CN103756999A

CN103756999A - 一种适用于从鱼血液中快速提取基因组dna的方法

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Publication number: CN103756999A
Application number: CN201410053143.9A
Authority: CN
Inventors: 闫学春; 栾培贤
Original assignee: Heilongjiang River Fisheries Research Institute of Chinese Academy of Fishery Sciences
Current assignee: Heilongjiang River Fisheries Research Institute of Chinese Academy of Fishery Sciences
Priority date: 2014-02-17
Filing date: 2014-02-17
Publication date: 2014-04-30
Anticipated expiration: 2034-02-17
Also published as: CN103756999B

Abstract

一种适用于从鱼血液中快速提取基因组DNA的方法，它涉及一种提取基因组DNA的方法。本发明要解决现有从鱼血液中提取基因组DNA的过程中存在提取过程繁琐、成本高、提取的基因组DNA纯度不高及保存时间短的问题。本发明过程：一、鱼血液样本制备：将于血液加入裂解液中混合均匀，得到鱼血液样本，裂解液中EDTA摩尔浓度为90～110mmol/L；二、鱼血液样本消化处理后，经酚-氯仿-异戊醇混合液抽提，离心后得上清液再经氯仿-异戊醇混合液抽提，得血液基因组DNA消化液；三、用无水乙醇将DNA消化液沉淀，沉淀再经70%乙醇洗涤，干燥后得鱼血液基因组DNA沉淀，即完成提取DNA的过程。本发明应用在基因技术领域。

Description

一种适用于从鱼血液中快速提取基因组DNA的方法

技术领域

本发明涉及一种提取基因组DNA的方法。

背景技术

血液是流动在心脏和血管内的不透明红色液体，主要成分为血浆和血细胞，属于结缔组织。从血液中提取高质量DNA，通过对DNA的分析，来帮助科研人员更好的开展生物学领域的工作。基因组DNA的提取是鱼类基因工程技术和相关科研中的关键步骤。尤其对于转基因鱼的检测来讲，往往不同组织来源的DNA质量存在显著差别，是制约后续转基因鱼检测的重要因素。我们分别从血液、鳍条、肌肉、肝脏中提取DNA，提取的方法各有不同。

现有从鱼血液中提取基因组DNA的方法为将收集到的血液加入到裂解液中，经过膜透析进行净化后，进行基因组DNA的提取和检测等生物学活动。而此种从鱼血液基因组DNA的提取方法，在膜透析过程中会使基因组DNA造成降解和损失，众所周知基因组DNA是维持生物的生命活动中的基础，科研人员通过对基因组DNA的检测和分析才能更完整、准确的确定生物的生命活动以便于对以后的科学发展起到推动作用。若是在基因组DNA的的提取过程中基因组DNA有降解和损失，那么会对以后科学检测和分析造成相当大的影响。

现有利用膜透析的方法在基因组DNA的提取的过程中存在提取的基因组DNA量不高，过程繁琐，保存时间短的问题。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有从鱼血液中提取基因组DNA的过程中存在提取过程繁琐、成本高、提取的基因组DNA纯度不高及保存时间短的问题，而提供一种适用于从鱼血液中快速提取基因组DNA的方法。

本发明适用于从鱼血液中快速提取基因组DNA的方法，按照下述步骤进行：

一、鱼血液样本制备：

①、采用一次性无菌注射器在鱼的尾部位提取血液0.1mL～0.2mL；

②、将步骤①中取到的血液20μL～30μL加入到含有800μL裂解液的离心管中，反复颠倒至混合均匀为止，得到鱼血液样本；

其中，所述的裂解液中EDTA的摩尔浓度为90mmol/L～110mmol/L，裂解液中Protainase K的摩尔浓度为100μg/mL～200μg/mL，裂解液中十二烷基肌氨酸钠的质量浓度0.5%，裂解液pH为8.0；

二、将含有步骤一中得到的鱼血液样本的离心管置于温度为55℃水浴中消化1h～1.5h，然后用酚-氯仿-异戊醇混合液抽提2次，在10000r/min的条件下离心6min～7min，得到上清液A，再在上清液A中加入与上清液A等体积的氯仿-异戊醇混合液抽提1次，在10000r/min的条件下离心6min～7min，得到上清液B，上清液B为血液基因组DNA消化液；

其中，所述的酚-氯仿-异戊醇混合液中酚、氯仿和异戊醇的体积比为25:24:1，所述的氯仿-异戊醇混合液中氯仿与异戊醇的体积比为24:1；所述的酚-氯仿-异戊醇混合液与鱼血液样本的体积比为1:1；

三、在温度为-20℃的条件下，将无水乙醇加入到步骤二得到的血液基因组DNA消化液中进行沉淀，沉淀时间为2h～4h，然后在12000r/min的条件下离心15min～20min，得到沉淀，再将得到的沉淀用质量百分含量为70%的乙醇洗涤1次，洗涤后在7500r/min的条件下离心5min～6min，弃上清液后干燥，得到鱼血液基因组DNA沉淀，即完成从鱼血液中提取基因组DNA的过程；其中，所述的无水乙醇与血液基因组DNA消化液的体积比为2:1。

EDTA（乙二胺四乙酸二纳盐），具有抗凝和抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用。本发明打破了传统的提取DNA方法中对EDTA使用的认识，传统的方法使用的EDTA浓度是500mmol/L进行DNA的提取，虽然提取的DNA浓度高且保存时间长，但提取的DNA由于被糖包裹着非常粘，必须要经过透析，才能沉淀DNA，且在透析过程中，DNA容易降解和损失。

本发明的有益效果：

本发明制备的鱼类血液组织样品可在低温冰箱中长期保存，可根据自己的时间随时提取，简便、快速，价格低廉，提取的DNA也可直接沉淀，不需要经过透析DNA等繁琐步骤。通过紫外分光光度检测和琼脂糖凝胶电泳分析，能获得产率和纯度符合要求的DNA样品。也避免了因为使用肝素抗凝，而在PCR中抑制Taq酶活性的问题。

1、本发明使用浓度为90mmol/L～100mmol/L的EDTA提取DNA，又因为在提取过程中不用透析，从而简化了提取基因组DNA的过程，不会造成基因组DNA的降解和损失，保证了基因组DNA纯度，用本发明提取的DNA片段分子量可在21kb以上，在所测的鱼样品中OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值在1.70～1.90之间，达到各种后继实验的要求。

2、在成本上与传统用试剂盒法提取的基因组DNA相比，本发明提取的基因组DNA的方法要降低了50%～60%，适合大批量的实验研究。

3、将用本发明提取的基因组DNA保存在-80℃的冰箱中，可持续保存12～18月，本发明提取的基因组DNA经保存12月后，在后续的检测过程中仍然不会出现降解和缺失的问题。

附图说明

图1采用本发明提取的鱼血液基因组DNA的1.0%琼脂糖凝胶电泳跑胶图图片，M为Marker DL2000，1～3为鲤鱼的血液基因组DNA，4～6为鲫鱼的血液基因组DNA，7～10为鳜鱼的血液基因组DNA；

图2采用透析方法提取的鱼血液基因组DNA的1.0%琼脂糖凝胶电泳跑胶图图片，M为Marker DL2000，1～2为鲤鱼的血液基因组DNA，3～4为鲫鱼的血液基因组DNA，5～6为鳜鱼的血液基因组DNA；

图3是利用引物HLJ1284对鲤鱼的血液基因组DNA进行PCR扩增，得到的扩增图图片；

图4是利用引物HLJ549对鲤鱼的血液基因组DNA进行PCR扩增，得到的扩增图图片；

图5是利用引物HLJ1123对鲫鱼的血液基因组DNA进行PCR扩增，得到的扩增图图片；

图6是利用引物HLJ519对鲫鱼的血液基因组DNA进行PCR扩增，得到的扩增图图片；

图7是利用引物GF863045对鳜鱼的血液基因组DNA进行PCR扩增，得到的扩增图图片；

图8是利用引物GF863047对鳜鱼的血液基因组DNA进行PCR扩增，得到的扩增图图片。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式中一种适用于从鱼血液中快速提取基因组DNA的方法，按照下述步骤进行：

一、鱼血液样本制备：

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一的不同之处在于，步骤一①中所述的鱼的品种为鲤鱼、鲫鱼、鳜鱼、草鱼、鲢鱼、虹鳟、金鳟、白点鲑、山女鳟、黄颡、德国镜鲤、青海湖裸鲤或乌苏里拟鲿。其它参数与具体实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二的不同之处在于，步骤一①中所述的一次性无菌注射器为0.5mL、1mL或2mL的一次性无菌注射器。其它参数与具体实施方式一或二相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一的不同之处在于，步骤一②中所述的离心管的规格为2mL的离心管。其它参数与具体实施方式一至三之一相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一的不同之处在于，步骤一②中所述的裂解液中EDTA的摩尔浓度为100mmol/L，裂解液中Protainase K的摩尔浓度为200μg/mL。其它参数与具体实施方式一至三之一相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一的不同之处在于，步骤三中所述的弃上清液后干燥的方法为室温条件下干燥15min～30min，或者为在4℃的冰箱中干燥12h～14h。其它参数与具体实施方式一至五之一相同。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一的不同之处在于，步骤三中所述的沉淀时的条件温度为-20℃和沉淀时间为2h。其它参数与具体实施方式一至六之一相同。

具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七之一的不同之处在于，步骤三中所述的鱼血液基因组DNA沉淀用100μL1×TE中后，可在-20℃的条件下保存。其它参数与具体实施方式一至七之一相同。

具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一至八之一的不同之处在于，步骤一②所述的Protainase K为蛋白酶K，Protainase K购买于美国Sigma公司。其它参数与具体实施方式一至七之一相同。

通过以下实施例验证本发明的有益效果：

实施例1：本实施例中一种适用于从鱼血液中快速提取基因组DNA的方法，按下述步骤实现：

一、鱼血液样本制备：

①、采用1mL一次性无菌注射器在鱼的尾部位提取血液0.1mL～0.2mL；

②、将步骤①中取到到的血液20μL加入到含有800μL裂解液的2mL离心管中，反复颠倒至混合均匀为止，得到鱼血液样本；

其中，所述的裂解液中EDTA的摩尔浓度为100mmol/L，裂解液中Protainase K的摩尔浓度为200μg/mL，裂解液中十二烷基肌氨酸钠的质量浓度0.5%，裂解液的pH为8.0；

二、将含有步骤一中得到的鱼血液样本的离心管置于温度为55℃水浴中消化1h，用酚-氯仿-异戊醇混合液抽提2次，在10000r/min的条件下离心6min，得到上清液A，再在上清液A中加入与上清液A等体积的氯仿-异戊醇溶液抽提1此，在10000r/min的条件下离心6min，得到上清液B，上清液B为血液基因组DNA消化液；

三、在温度为-20℃的条件下，将400μL无水乙醇加入到步骤二得到的200μL DNA消化液进行沉淀，沉淀时间为2h，然后在12000r/min的条件下离心15min，得到沉淀，再将得到的沉淀用浓度为70%的乙醇洗涤，洗涤后在7500r/min的条件下离心5min，室温条件下干燥15min，得到鱼血液基因组DNA沉淀，即完成从鱼血液中提取基因组DNA的过程。

本实施例步骤一②所述的Protainase K(蛋白酶K)购买于美国Sigma公司。

本实施例中步骤二中所述的鱼的品种为鲤鱼。

用100μL1×TE溶解本实施例得到的鲤鱼的血液基因组DNA沉淀，取出2μL浓度为0.6-1μg/μl的鲤鱼的血液基因组DNA-TE，用1%的琼脂糖胶电泳检测，得到图1。

采用血液透析方法制备与基因组DNA，1%的琼脂糖胶电泳检测，得图2，图1和图2结合可以看出，与图2中的鲤鱼的血液基因组DNA（1-2条带）相比，图1中鲤鱼的血液基因组DNA（1～3条带），DNA条十分带清晰，分辨率高，重复性好，稳定性高。

以本实施例提取的鲤鱼的血液基因组DNA为模板，测定并稀释到浓度为30～50ng/μL为止，取出1μL浓度为30～50ng/μL的鲤鱼的血液基因组DNA-TE，分别利用引物HLJ1284和引物HLJ549进行PCR扩增，得到扩增图图片图3和扩增图图片图4。

从PCR的扩增图图片图3和PCR扩增图图片图4，可以看出DNA条十分带清晰，分辨率高，重复性好，稳定性高。

引物HLJ1284的序列如下

上游引物：CGCTTTGTGCAGGAGTGTAA

下游引物：CCTCCAGACCTGAGAGAGCA

引物HLJ549的序列如下

上游引物：GCTAACTGCCATTCTTCTG

下游引物：CTGGGTTTCCACATCCTT

实施例2：本实施例中一种适用于从鱼血液中快速提取基因组DNA的方法，按下述步骤实现：

一、鱼血液样本制备：

三、在温度为-20℃的条件下，将400μL无水乙醇加入到步骤二得到的200μL DNA消化液进行沉淀，沉淀时间为3h，然后在12000r/min的条件下离心18min，得到沉淀，再将得到的沉淀用浓度为70%的乙醇洗涤，洗涤后在7500r/min的条件下离心6min，室温条件下干燥20min，得到鱼血液基因组DNA沉淀，即完成从鱼血液中提取基因组DNA的过程。

本实施例中步骤二中所述的鱼的品种为鲫鱼。

用100μL1×TE溶解本实施例得到的鲫鱼的血液基因组DNA沉淀，取出1-2μL浓度为0.6-1μg/μl的鲫鱼的血液基因组DNA-TE，用1.0%的琼脂糖胶电泳检测，得到图1。

采用血液透析方法制备与基因组DNA，1%的琼脂糖胶电泳检测，得图2，图1和图2结合可以看出，与图2中的鲤鱼的血液基因组DNA（3-4条带）相比，图1中鲤鱼的血液基因组DNA（4-6条带），DNA条十分带清晰，分辨率高，重复性好，稳定性高。

以本实施例提取的鲫鱼的血液基因组DNA为模板，测定并稀释到浓度为30-50ng/μl为止，取出1μL浓度为30-50ng/μL的鲫鱼的血液基因组DNA-TE，分别利用引物HLJ1123和引物HLJ519进行PCR扩增，得到扩增图图片图5和扩增图图片图6。

从PCR的扩增图图片图5和PCR扩增图图片图6，可以看出DNA条十分带清晰，分辨率高，重复性好，稳定性高。

引物HLJ1123的序列如下：

上游引物：GACGATCAGGGGACAGAGAA

下游引物：CTTGGAATGAGGAGCACGTT

引物HLJ519的序列如下：

上游引物：CTGCTGGCTTCTATTTATT

下游引物：GTGTTACTATGGCGGTGT

实施例3：本实施例中一种适用于从鱼血液中快速提取基因组DNA的方法，按下述步骤实现：

一、鱼血液样本制备：

②、将步骤①中取到到的血液30μL加入到含有800μL裂解液的2mL离心管中，反复颠倒至混合均匀为止，得到鱼血液样本；

三、在温度为-20℃的条件下，将400μL无水乙醇加入到步骤二得到的200μL DNA消化液进行沉淀，沉淀时间为2.5h，然后在12000r/min的条件下离心15min，得到沉淀，再将得到的沉淀用浓度为70%的乙醇洗涤，洗涤后在7500r/min的条件下离心5min，室温条件下干燥20min，得到鱼血液基因组DNA沉淀，即完成从鱼血液中提取基因组DNA的过程。

本实施例中步骤二中所述的鱼的品种为鳜鱼。

用100μL1×TE溶解本实施例得到的鳜鱼的血液基因组DNA沉淀，取出1～2μL浓度为0.6-1μg/μl的鳜鱼的血液基因组DNA-TE，用1%的琼脂糖胶电泳检测，得到图1。

采用血液透析方法制备与基因组DNA，1%的琼脂糖胶电泳检测，得图2，图1和图2结合可以看出与图2中的鲤鱼的血液基因组DNA（7-10条带）相比，图1中鲤鱼的血液基因组DNA（5～6条带），DNA条十分带清晰，分辨率高，重复性好，稳定性高。

以本实施例提取的鳜鱼的血液基因组DNA为模板，测定并稀释到浓度为30～50ng/μl为止，取出1μL浓度为30～50ng/μl的鳜鱼的血液基因组DNA-TE，分别利用引物GF863045和引物GF86304进行PCR扩增后，用1.4%琼脂糖凝胶凝胶电泳检测，得到扩增图图片图7和扩增图图片图8。

从PCR的扩增图图片图7和PCR扩增图图片图8，可以看出DNA条十分带清晰，分辨率高，重复性好，稳定性高。

引物GF863045的序列如下：

上游引物：CACCACTGCTGCACATGGATA

下游引物：GAGGACCTGCCTTCAGATGC

引物GF863047的序列如下：

上游引物：CCACAGGACGGTAGGACTGT

下游引物：AAGACCGTGACCGAGGTGAT。

Claims

1.一种适用于从鱼血液中快速提取基因组DNA的方法，其特征在于适用于从鱼血液中快速提取基因组DNA的方法，按照下述步骤进行：

一、鱼血液样本制备：

2.根据权利要求1所述的一种适用于从鱼血液中快速提取基因组DNA的方法，其特征在于步骤一①中所述的鱼的品种为鲤鱼、鲫鱼、鳜鱼、草鱼、鲢鱼、虹鳟、金鳟、白点鲑、山女鳟、黄颡、德国镜鲤、青海湖裸鲤或乌苏里拟鲿。

3.根据权利要求1所述的一种适用于从鱼血液中快速提取基因组DNA的方法，其特征在于步骤一①中所述的一次性无菌注射器为0.5mL、1mL或2mL的一次性无菌注射器。

4.根据权利要求1所述的一种适用于从鱼血液中快速提取基因组DNA的方法，其特征在于步骤一②中所述的离心管的规格为2mL的离心管。

5.根据权利要求1所述的一种适用于从鱼血液中快速提取基因组DNA的方法，其特征在于步骤一②中所述的裂解液中EDTA的摩尔浓度为100mmol/L，裂解液中Protainase K的摩尔浓度为200μg/mL。

6.根据权利要求1所述的一种适用于从鱼血液中快速提取基因组DNA的方法，其特征在于步骤三中所述的弃上清液后干燥的方法为室温条件下干燥15min～30min，或者为在4℃的冰箱中干燥12h～14h。

7.根据权利要求1所述的一种适用于从鱼血液中快速提取基因组DNA的方法，其特征在于步骤三中所述的沉淀时的条件温度为-20℃和沉淀时间为2h。