CN105617360B - C-型钠肽在制备外用避孕药和精子功能检测试剂中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及C‑型钠肽在制备外用避孕药和精子功能检测试剂中的应用。研究发现，在排卵发生时，输卵管受精部位壶腹部表达C‑型钠肽，能诱导精子向卵子趋化运动，完成受精。若在雌性哺乳动物生殖道内添加一定量的C‑型钠肽，或将C‑型钠肽与精子孵育，改变输卵管中C‑型钠肽的浓度梯度分布，精子就不能顺着浓度梯度向卵子趋化运动，从而阻滞受精。本发明基于上述精子趋化原理，提供一种以内源性蛋白‑‑C‑型钠肽为有效成分的外用避孕药，该避孕药无毒副作用和不良反应，适用于大多数育龄女性避孕，使用方便，应用前景广阔。另外，利用由C‑型钠肽制备的精子功能检测试剂对精子质量进行鉴定，操作简单，结果易观察，所需精液量少，适用于精子功能的体外检测。

Description

C-型钠肽在制备外用避孕药和精子功能检测试剂中的应用

技术领域

本发明涉及医药卫生领域，具体地说，涉及C-型钠肽在制备外用避孕药和精子功能检测试剂中的应用。

背景技术

由于气候环境变化，生活工作节奏变快等因素导致的男性不育人群增加，有些导致男性不育的原因至今尚未明确。常规精液分析主要可以了解精液量、精子密度及精液中精子的总量、精子凝集、精子活力与活率、精子形态、精液液化等方面的信息。实际上，通过上述常规分析，难以真正了解精子的功能和受精潜能，特别是在人工授精及试管婴儿方面，尚不能仅仅通过精液常规分析所提供的信息，决定是否可以进行人工授精。因此，有必要探讨新的检测精子功能的方法。

计划生育是我国的基本国策，对于提高我国人口素质、提高生殖健康水平、提高民族整体实力意义重大。在这种大环境下，相关生育节育技术和相关避孕药具的研发得到快速发展，各种避孕药具相继面市，如常见的女性用物理屏障避孕工具有阴道隔膜和避孕宫颈帽，这些避孕工具在使用前，需经妇科检查，根据阴道大小选择适当型号的阴道隔膜试行放入，然后在医生指导下学会放入和取出的方法，直到完全能够掌握使用为止，但妇女生育后所需阴道隔膜的型号大小可能与以前不同，往往还需重新配置，因而使用方法较烦琐。

另外，现有女性外用避孕药均为具有细胞毒性的杀精子药物，其作用机理均为损伤或破坏精子细胞，但同时对其它细胞也有毒性且对阴道有一定的刺激作用，故临床不主张长期连续使用。目前应用最广泛的代表性药物为壬苯醇醚(N-9)，如经常使用，N-9可引起一些妇科炎症，如细菌性阴道炎、生殖道溃疡、外阴炎、中毒性休克综合症(TSS)、宫颈阴道上皮脱落等。

口服避孕药包括以下几种：短效口服避孕药、长效口服避孕药、长效避孕针和探亲避孕药。它们的作用机制主要通过抑制排卵和阻止受精卵着床而达到避孕。长期服用避孕药会抑制排卵，易使女性长胖，增加血栓和偏头疼的风险。若长期盲目、大量服用，将对健康造成极大危害。因此，进一步研制出安全、有效且可长期使用的避孕药成为迫切需要。

发明内容

本发明的目的是基于精子趋化原理，提供C-型钠肽在制备外用避孕药和精子功能检测试剂中的应用。

本发明的另一目的是提供一种安全、有效、适合育龄女性长期使用的新型外用避孕药。

本发明的又一目的是提供一种精子功能检测试剂及检测装置。

为了实现本发明目的，本发明提供C-型钠肽在制备外用避孕药和精子功能检测试剂中的应用。

本发明还提供一种外用避孕药，其有效成分为C-型钠肽。

所述药剂还包括药学上可接受的辅料或辅助性成分。所述辅料包括增塑剂、填充剂、润湿剂、粘合剂等。

所述药剂为水剂、栓剂、凝胶剂、膜剂、泡沫剂、片剂或可溶性避孕套。

本发明的外用避孕药，所述药剂的单次剂量单元为C-型钠肽20×10^-7-200×10^{- 7}mg/Kg体重。

使用时，将避孕药放置于雌性哺乳动物生殖道内(例如阴道后，或通过外用避孕药放置器将避孕药送达雌性哺乳动物子宫内)，待药剂溶解后再行交配，便可避孕。

本发明还提供一种精子功能检测试剂，所述检测试剂中含有精子趋化源，其为组织细胞、液体、凝胶或固体，趋化源所含有效成分为C-型钠肽。所述精子趋化源中C-型钠肽的浓度为0.01-10nM。

本发明还提供含有所述检测试剂的精子功能检测试剂盒。

本发明还提供包被有所述检测试剂的精子功能检测试剂条。

本发明进一步提供一种精子功能检测装置，所述检测装置为至少一端开口的管径1-10mm、长2-10cm的毛细管；对于一端封闭的毛细管，在毛细管的封闭端预置有所述精子功能检测试剂；对于两端开口的毛细管，在毛细管的一端预置有所述精子功能检测试剂。

研究发现，在排卵发生时，输卵管受精部位壶腹部表达C-型钠肽，能诱导精子向卵子趋化运动，完成受精。如将此时的壶腹部取出，放入毛细管中，壶腹部缓慢释放的C-型钠肽就能使精子向毛细管内做趋化运动。据此可以判断精子是否具有自然受精的能力。可根据C-型钠肽诱导精子趋化的能力来检测精子中NPR2的表达情况，来检测精子质量，作为判断精子不育的一个临床标准。

可利用上述检测装置或者在体外建立毛细管趋化模型，检测精子的趋化能力，并根据精子趋化的能力来判断精子自然不育的原因，从而实现精子功能检测/鉴定。具体地，本发明提供的精子功能检测方法，是将一定量的C-型钠肽或输卵管壶腹部放入毛细管的一端，另一开口端与精液微滴相连，在显微镜的10倍物镜下观察进入毛细管中的精子数量，如果进入毛细管中精子的数量与对照(毛细管中不放置有C-型钠肽或输卵管壶腹部)相同，则表明精子没有趋化能力，可能由此导致不能自然受精。更具体地，将新鲜采集的精液先在获能液(如T6)中孵育1.5h，进行获能，然后加至150μl获能液微滴中，精子密度约为10⁶个/ml。取长2.5cm，管径3mm的毛细管，一端封闭。将刚发生排卵的小鼠壶腹部取出，放入到毛细管的封闭端，然后将毛细管的开口端与精液微滴相连。而对照组毛细管中不含有壶腹部。在显微镜的10倍物镜下连续观察视野内中的精子数量，在同一时间，比较处理组与对照组中的精子数量，如没有显著性差异，则表明该精液不能自然受精的原因可能是NPR2基因变异，导致无法向卵母细胞做趋化运动，造成受精失败。

同时，利用上述精子趋化原理，在生殖道内干扰精子趋化，能降低雌性哺乳动物的受精率。因此，可通过干扰精子趋化现象，达到避孕的目的。例如，在雌性哺乳动物的生殖道中添加一定量的C-型钠肽，或将C-型钠肽与精子孵育，改变输卵管中的C-型钠肽的浓度梯度分布。这样，精子就不能顺着浓度梯度向卵母细胞做趋化运动，精子与卵母细胞不能相遇，从而阻止受精。

C-型钠肽(natriuretic peptide type C,CNP，又简称NPPC)是一种卵泡液中天然存在的旁分泌因子。已有研究证明CNP作为卵母细胞成熟抑制因子，可提高卵丘细胞以及卵母细胞中的环磷酸鸟苷(cyclic guanosine3’,5’-monophosphate,cGMP)水平，同时也增加卵母细胞中的环磷酸腺苷(cyclic adenosine3’,5’-monophosphate,cAMP)水平。另外，其受体在精子中的表达特征可作为判断精子质量好坏的标准。常规精液分析主要可以了解精液量、精子密度及其精液中精子的总数量、精子凝集、精子活力与活率、精子形态、精液液化等方面的信息。实际上通过上述常规分析，难以真正了解精子的功能和受精潜能，特别是在人工授精及试管婴儿方面，尚不能仅仅通过精液常规所提供的信息，决定是否可以进行人工授精。C-型钠肽受体(natriuretic peptide receptor 2，NPR2)具有鸟苷酸环化酶的活性，CNP与其结合后，可刺激NPR2产生高水平的cGMP，通过升高精子细胞内钙离子水平，使精子向卵母细胞做趋化运动，完成受精。因此，可根据NPR2表达特点来检测精子质量，作为判断精子不育的一个临床标准。

本发明提供的新型外用避孕药，其有效成分C-型钠肽为内源性蛋白，且是外用，因此，其副作用要比口服避孕方法小。该药剂能应用到雌性哺乳动物生殖道内，特别是女性阴道中，适用于大多数育龄女性避孕，且避孕药无毒副作用和不良反应，使用方便，具有广阔的应用前景。另外，利用由C-型钠肽制备的精子功能检测试剂对精子质量进行鉴定，操作方法简单，结果易观察，所需精液量少，适用于雄性/男性精子功能的体外检测。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

以下实施例中获能液T6(改进的mTyrode’s液)的配方如下：

表1获能液T6的配方

成分	浓度(g/100ml)	浓度(mmol/l)
			NaCl	0.6660	114
KCl	0.0238	3.2
			MgCl<sub>2</sub>·6H<sub>2</sub>O	0.0100	0.5
CaCl<sub>2</sub>·2H<sub>2</sub>O	0.0294	2.0
			NaH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>O	0.0062	0.4
NaHCO<sub>3</sub>	0.2090	24.9
			葡萄糖	0.1000	5.6
焦磷酸钠	0.0055	0.5
			乳酸钠溶液	0.1121	10.0
4-羟乙基哌嗪乙磺酸	0.2400	10.0
			酚红	0.0010

注：精子获能液T6中还含有终浓度为10mg/ml的牛血清蛋白(bovine serumalbumin，BSA)。

实施例1 C-型钠肽在诱导精子趋化方面的应用

从成年雄性小鼠的附睾尾中取出新鲜精子，在获能液T6中孵育1.5h进行获能。获能后的小鼠精子加至培养皿中央的150μl T6液微滴中，精子密度约为5×10⁶个/ml。毛细管(长2.5cm，管径3mm)一端封闭，在封闭端放入一个壶腹部，壶腹部来源于刚发生排卵的小鼠输卵管，作为实验组。对照组毛细管(长2.5cm，管径3mm)中不放入壶腹部。毛细管的开口端与精液微滴相连。在显微镜的10倍物镜下连续观察视野内毛细管中的精子数量。实验重复3次。

结果发现，对照组中在3、6、9、12、15、18、21、24、27、30分钟，视野中的精子数分别为1、1、9、20、20、17、24、37、32个，而实验组中的精子数分别为2、10、28、45、68、125、280、351、396个。可见，含有C-型钠肽的壶腹部能极显著地增加毛细管中的精子数量。

此外，将1nM的C-型钠肽放入毛细管中，可使毛细管中精子数量从4.7×10⁵/ml增加到10.9×10⁵/ml。

实施例2 C-型钠肽在精子功能检测中的应用

将不能自然受精的精子在获能液T6中进行获能处理后，加至150μl T6液微滴中，精子密度为10⁶个/ml。取长2.5cm，管径3mm的毛细管，一端封闭。将刚发生排卵的小鼠壶腹部取出，放入到毛细管的封闭端，然后将毛细管的开口端与精液微滴相连。而对照组毛细管(长2.5cm，管径3mm)中不含有壶腹部。在显微镜的10倍物镜下连续观察视野内中的精子数量，在同一时间，比较处理组与对照组毛细管中的精子数量，如无显著性差异，则表明该精液不能自然受精的原因可能是NPR2基因变异，不能向卵母细胞趋化运动，导致受精失败。

实施例3 C-型钠肽在降低小鼠受精率方面的应用

成年雌鼠经排卵诱导处理后，向其子宫颈中注射一定浓度的C-型钠肽，然后与雄鼠合笼。具体方法如下：成年CD-1雌鼠(6-8周)30只，每只体重约35g，共分为五组，每组六只，即A、B、C、D、E组，每组中雌鼠编号为1、2、3、4、5、6。五组雌鼠分别施以不同浓度的C-型钠肽，依次为0、10×10^-10、5×10^-10、10^-9、10^-8mol/l,注射量为20μl。成年雌鼠经促性腺激素诱导后(PMSG 5IU/只，诱导48小时，然后HCG 5IU/只，诱导12小时)，用微量注射器向雌鼠子宫颈中注射20微升C-型钠肽，立即与成年CD-1雄鼠合笼，次日早上检栓，第3日冲出雌鼠输卵管中的二细胞或假定的二细胞，以二细胞率记为受精率。实验重复三次。结果发现，受精率与对照A组(不使用C-型钠肽)相比(A组受精率为93.1％)，处理组B、C、D、E的受精率显著下降，分别为54.9％、45.0％、24.8％、38.7％，其中，D组(注射10^-9mol/l C-型钠肽)受精率下降的效果最为显著。

同样，将C-型钠肽与精子孵育后，再进行人工授精，其受精率也显著下降。具体方法如下：成年CD-1雌鼠(6-8周)12只，每只体重约35g，共分为两组，即A、B组，每组六只，每组中雌鼠编号为1、2、3、4、5、6。两组雌鼠分别施以不同浓度的C-型钠肽，依次为0、10^-9mol/l。成年雌鼠经促性腺激素诱导(PMSG 5IU/只，诱导48小时，然后HCG 5IU/只，诱导12小时)。在37℃,5％CO₂中培养箱中用获能液T6处理新鲜精子使其获能，然后将获能后精子经C-型钠肽(0或10^-9mol/l)孵育30min后，将精子(3×10⁶-10×10⁶个,体积为50μl)注入到雌鼠子宫颈中，立即与输精管结扎的雄鼠合笼，次日早上检栓，第3日冲出雌鼠输卵管中的二细胞或假定的二细胞，以二细胞率记为受精率。实验重复三次。结果发现，受精率与对照A组(不使用C-型钠肽)相比(A组受精率为74.3％)，处理组B(10^-9mol/l C-型钠肽孵育精子)的受精率显著下降，受精率仅为18.5％。

实施例4 C-型钠肽在制备外用避孕药中的应用

C-型钠肽的用量为20×10^-7-200×10^-7mg/Kg体重，向C-型钠肽中加入栓剂或可溶性避孕套来制备外用避孕药。栓剂的基质可使用水溶性甘油明胶，进一步制成球形、卵形或鸭嘴形的阴道栓。C-型钠肽即可按照体重对应的剂量添加在栓剂或可溶性避孕套中，制备成避孕药。

使用时，将避孕药放置于雌性哺乳动物生殖道内(例如阴道后，或通过外用避孕药放置器将避孕药送达雌性哺乳动物子宫内)，待药剂溶解后再行房事，便可避孕。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (1)

1.C-型钠肽在制备外用避孕药中的应用。