CN103772499A - 一种丝氨酸蛋白酶抑制因子重组多肽及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种丝氨酸蛋白酶抑制因子重组多肽及其制备方法和应用，属于基因工程及其制备领域。本发明通过构建人源丝氨酸蛋白酶抑制因子Hespintor原核表达载体，优化重组多肽表达，改善重组多肽纯化，鉴定重组多肽活性，其重组多肽可以抑制胰蛋白酶的蛋白活性及人肝癌细胞株SMMC-7721的增殖活性，为人源丝氨酸蛋白酶抑制因子重组多肽抗肿瘤应用奠定基础，可望形成新的抗肿瘤治疗药物。

Description

一种丝氨酸蛋白酶抑制因子重组多肽及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于基因工程及其制备领域，特别涉及一种丝氨酸蛋白酶抑制因子重组多肽及其制备方法。
背景技术
侵袭和转移是恶性肿瘤的生物学特性，是造成恶性肿瘤患者死亡的主要原因。降低恶性肿瘤患者死亡率，改善恶性肿瘤患者预后，抑制恶性肿瘤细胞侵袭和转移是医学治疗的难点。细胞外基质（ECM）的水解是肿瘤细胞侵袭和转移的重要步骤。肿瘤细胞可分泌一种多功能丝氨酸蛋白酶尿激酶型纤溶酶原，激活纤溶酶原产生纤溶酶，继而降解细胞外基质；同时还能激活基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase,MMP），降解细胞外基质和层粘连蛋白、纤粘连蛋白、纤维蛋白聚糖、胶原纤维等基膜成分。当细胞和基质屏障被穿透破坏，肿瘤细胞实现侵袭和/或转移。
抑制尿激酶型纤溶酶原激活系统活性可以阻止肿瘤的侵袭和/或转移。尿激酶型纤溶酶原激活系统由尿激酶型纤溶酶原激活物（urokinase plasminogen activator,uPA）、尿激酶型纤溶酶原激活物受体（uPA receptor,uPAR）、纤溶酶原激活物抑制因子1（plasminogen activatorinhibitor1,PAI-1）和2（PAI-2）组成，后者属于丝氨酸蛋白酶抑制因子（serine protease inhibitors,Serpin）超家族。Serpin是一类丝氨酸蛋白酶活性调节因子，可特异性结合丝氨酸蛋白酶活性中心，抑制丝氨酸蛋白酶活性。常见的类型包括Kazal型、Kunitz型、α-巨球蛋白、Bowman-Brik、pacifastin家族，其中Kazal型Serpin较为保守，主要存在于哺乳动物中，目前已发现100多种，多为小分子多肽，大多能够抑制肿瘤细胞的增殖和活性。
发明内容
本发明的目的是提供一种人源丝氨酸蛋白酶抑制因子重组多肽及其制备方法。本发明通过构建人源丝氨酸蛋白酶抑制因子Hespintor原核表达载体，优化重组蛋白表达，改善重组蛋白纯化，鉴定重组蛋白活性，其重组多肽可以抑制胰蛋白酶的蛋白活性及人肝癌细胞株SMMC-7721的增殖活性，为人源丝氨酸蛋白酶抑制因子重组多肽抗肿瘤应用奠定基础，可望形成新的抗肿瘤治疗药物。
本发明的人源丝氨酸蛋白酶抑制因子Hespintor是利用SSH技术研究乙型肝炎病毒DNA聚合酶反式调节作用，从人肝母细胞瘤HepG2细胞中筛选得到的基因，经Real-TimePCR验证后，结合生物信息学方法确定该基因是一种新的Kazal型Serpin。氨基酸序列同源的Serpin基本结构。
本发明通过RT-PCR于HepG2细胞总RNA获得Hespintor cDNA，该基因具有SEQ IDNo.1中的核苷酸序列，该序列全长285bp。
本发明的人源丝氨酸蛋白酶抑制因子Hespintor基因编码的氨基酸序列具有SEQ IDNo.2的序列，由94个氨基酸组成。本发明Hespintor多肽全长包括三部分：信号肽（1-23aa）、连接区（24-34aa）和Kazal结构域（35-94aa)。真正起蛋白活性的是Kazal结构域，即为本发明的重组多肽。
本发明的重组多肽制备方法如下：
(1)重组多肽基因的获取：利用RNAiso Plus从HepG2细胞中提取总RNA，进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。以HepG2细胞总RNA为模板，利用TaKaRa RNA LA PCR Kit，先逆转录合成cDNA，再以cDNA为模板，PCR扩增重组多肽基因片段RNA并反转录为cDNA，设计引物，序列如下：
Forward：5’-GGATCCGCCTAAGCCCCG-3’；
Reverse：5’-GCGCAAGCTTATCACATTTTCCATATTTTTC-3’；
Forward中GGATCC及Reverse中AAGCTT为酶切位点碱基序列，其中GGATCC为BamHⅠ酶切位点，AAGCTT为HindⅢ酶切位点；
(2)重组多肽基因的克隆与鉴定：利用TaKaRa DNA Ligation Kit，将回收的重组多肽基因片段与pMD19-T载体连接，载体与DNA片段的摩尔比为1:3；将连接后的产物后转化至JM109感受态细胞中，涂布LB/Amp/X-Gal/IPTG筛选平板，培养；挑取阳性菌落进行菌落PCR对目的基因进行序列鉴定；取菌落PCR鉴定为阳性的菌液，培养后，提取质粒，BamHⅠ、HindⅢ进行双酶切鉴定；
(3)重组多肽基因的克隆与鉴定：
将Hespintor/pMD19-T载体与pET-40b(+)载体分别进行BamHⅠ、HindⅢ双酶切；后按载体与插入片段摩尔比1:3，对载体和片段进行连接，将连接后产物转化至E.coli Rosetta(DE3)中，涂于LB（Cam+、Kana+）琼脂平板上培养，取菌体PCR鉴定为阳性的菌液，培养后，提取质粒，以BamHⅠ、HindⅢ进行双酶切鉴定；
(4)挑取阳性克隆的单菌落Rosetta(DE3)/Hespintor/pET-40b(+)于LB（Cam+、Kana+）培养液中培养，当OD600=0.6-0.8时，加入IPTG，诱导表达，得菌液；
(5)取菌液，离心，弃上清，加入Lysis Buffer，用尿素洗涤缓冲液洗涤，得到包涵体沉淀，将所得包涵体沉淀用尿素缓冲液重悬，离心，取上清液，即为柱前蛋白液；
(6)利用蛋白亲和层析柱纯化柱前蛋白液，以0.3M NaCl,20mM Tris,300mM imidazole,pH8.0，为流动相，收集280nm吸收峰处的目的多肽，得到丝氨酸蛋白酶抑制因子重组多肽，其氨基酸序列具有SEQ ID No.235-94aa的序列；
本发明所述Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制因子Hespintor基因通过Motif Scan分析表明Hespintor基因有一个Kazal型Serpin结构域，位于35-94aa。该结构域一般由50～60个氨基酸残基组成，其中包括一个较为保守的序列模体和6个半胱氨酸残基：CⅠ—X（1-7）—CⅡ—X（5）—PVCⅢG—X（4）—TY—X—N—X—CⅣ—X（2-6）—CⅤ—X（9-17）—CⅥ（X与括号内的数字分别表示任意残基和残基的数目）。Hespintor在基本结构上与其它Kazal家族成员既有相似性又有独特性。结合SignalP分析可知，Hespintor基因结构包括3部分：N端l-23aa构成信号肽，表明其具有分泌到细胞外的性质，并符合PSORTⅡ预测Hespintor亚细胞定位于细胞外的结果；C端35-94aa构成成熟肽（即一个典型的Kazal结构域）；在信号肽与成熟肽之间的24-34aa构成了连接区。通过SWISS-MODEL预测发现Hespintor结构主要由螺旋和折叠组成。
Hespintor基因的开放读码框架（ORF）长度为285bp，编码产物由94aa组成，具有SEQ ID No.2的氨基酸序列。通过Unigene数据库分析发现，Hespintor基因定位于人类5号染色体长臂3区3带1亚带（5q33.1）。
本发明所公开的丝氨酸蛋白酶抑制因子重组多肽优点在于①具有人源性特点，可在不影响疗效的前提下，减少化疗药物的用量，降低其毒副作用；②由60个氨基酸组成的小分子多肽，一旦应用于临床将最大程度地减少降低机体免疫排斥反应；③抑制uPA活性最为直接和有效。由于肿瘤细胞分泌的uPA是肿瘤局部浸润和/或形成远处转移的限速步骤，因此该重组多肽作为化疗替代药物的临床应用前景是显而易见的。
附图说明
图1为原核表达菌液粗提重组多肽图，泳道1：Rosetta(DE3)本底表达；泳道2：Rosetta(DE3)/pET-40b(+)空载诱导；泳道M：Marker；泳道3：Rosetta(DE3)/Hespintor/pET-40b(+)未诱导；泳道4：Rosetta(DE3)/Hespintor/pET-40b(+)诱导；
图2为原核表达纯化重组多肽图，泳道M：Marker；泳道1：全菌沉淀；泳道2：柱前重组多肽液；泳道3，4：柱后重组多肽液；
图3为纯化重组多肽对胰蛋白活性的抑制作用图；
图4为MTT法检测纯化重组多肽对人肝癌细胞株SMMC-7721增殖的抑制作用图。
具体实施方式
以下实施例子进一步解释本发明的内容，但并不用以限制本发明。
实施例1：所述重组多肽基因的克隆与鉴定
其具体方法如下：
（1）重组多肽基因的获取：利用RNAiso Plus从HepG2细胞中提取总RNA，进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。以HepG2细胞总RNA为模板，利用TaKaRa RNA LA PCR Kit，先逆转录合成cDNA，再以cDNA为模板，PCR扩增重组多肽基因片段。
设计PCR扩增引物如下（下划线示酶切位点碱基序列）：
Forward：5’-GGATCCGCCTAAGCCCCG-3’
Reverse：5’-GCGCAAGCTTATCACATTTTCCATATTTTTC-3’
其中GGATCC为BamHⅠ酶切位点，AAGCTT为HindⅢ酶切位点。引物由宝生物工程（大连）公司合成。
PCR反应体系：
Figure BDA0000453493130000051
（2）重组多肽基因的克隆与鉴定，与pMD19-T载体：
①重组多肽基因的克隆：利用TaKaRa DNA Ligation Kit，将回收的重组多肽基因片段与pMD19-T载体连接过夜，载体与DNA片段的摩尔比为1:3。
连接反应体系：
Figure BDA0000453493130000052
16℃反应过夜。
转化至JM109感受态细胞中，涂布LB/Amp/X-Gal/IPTG筛选平板，37℃倒置培养过夜，第二日观察平板上单菌落的生长情况。
②重组多肽基因的鉴定：
a挑取阳性菌落进行菌落PCR对目的基因进行序列鉴定，并在LB（Cam+、Kana+）平板上划线拷贝。扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，观察是否得到预期大小的基因片段。
b取菌落PCR鉴定为阳性的菌液，进行37℃，200rpm/min振荡培养12h后，取1mL培养菌液，试剂盒提取质粒，溶解后以BamHⅠ、HindⅢ进行双酶切鉴定。
（3）重组多肽基因的克隆与鉴定，与pET-40b(+)载体：
①酶切：将Hespintor/pMD19-T载体与pET-40b(+)载体分别进行BamHⅠ、HindⅢ双酶切。
酶切反应体系：
Figure BDA0000453493130000061
37℃反应1h。
Figure BDA0000453493130000062
37℃反应1h。
②连接：按载体与插入片段摩尔比1:3计算所用载体和目的基因片段，对载体和片段进行连接。
连接反应体系：
Figure BDA0000453493130000063
25℃连接1h。
连接后转化至E.coli Rosetta(DE3)，涂于LB（Cam+、Kana+）琼脂平板，同时做阴性对照（转化空载体）。37℃倒置培养过夜，第二日观察平板上单菌落的生长情况。
③对Hespintor/pET-40b(+)重组载体的鉴定
a）挑选阳性菌落，进行菌落PCR鉴定重组表达菌株Rosetta(DE3)/Hespintor/pET-40b(+)，并在选择性LB平板上划线拷贝。扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，观察是否得到预期大小的基因片段。
b）取菌体PCR鉴定为阳性的菌液，进行37℃，200rpm/min振荡培养12h后，取1mL培养菌液，试剂盒提取质粒，溶解后以BamHⅠ、HindⅢ进行双酶切鉴定。
实施例2：Hespintor重组多肽表达菌株的诱导表达与纯化
（1）Rosetta(DE3)/Hespintor/pET-40b(+)诱导表达：
挑取阳性克隆的单菌落Rosetta(DE3)/Hespintor/pET-40b(+)接种于800μL LB（Cam+、Kana+）培养液中，37℃，200rpm，8h。1:50接种至40mL LB（Cam+、Kana+）培养液中，至OD600=0.6-0.8时，加入终浓度为0.25mmol/L的IPTG，30℃诱导表达培养5h。取1mL菌液离心，用100μL无菌水重悬菌体，取100μL菌液上清，分别加入25μL5×SDS上样缓冲液，100℃煮沸5min，12000g，2min去沉淀。取样20μL进行12%SDS-PAGE电泳检测，以未诱导的Rosetta(DE3)/Hespintor/pET-40b(+)菌液和Rosetta(DE3)/pET-40b(+)诱导菌液作为对照。
（2）获得柱前蛋白液：将诱导后的菌液取出，4℃，8000rpm离心，20min。弃上清，按20mL:1g湿菌重加入Lysis Buffer，冰上轻摇放置1h，100rpm。高速离心弃上清。依次用2M尿素洗涤缓冲液，4M尿素洗涤缓冲液对沉淀进行洗涤，每次洗涤均冰上孵育30min。将所得包涵体沉淀用8M尿素上样缓冲液重悬（每g包涵体加入20mL8M尿素溶液），4℃过夜。高速离心，取上清过0.45μm膜，抽滤脱气备用。
按GE公司6×His组氨酸标签蛋白亲和层析纯化操作对包涵体溶液（即柱前蛋白液）进行纯化，用Binding Buffer平衡Ni柱，平衡后低速上样1mL柱前蛋白液，整个过程4℃操作。上样后继续用Binding Buffer洗平基线，用Refolding Buffer20倍柱体积对柱上蛋白进行复性，最后用Elution Buffer洗脱，收集280nm吸收峰处的目的蛋白（即柱后蛋白液）。取柱前蛋白液及柱后蛋白液各40μL，加入10μL5×SDS上样缓冲液，100℃煮沸5min，取10μL上样，进行SDS-PAGE检测分析。
所需试剂：
Lysis Buffer:（50mM Tris,2mM EDTA,1%Triton X-100,0.1M NaCl,1mg/mL lysozyme pH8.0）
2M Urea Washing Buffer:（2M Urea,50mM Tris,0.5M NaCl,2%Triton X-100,pH8.0）
4M Urea Washing Buffer:（4M Urea,50mM Tris,0.5M NaCl,2%Triton X-100,pH8.0）
8M Urea Binding Buffer:（8M Urea,1mM EDTA,100mMβ-ME,50mM Tris,40Mm imidazole,pH8.0）
Refolding Buffer:（0.3M NaCl,20mM Tris,40mM imidazole,pH8.0）
Elution Buffer:（0.3M NaCl,20mM Tris,300mM imidazole,pH8.0）
实施例3Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制因子Hespintor重组多肽对胰蛋白酶酶活的抑制作用
所得柱后蛋白液以BCA蛋白浓度测定试剂盒（北京赛驰生物有限公司）测定蛋白浓度。用含0.4%CaCl2的0.1M Tris缓冲液（pH8.0）调节蛋白浓度至0.2mg/mL，取一定量与100μL0.1mg/mL的胰蛋白酶（Sigma）反应，37℃，10min。加入反应底物300μL1mg/mL BAPNA，37℃，10min。加入30%冰醋酸终止反应，室温离心，8000g，3min。以分光光度计检测A410nm数值。以不加入重组多肽为阴性对照。按该方法，以含有2.5μg、5μg、10μg、20μg、30μg、40μg、50μg重组多肽液进行重组多肽抑制作用的剂量效应分析。
结果：当10μg Hespintor重组多肽与10μg胰蛋白酶作用时，Hespintor重组多肽可以抑制30.99%的胰蛋白酶活性。当Hespintor重组多肽的质量与胰蛋白酶的质量比为1:4、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1时，胰蛋白酶活性抑制率分别为2.28%、12.37%、30.99%、45.72%、52.29%、59.18%、70.32%。
实施例4
MTT法检测细胞琥珀酸脱氢酶活性，以此判断纯化Hespintor重组多肽对人肝癌细胞株SMMC-7721增殖的抑制作用
取对数生长期的SMMC-7721细胞，调整其密度为4×104/mL，接种于96孔培养板，每孔体积200μL，待细胞贴壁后，实验组加入终浓度为1.0μg/mL、2.0μg/mL、4.0μg/mL、8.0μg/mL、12.0μg/mL、16.0μg/mL的Hespintor重组多肽，另设不加药物的阴性对照组，顺铂（Cisplatin，DDP）阳性对照组和无细胞的控制组，每个药物浓度设5个平行孔。分别培养48h和72h，于终止前4h每孔加入5mg/mL MTT溶液20μL，继续孵育4h后弃上清，加入150μL DMSO，轻轻震荡10min，使结晶完全溶解，在酶标仪上570nm波长处测吸光值。
计算方法：细胞存活率=（实验组OD值－控制组OD值）/（阴性对照组OD值－控制组OD值）×100%。

Claims (7)

1.一种丝氨酸蛋白酶抑制因子重组多肽，其特征在于：重组多肽全序列见序列表SEQ IDNo.235-94aa。
2.如权利要求2所述的重组多肽，其特征在于：重组多肽由60个氨基酸组成。
3.一种丝氨酸蛋白酶抑制因子多肽，其特征在于：多肽全序列见序列表SEQ ID No.2，其中1-23aa处为信号肽区域、24-34aa处为连接区域和35-94aa处为重组多肽区域。
4.如权利要求3所述的多肽，其特征在于：多肽由94个氨基酸组成。
5.一种权利要求1所述的氨酸蛋白酶抑制因子重组多肽的制备方法如下：
(1)重组多肽基因的获取：从HepG2细胞中提取总RNA，反转录为cDNA，设计引物，序列如下：
Forward：5’-GGATCCGCCTAAGCCCCG-3’；
Reverse：5’-GCGCAAGCTTATCACATTTTCCATATTTTTC-3’；
其中GGATCC为BamHⅠ酶切位点，AAGCTT为HindⅢ酶切位点；
PCR扩增，得到重组多肽基因片段，基因全序列见序列表SEQ ID No.1；
(2)重组多肽基因的克隆与鉴定：重组多肽基因片段与pMD19-T载体连接，载体与DNA片段的摩尔比为1:3；将连接后的产物后转化至JM109感受态细胞中，培养后提取质粒，BamHⅠ、HindⅢ进行双酶切鉴定；
(3)重组多肽基因的表达：
将Hespintor/pMD19-T载体与pET-40b(+)载体分别进行BamHⅠ、HindⅢ双酶切；后按载体与插入片段摩尔比1:3，对载体和片段进行连接，将连接后产物转化至E.coli Rosetta(DE3)中，培养，培养后，提取质粒，以BamHⅠ、HindⅢ进行双酶切鉴定；
挑取阳性克隆的单菌落Rosetta(DE3)/Hespintor/pET-40b(+)于LB（Cam+、Kana+）培养液中培养，当OD600=0.6-0.8时，加入IPTG，诱导表达，得菌液；
(4)取菌液，离心，弃上清，用尿素洗涤缓冲液洗涤，得到包涵体沉淀，将所得包涵体沉淀用尿素缓冲液重悬，离心，取上清液，即为柱前蛋白液；
(5)利用蛋白亲和层析柱纯化柱前蛋白液，以0.3M NaCl,20mM Tris,300mM imidazole,pH8.0，为流动相，收集280nm吸收峰处的目的多肽，得到丝氨酸蛋白酶抑制因子重组多肽，重组多肽全序列见序列表SEQ ID No.2中35-94aa处。
6.权利要求1所述的丝氨酸蛋白酶抑制因子重组多肽在制备抑制胰蛋白酶药物中的应用。
7.权利要求1所述的丝氨酸蛋白酶抑制因子重组多肽在制备抑制肿瘤药物中的应用。
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