阴道上部，然后精子游出精浆，进入高度水化的宫颈粘液，在此处通过形态和活力进行精子选择；随后，精子通过子宫运输，并利用其活力和及时获能的特征进行选择，功能不良的精子被淘汰；通过竞争激烈角逐的精子最终到达输卵管峡部；在输卵管峡部和卵丘位置，精子可利用热趋向性、化学趋向性反应和DNA完整性进行选择；最后，精子再经过形态选择后通过卵丘细胞，在输卵管的壶腹部与卵母细胞的透明带结合受精；此外，精子还可通过透明带结合能力和DNA的完整性进行选择。
由于没经过在女性生殖道内获得相关功能或遗传质量的筛选，对DNA损伤或凋亡的精子无法区分去除，特别在ICSI情况下，正常受精时不会与卵子结合的精子也可能被注入，从而损伤卵母细胞激活和胚胎核发育；由于DNA损伤的精子也可与卵母细胞受精，会导致反复自然流产。总之，常规分离方法获得的精子具有明显的局限性。
而目前TUNEL检测、SCSA检测、COMET测定、Halosperm测定等确定DNA损伤的方法对于用于辅助生殖的精子来说都是侵入性的、破坏性的，即被分析测定的精子不可再用于受精。因而，目前亟需发展区分性好、对精子而言相对安全、非侵入性的精子分离筛选方法。
在受精过程，卵子通过释放化学因子吸引精子，化学引诱物(化学因子)的浓度梯度可以指引精子游向卵子，这个过程称为化学趋向性(chemotaxis)。利用化学趋向性筛选精子符合其在女性生殖道内的自然选择过程；由于化学趋向性涉及到精子生理状态的信号传导过程，而这一过程是否顺利又可反映精子各项功能是否正常发挥，更可能筛选分离出功能正常的精子，更好地区分出异常的精子。
发明内容
本发明公开了一种用于检测人精子活动力和化学趋向性的装置，利用该装置能对人精子的活动力和化学趋向性进行有效评价，并筛选得到功能正常的精子。
一种用于检测人精子活动力和化学趋向性的装置，包括底座和与底座相配合的盖子，底座的顶面凹设有样本室、引诱室和对照室，其中，引诱室和对照室之间通过第二通道相连，样本室与第二通道的中点之间通过第一通道相连，第二通道的长度为16～30cm，第一通道的长度为5～8cm；
在第二通道的中点两侧，所述第二通道内均匀设置有隔栏，隔栏将第二通道分成若干个分隔室，隔栏的高度小于第二通道的高度。
本装置采用透明、硬度强、耐高温、耐腐蚀、无毒无热原的高分子材料制成，整个装置模拟了女性生殖器官的相对解剖学位置，其中第一通道模拟女性子宫，第二通道模拟两条输卵管，引诱室、对照室则模拟了两个卵巢。
本发明中，第二通道可以是呈水平的直线形，也可以是呈一定弧度的弧形。
样本室、引诱室、对照室和第一通道、第二通道均是凹设在底座顶面的，与凸设在底座顶面相比，凸设在底座顶面不仅便于制作加工，而且由于结构较为精细，便于保存，凸设则易于遭到损伤。
隔栏的高度小于第二通道的高度，则分隔室的高度低于第二通道的高度，便于在分隔室上层导入精子培养液，保证精子存活和自由游动。
样品室内的精子若能在预定时间内穿过第一通道和第二通道到达引诱室或对照室，则说明精子活动力较好；位于引诱室一侧的分隔室用于固定不同浓度的化学引诱剂，形成浓度梯度，诱使样品室内的精子向引诱室运动，若大部分精子都游向引诱室而不是对照室，则说明精子化学趋向性较好。
作为优选，第二通道的长度为16cm，第一通道的长度为6cm。如此长度的第二通道正好相当于两条正常女性输卵管的长度，以及如此长度的第一通道正好相当于子宫的长度，更好地模拟女性生殖道对精子的自然选择过程。
作为优选，在第二通道的中点两侧，所述分隔室均至少有三个。更优选为4～5个，便于多设置几个引诱剂浓度，更好地引诱精子。
作为优选，所述第一通道或第二通道的高度为1～3cm，所述隔栏的高度为2～4mm。更优选地，第一通道或第二通道的高度为2cm，隔栏的高度为3mm。为精子游动提供更大的空间。
并且，第二通道的宽度从第二通道的中点至引诱室、对照室逐渐变大，即第二通道呈“中间窄、两端宽”。其中，最窄处的宽度为0.5～1mm，最宽处的宽度为2～2.5mm。而第一通道的宽度从第二通道的中点至样品室逐渐变小。样本室、引诱室和对照室均为圆柱形，圆柱的高为1～2cm，圆柱的底面直径为5～10mm。如此装置就更逼真地模拟了女性生殖道的形状，能更好地模拟女性生殖道对精子的自然选择过程。
作为优选，所述第二通道的两端均插设有隔板，隔板的高度不小于第二通道的高度。隔板为可拆卸式，当预定的精子游动时间结束后，才插入隔板，对引诱室和对照室内的精子浓度进行检测，避免精子在检测过程中离开引诱室或对照室。
本发明还提供了利用所述装置检测人精子活动力和化学趋向性的方法，包括：
(1)将化学引诱剂固定在位于引诱室一侧的分隔室中，使用单一化学引诱剂浓度，或使分隔室内化学引诱剂的浓度从第二通道的中点至引诱室依次变大；
作为优选，化学引诱剂的固定方法为：配制含不同浓度化学引诱剂的琼脂基质，加到对应的分隔室中，待凝固后即完成固定。待步骤(2)中向各室道中加入精子培养液后，琼脂中化学引诱剂分子随即逸出至精子培养液，若各分隔室中含有相同浓度的化学引诱剂，则化学引诱剂浓度梯度的形成较为缓慢，因此优选为在各分隔室中加入不同浓度的化学引诱剂，使化学引诱剂分子的逸出过程既是化学引诱剂浓度梯度的形成过程。
具体地，用人输卵管液(HTF)无机盐成分等渗溶液配制2％的琼脂培养基，灭菌后，等琼脂培养基冷却至56℃左右，量取一定体积琼培养基脂分别置于5个不同试管，加入不同量的化学引诱剂(已过滤灭菌)，混匀，并迅速将含不同浓度化学引诱剂的琼脂培养基分别注满相应的分隔室。所述人输卵管液(HTF)无机盐成分等渗溶液的配方为：氯化钠90mM、氯化钾5.06mM、碳酸氢钠25.3mM、氯化钙1.8mM、磷酸二氢钾1.17mM、硫酸镁1.01mM。
作为优选，所述化学引诱剂为孕酮、心房钠尿肽(atrial natriureticpeptide,ANP)、P物质、尿激酶型纤溶酶原激活因子(uPA)、血小板活化因子(platelet-activating factor，PAF)、趋化因子RNATES(regulated onActivation Normal T Expressed and Secreted)、肾上腺素、催产素、降钙素、乙酰胆碱、猪抗凝血酶因子或气味分子odorant；更优选为孕酮。优选地，设置五个孕酮浓度，依次为0.32μM、0.63μM、1.25μM、2.50μM和5.00μM。
(2)向样本室、引诱室、对照室和第一通道、第二通道内加入精子培养液；
所述精子培养液可选用人输卵管液(HTF)培养基，其配方为：氯化钠90mM、氯化钾5.06mM、碳酸氢钠25.3mM、氯化钙1.8mM、磷酸二氢钾1.17mM、硫酸镁1.01mM、Hepes 20mM、丙酮酸钠0.27mM、乳酸钠21.6mM、酚红5μg/mL、葡萄糖5.56mM、青霉素60mg/L、牛血清白蛋白4g/L。
作为优选，加入HTF培养基后，装置内HTF培养基的液面高度为2.5mm～4.5mm。
加入HTF培养基后，分隔室内被琼脂固化的化学引诱剂分子即缓慢扩散到相应分隔室上方的HTF培养基中，完成化学引诱剂浓度梯度的形成。
(3)将待测获能精子悬液加到样本室中，于37℃下孵育60～70min，分别检测样本室精子浓度C、引诱室精子浓度A和对照室精子浓度B，并计算A/C比值、B/C比值和A/B比值；
其中，A/C比值、B/C比值中较大者为精子活动力系数，A/B比值为精子化学趋向性系数。
获能精子悬液的制备方法为：精子采集并液化后，与HTF培养基等体积混匀，500g离心5min，弃上层液体；精子用1～1.5mL HTF培养基重新悬浮，置于37℃、5％CO2孵箱内获能培养90min；得获能精子悬液。
作为优选，获能精子悬液的添加量为0.5～1mL。
孵育完成后，在第二通道的两端插入隔板，避免引诱室和对照室内的精子游出，保证计数的准确性。根据计算获得的A/C比值、B/C比值和A/B比值对精子质量进行评价：
(1)若A、B均不为0且A/B＞1，或A不为0、B为0，表明精子活动力好(此时A/C比值为精子活动力系数，A/C比值越大，活动力越好)，化学趋向性好。
(2)若A、B均不为0且A/B≤1，表明精子活动力好(此时B/C比值为精子活动力系数，B/C比值越大，活动力越好)，化学趋向性差。
(3)若A、B均为0，表明精子活动力差，继续孵育30～180min，再检测样本室、引诱室和对照室中的精子浓度，对精子质量进行评价：
1)若此时A、B均不为0且A/B＞1，表明精子活动力较差，化学趋向性好；
2)若此时A、B均不为0且A/B≤1，表明精子活动力较差，化学趋向性差；
3)若此时A、B仍为0，表明精子活动力极差，难以获得化学趋向性系数，无法评估其化学趋向性。
“A、B均不为0”表示精子能够进行长距离的运动到达引诱室和对照室，表明其活动力好；“A/B＞1，或A不为0、B为0”表明大多数或全部精子集中到引诱室中，说明其化学趋向性好；“A/B≤1”表明浓度梯度的化学引诱剂对精子没有选择性，说明其化学趋向性差。
若在预定时间内均未在引诱室和对照室中检测到精子，表明精子活动力差，无法在预定时间内达到，此时适当延长孵育时间再对其化学趋向性进行评价。本发明还提供了所述装置在筛选人精子中的应用。在预定时间内达到引诱室的精子，其活动力和化学趋向性均较佳，表明精子质量较好；精子活动力系数和精子化学趋向性系数越大的精子样本，其质量也越好；则引诱室内的精子即可用于进一步的生殖生物学研究、辅助生殖应用等方面。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明的装置模拟女性生殖器官的相对解剖学位置，模拟精子在女性生殖道内的自然选择过程；一方面通过长距离的运动淘汰掉活动力差的精子，同时检测精子样本的活动力系数；另一方面，在第二通道内设置分隔室，在分隔室内加入不同浓度的化学引诱剂，形成浓度梯度，检测精子样本的化学趋向性系数，对精子的化学趋向性进行评价；
(2)本发明的装置和方法在检测精子活动力系数和化学趋向性系数的过程中，对精子具有无损伤、非侵入、安全性高等特点，因此检测过程也是筛选优良精子的过程；并且操作简便易行，成本低廉，便于实际应用。
附图说明
图1为本实用新型用于检测人精子活动力和化学趋向性的装置的顶面结构示意图；
图2为本实用新型用于检测人精子活动力和化学趋向性的装置的侧面结构示意图。
具体实施方式
实施例1用于检测人精子活动力和化学趋向性的装置
如图1、图2所示，本实施例一种用于检测人精子活动力和化学趋向性的装置，本装置采用透明、硬度强、耐高温、耐腐蚀、无毒无热原的高分子材料制成，包括底座1和与底座1相配合的盖子11，底座1的顶面凹设有样本室4、引诱室2和对照室3，其中，引诱室2和对照室3之间通过第二通道7相连，样本室4与第二通道7的中点之间通过第一通道6相连。
样本室4、引诱室2和对照室3均为圆柱形，样本室4圆柱的底面直径为10mm，引诱室2和对照室3圆柱的底面直径均为5mm，引诱室2和对照室3模拟女性的两个卵巢，样本室4、引诱室2、对照室3以及第一通道6、第二通道7的高度均为2cm。其中，第二通道7的长度为16cm，相当于两条女性输卵管的长度；第一通道6的长度为6cm，相当于女性子宫的长度。
第二通道7的宽度从第二通道7的中点至引诱室2、对照室3逐渐变大，即第二通道7呈“中间窄、两端宽”。其中，最窄处的宽度为0.5mm，最宽处的宽度为2mm。而第一通道6的宽度从第二通道7的中点至样品室2逐渐变小。
由图1、图2可见，第二通道7内设有隔栏9，本实施例中，在第二通道7的中点两侧，均有五个分隔室8，隔栏9的高度小于第二通道7的高度；本实施例中，隔栏9的高度为3mm。
并且，第二通道7的两端均设有卡槽，卡槽内插设有隔板10，隔板10的高度不小于第二通道7的高度。本实施例中，隔板10的高度为2.5cm。
实施例2精子样本的活动力与化学趋向性评价
1试验准备
(1)将实施例1的装置进行121℃，15min高压灭菌、去热原处理。
(2)试剂配制
①人输卵液(HTF)培养基(也购买商业化产品)，其成份：氯化钠90mM、氯化钾5.06mM、碳酸氢钠25.3mM、氯化钙1.8mM、磷酸二氢钾1.17mM、硫酸镁1.01mM、Hepes 20mM、丙酮酸钠0.27mM、乳酸钠21.6mM、酚红5μg/mL、葡萄糖5.56mM、青霉素60mg/L、牛血清白蛋白4g/L。
②人输卵管液(HTF)无机盐成分等渗溶液，其成份：氯化钠90mM、氯化钾5.06mM、碳酸氢钠25.3mM、氯化钙1.8mM、磷酸二氢钾1.17mM、硫酸镁1.01mM。
③取人输卵管液(HTF)无机盐成分等渗溶液，加入2％琼脂，获得琼脂基质，灭菌后冷却至56℃左右，量取一定体积的琼脂基质置入五个试管中，并向试管中加入孕酮(已过滤灭菌)，获得化学引诱剂琼脂基质；化学引诱剂琼脂基质中，孕酮的终浓度依次为：0.32μM、0.63μM、1.25μM、2.50μM和5.00μM。充分混匀后迅速将不同浓度的化学引诱剂琼脂基质位于引诱室一侧的分隔室中(分隔室内化学引诱剂的浓度从第二通道的中点至引诱室逐渐变大；在位于对照室一侧的分隔室中只注入琼脂基质)，待凝固后盖上盖子，置于4℃下保存，待用。
2人精子活动力和化学趋向性检测
(1)采集精子样本并液化后，与HTF培养基等体积混匀，500g离心5min，弃上层液体；沉淀的精子用1.1mL HTF培养基重新悬浮，置于37℃、5％CO2孵箱内获能培养90min；
(2)在操作步骤(1)期间，在实施例1的装置各室道内注入总共3mL的HTF培养基，将该装置置入37℃、5％CO2孵箱内平衡(约30min)；
(3)获能培养时间结束，取0.9mL获能精子悬液缓慢轻柔地加在样本室中，加上盖子，并小心地将装置放置孵箱内培养，60min后将两块隔板分别插入对应的卡槽内，分别吸取样本室、引诱室及对照室内的培养物各10μl，分别检测样本室、引诱室及对照室中的精子浓度。计数结果显示，样本室内的精子浓度为82.0×106/mL，引诱室内的精子浓度A为4.4×106/mL，对照室内精子浓度B为4.0×106/mL。由于A、B均不为0且A/B＝1.1(＞1)，表明该精子样本活动力好(孵育60min时，精子活动力系数A/C为0.054)，化学趋向性好(精子化学趋向性系数A/B为1.1)。引诱室内的精子即为筛选出的质量优良的精子，可收集于另一洁净无菌无热原的培养皿或试管内，可供研究、辅助生殖中的体外受精和ICSI等使用。
实施例3精子样本的活动力与化学趋向性评价
1试验准备
与实施例2的第1部分相同。
2人精子活动力和化学趋向性检测
与实施例2的第2部分相同，但评价的是不同来源的人精子样本，且获能培养结束后，取0.6mL获能精子悬液缓慢轻柔地加在样本室中，加上盖子，并小心地将装置放置孵箱内孵育，60min后将两块隔板分别插入对应的卡槽内，分别吸取样本室、引诱室及对照室内的培养物各10μl，分别检测样本室、引诱室及对照室中的精子浓度。计数结果显示，样本室内的精子浓度C为74.0×106/mL，引诱室内的精子浓度A为2.0×106/mL，对照室内的精子浓度B为2.0×106/mL。由于A、B均不为0且A/B＝1，表明该精子样本活动力好(孵育60min时，精子活动力系数A/C或B/C为0.027)，但化学趋向性差(精子化学趋向性系数A/B为1)。
实施例4精子样本的活动力与化学趋向性评价
1试验准备
与实施例2的第1部分相同。
2人精子活动力和化学趋向性检测
与实施例2的第2部分相同，但评价的是不同来源的人精子样本，且获能培养结束后，取0.7mL获能精子悬液缓慢轻柔地加在样本室中，加上盖子，并小心地将装置放置孵箱内孵育，60min后将两块隔板分别插入对应的卡槽内，分别吸取样本室、引诱室及对照室内的培养物各10μl，分别检测样本室、引诱室及对照室中的精子浓度。计数结果显示，样本室内的精子浓度为54.0×106/mL，引诱室内的精子浓度为0，对照室内的精子浓度为0，表明该精子样本的活动力差。为评价其化学趋向性，继续孵育30min，再检测样本室、引诱室及对照室中的精子浓度。第二次计数的结果为：引诱室内的精子浓度A为1.8×106/mL，对照室内的精子浓度B为1.6×106/mL。由于A、B均不为0且A/B＝1.125(＞1)，表明该精子样本的活动力较差(孵育时间延长了30min)，化学趋向性好(精子化学趋向性系数A/B为1.125)。
实施例5精子样本的活动力与化学趋向性评价
1试验准备
与实施例2的第1部分相同。
2人精子活动力和化学趋向性检测
与实施例2的第2部分相同，但评价的是不同来源的人精子样本，且获能培养结束后，取0.8mL获能精子悬液缓慢轻柔地加在样本室中，加上盖子，并小心地将装置放置孵箱内孵育，60min后将两块隔板分别插入对应的卡槽内，分别吸取样本室、引诱室及对照室内的培养物各10μl，分别检测样本室、引诱室及对照室中的精子浓度。计数结果显示，样本室内的精子浓度为68.0×106/mL，引诱室内的精子浓度为0，对照室内的精子浓度为0，表明该精子样本的活动力差。为评价其化学趋向性，继续孵育30min，再检测样本室、引诱室及对照室中的精子浓度。第二次计数的结果为：引诱室内的精子浓度A为0.8×106/mL，对照室内的精子浓度B为0.8×106/mL。由于A、B均不为0且A/B＝1，表明该精子样本的活动力较差(时间延长了30min)，化学趋向性差(精子化学趋向性系数A/B为1)。
实施例6精子样本的活动力与化学趋向性评价
1试验准备
与实施例2的第1部分相同。
2人精子活动力和化学趋向性检测
与实施例2的第2部分相同，但评价的是不同来源的人精子样本，且获能培养结束后，取1mL获能精子悬液缓慢轻柔地加在样本室中，加上盖子，并小心地将装置放置孵箱内孵育，60min后将两块隔板分别插入对应的卡槽内，分别吸取样本室、引诱室及对照室内的培养物各10μl，分别检测样本室、引诱室及对照室中的精子浓度。计数结果显示，样本室内的精子浓度为24.0×106/mL，引诱室内的精子浓度为0，对照室内的精子浓度为0，表明该精子样本的活动力差。为评价其化学趋向性，继续孵育90min，再检测样本室、引诱室及对照室中的精子浓度。第二次计数的结果为：引诱室内的精子浓度A为0，对照室内的精子浓度B为0。由于A、B仍为0，表明该精子样本的活动力极差，无法评估其化学趋向性。

Claims (9)

1.一种用于检测人精子活动力和化学趋向性的装置，包括底座和与底座相配合的盖子，其特征在于，底座的顶面凹设有样本室、引诱室和对照室，其中，引诱室和对照室之间通过第二通道相连，样本室与第二通道的中点之间通过第一通道相连，第二通道的长度为16～30cm，第一通道的长度为5～8cm；
在第二通道的中点两侧，所述第二通道内均匀设置有隔栏，隔栏将第二通道分成若干个分隔室，隔栏的高度小于第二通道的高度。
2.如权利要求1所述的装置，其特征在于，在第二通道的中点两侧，所述分隔室均至少有三个。
3.如权利要求1所述的装置，其特征在于，所述第一通道或第二通道的高度为1～3cm，所述隔栏的高度为2～4mm。
4.如权利要求1所述的装置，其特征在于，样本室、引诱室和对照室均为圆柱形，圆柱的高为1～2cm，圆柱的底面直径为5～10mm。
5.如权利要求1所述的装置，其特征在于，所述第二通道的两端均插设有隔板，隔板的高度不小于第二通道的高度。
6.利用如权利要求1～5任一所述装置检测人精子活动力和化学趋向性的方法，包括：
(1)将化学引诱剂固定在位于引诱室一侧的分隔室中，使用单一化学引诱剂浓度，或使分隔室内化学引诱剂的浓度从第二通道的中点至引诱室依次变大；
(2)向样本室、引诱室、对照室和第一通道、第二通道内加入精子培养液；
(3)将待测获能精子悬液加到样本室中，于37℃下孵育60～70min，分别检测样本室精子浓度C、引诱室精子浓度A和对照室精子浓度B，并计算A/C比值、B/C比值和A/B比值；
其中，A/C比值、B/C比值中较大者为精子活动力系数，A/B比值为精子化学趋向性系数。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述化学引诱剂为孕酮、心房钠尿肽、P物质、尿激酶型纤溶酶原激活因子、血小板活化因子、趋化因子RNATES、肾上腺素、催产素、降钙素、乙酰胆碱、猪抗凝血酶因子或气味分子odorant。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，化学引诱剂的固定方法为：配制含不同浓度化学引诱剂的琼脂基质，加到对应的分隔室中，待凝固后即完成固定。
9.如权利要求1～5任一所述装置在筛选人精子中的应用。
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