CN103732745A

CN103732745A - 识别热量限制标记物和热量限制模拟物

Info

Publication number: CN103732745A
Application number: CN201280039802.2A
Authority: CN
Inventors: A·玛斯塔咯迪斯; S·伍德; T·A·波拉; J·L·巴杰; R·温德鲁奇; J·昌
Original assignee: NSE Products Inc
Current assignee: NSE Products Inc
Priority date: 2011-06-15
Filing date: 2012-06-15
Publication date: 2014-04-16
Also published as: WO2012174484A2; US20160257996A1; JP2014518071A; JP7355766B2; KR20140041710A; US20160208330A1; CN113801878A; JP2019037240A; JP2022113834A; CN107217051A; JP2021052803A; WO2012174484A3; JP6904676B2; US20160186257A1; EP2721155A4; EP2721155A2; JP2016195613A; US20130178379A1

Abstract

通过使动物暴露于CR条件和多个对象组中选择在响应CR条件差异表达的一种或多种基因，可在选定组织中识别热量限制（CR）标记物。通过将经所述候选化合物处理的动物与经过CR的动物中的基因表达产物的组织水平进行比较，可筛选在被给予动物时可能具有模拟CR效果能力的候选化合物。

Description

识别热量限制标记物和热量限制模拟物

政府权利

本发明在美国国家卫生研究院国家老龄问题研究所（National Institute on Agingof the National Institutes of Health）授予基金号1R43AG034833-01A1的政府支持下完成。政府拥有本发明的某些权利。

发明领域

本发明总体上涉及识别通用热量限制生物标记物——包括组织特异性的通用热量限制生物标记物——的方法。具体地，本发明提供稳健的随热量限制经历表达变化的基因小组（panels of genes）以及这些通用生物标记物对于识别可引起热量限制的有益效果的营养物、药物或其他功能性成分（即，“热量限制模拟物”）的应用。

发明背景

从生命早期或中年开始，随意水平以下的热量摄入限制（CR）已经显示出使多个物种——包括哺乳动物，如啮齿动物——的寿命增加；和防止或延迟多种年龄相关状况的开始。事实上，已经开始临床试验，测试CR提高人类健康参数的能力。但是，食物剥夺的社会学、生物学和心理学效果不容许这种饮食方案的广泛实施。因此，研究已经聚焦于识别能够在无热量摄入减少的情况下模拟CR的有益效果的物质。多项工作已经涉及识别模拟CR的一种或多种生理或生化效果的化合物，包括发现在动物或细胞暴露于这些试剂后可模拟CR的全基因表达概况的化合物。关于后者，基于基因表达概况的全局改变识别模拟CR的化合物的方法已被公开（Spindler等，美国专利号6,406,853）。

尽管这种方法具有可用性，但在所测试小鼠模型中还未识别出通用的、组织特异性的CR生物标记物小组。由于不同小鼠品系具有独有的遗传、代谢和生理特征，不可能使任意具体小鼠品系中响应CR的任意给定基因表达变化在其他小鼠品系或生物体内再现。因此，至今仍无已被识别的可用标记物。

发明概述

本公开所提出的技术克服了现有技术的不足，通过如下识别热量限制（CR）生物标记物：识别通用CR生物标记物——即，跨越多种不同的遗传多样性动物品系、与CR响应始终相关的标记物。识别通用CR生物标记物小组允许快速筛选模拟CR的化合物，与动物品系或品种无关，而且也无需全基因表达概况分析。

在一些实施方式中，本公开提供用于识别具体组织中的稳健并且普遍适用的CR基因表达标记物的系统和方法。一个实施方式提供响应CR在组织中差异表达的多核苷酸的基因小组。具体实施方式包括来自鼠科动物、犬科动物、猫科动物或人类组织的基因。另一方面，基因小组包括来自以下任一种的基因：肝组织、心脏组织、肺组织、脑组织、上皮组织、结缔组织、白脂肪、骨骼肌、血液、神经组织、尿液和唾液。

在一些实施方式中，评估的基因是表1、表2、表3、表4、表5、表6或其任意组合中存在的一种或多种基因。在一些实施方式中，在CR对象和对照对象之间，小组中的基因呈现基因表达变化。在一些实施方式中，小组中的基因被选择是因为其经过多种CR动物模型的验证。

在一些实施方式中，本技术提供用于检测组织中通用CR标记物的差异表达的探针，其可包括与作为通用CR标记物的基因杂交的多核苷酸或结合由该基因编码的多肽的多肽结合剂。在另一实施方式中，组合物包括两种或更多种（例如，3或更多种、5或更多种、10或更多种、20或更多种、50或更多种等）多核苷酸或多肽探针。在更具体的方面中，多核苷酸来自心脏组织或骨骼肌或白脂肪组织。

在一个实施方式中，试剂盒可包括扩增寡核苷酸，其特异性杂交表1至6所列基因或其片段；和标记探针，其包括特异性杂交编码表1至6所列蛋白质的基因或其片段的多核苷酸。在具体实施方式中，探针结合于底物（例如，作为阵列的部分）。

在一些实施方式中，本发明提供通过确定在多种动物品系的选定组织中差异表达的一种或多种基因的表达概况来测定候选化合物模拟CR的效果的方法。

本公开来源于发明人建立的用于识别选定组织中通用CR生物标记物的稳健组的方法。在实施方式中，识别选定组织中组织特异性的通用热量限制（CR）标记物的方法包括如下步骤：使属于多个对象组的对象暴露于CR条件，和选择在来自多个对象组的对象中响应CR差异表达的一种或多种基因。选择的基因可以在至少两个或三个或更多个对象组中差异表达。在具体实施方式中，选择的基因在50%或更高的测试对象组中差异表达。根据实施方式，对象组可包括鼠科动物组、犬科动物组、猫科动物组或人类组。

在一些实施方式中，本发明提供评估给定条件或候选化合物是否能够在对象内有效模拟CR或一种或多种CR模拟物益处的方法。方法可包括使第一对象暴露于CR，测量来自第一对象的组织样品中的两种或更多种基因的表达产物水平以获得CR表达概况，将候选化合物给予第二对象，测量来自第二对象的组织样品中的表达产物，和比较水平以确定候选化合物模拟CR的程度。可利用微阵列分析、逆转录酶PCR、定量逆转录酶PCR或杂交分析中的任一种测量样品中的表达产物（例如，mRNA）。如此评估的多种候选化合物可基于每一种模拟CR的程度进行排列。

附图简述

图1是显示对照组和CR进行组中小鼠体重的图组。

实施方式详述

定义

术语“给药”和“给予”意指将物质递送至对象的方式。给药可通过各种本领域已知的途径实现，如口服、胃肠外、经皮、吸入、植入等。因此，口服给药可通过如下实现：吞咽、咀嚼、吸吮包括药物的口服剂型；或摄入液体或半液体形式，例如，经由饮用或灌食（gavage）。胃肠外给药可通过静脉内、动脉内、肌内、鞘内或皮下等注射药物组合物实现。经皮给药可通过将经皮制剂在皮肤表面上施加、粘贴、滚涂、附着、浇注（pouring）、按压、擦拭等实现。这些及其他给药方法在本领域公知。

术语“条件”，如本文所用，被定义为可被施加或给予对象的任何外部因素。该术语意指可被给予对象的化合物、可被施加于对象的环境因素、可影响对象的刺激等。条件可以是定性或定量的。因此，该术语包括药物、食品补充物、饮食方案、健康方案、饮食补充物、营养物、环境、食物、情绪刺激、心理刺激、物理刺激、遗传改造等。

如本文所用，术语“组织”意为一起形成一种物体的细胞与胞间物质的聚集体。细胞可全部是一种具体类型，或可具有多种细胞类型。组织可以是任一种动物组织类型，选自但不限于：上皮组织、结缔组织、肌肉组织、血液或神经组织。组织可来自任何动物（例如，人、小鼠等）。

术语“寡核苷酸”，如本文所用，被定义为由两个或更多个核糖核苷酸——优选多于三个——组成的分子。其确切尺寸将取决于多种因素，而该因素转而取决于寡核苷酸的最终功能和用途。

如本文所用，术语“核酸分子”意指任何含核酸分子，包括但不限于，DNA或RNA。该术语包括这样的序列：包含DNA和RNA的任何已知碱基类似物，包括但不限于，4-乙酰胞嘧啶、8-羟基-N6-甲基腺苷、氮丙定基胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、I-甲基腺嘌呤、1甲基假尿嘧啶、I-甲基鸟嘌呤、I-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基Q苷、5'-甲氧基羰基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基硫-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸甲基酯、尿嘧啶-5-氧乙酸、oxybutoxosine、假尿嘧啶、Q苷、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、N-尿嘧啶5-氧乙酸甲基酯、尿嘧啶-5-氧乙酸、假尿嘧啶、Q苷、2-硫胞嘧啶和2,6-二氨基嘌呤。

术语“基因”意指包括产生多肽、前体或RNA（例如，rRNA、tRNA）必需的编码序列的核酸（例如，DNA）序列。多肽可由全长编码序列或由编码序列的任意部分编码，只要保留全长或片段的所需活性或功能性质（例如，酶活性、配体结合、信号转导、免疫原性等）。该术语还包括结构基因的编码区和位于编码区5'和3'端邻近的在任一端上距离约1kb或更多的序列，使得基因相应于全长mRNA的长度。位于编码区5'端并且存在于mRNA上的序列被称为5'非翻译序列。位于编码区3'端或下游并且存在于mRNA上的序列被称为3'非翻译序列。术语“基因”包括基因的cDNA和基因组形式。基因的基因组形式或克隆包含被非编码序列中断的编码区，该非编码序列被称为“内含子”或“插入区”或“插入序列”。内含子是转录到核RNA中的基因区段（hnRNA）；内含子可包含调节元件如增强子。内含子从核或初级转录物中被去除或“剪接掉”；因此内含子不存在于信使RNA（mRNA）转录物中。在翻译期间mRNA发挥作用以指定新生多肽中的氨基酸序列或顺序。

术语“基因小组”及其变体意指识别基因的组，具体地是基于一定共同的特性或特征被选择的组。例如，基因小组可包括发现通过一定处理或环境因素（例如，热量限制方案）被改造的多种基因。根据这种应用，术语“小组”可以其他表示基因分组的名称冠名，如“簇”、“标志”、“超标记物”（supermaker）、“图案”或类似物。

术语“表达”，如本文所用，可用于意指转录、翻译或二者。因此，“表达产物”意指转录产物（例如，mRNA）以及翻译产物（例如，多肽）。

如本文所用，术语“基因表达水平变化”意指相对于对照对象内的水平，测试对象（例如，CR对象或暴露于测试条件的对象）内的基因表达的或高或低的水平（例如，mRNA或蛋白质表达）。

当在定义长度的DNA序列上至少约75%（优选至少约80%，和最优选至少约90或95%）的核苷酸匹配时，两个DNA序列“基本上同源”。基本上同源的序列可通过利用序列数据库可用的标准软件比较序列来识别，或在例如具体系统限定的严格条件下的DNA杂交实验中识别。限定适当的杂交条件在本领域技术范围内。参见，例如，Maniatis等，同上；DNA Cloning，Vols.I&II，同上；Nucleic AcidHybridization，同上。

术语“标准杂交条件”意指杂交和洗涤的盐和温度条件基本上等同于5倍柠檬酸钠盐水（SSC）缓冲液和65℃。但是，本领域技术人员将理解，这种“标准杂交条件”取决于具体条件，包括缓冲液中的钠和镁浓度、核苷酸序列长度和浓度、错配百分比、甲酰胺百分比等。在“标准杂交条件”的确定中也非常重要的是两序列杂交是RNA-RNA，DNA-DNA还是RNA-DNA。这种标准杂交条件容易由本领域技术人员根据公知的公式确定，其中杂交一般比预期或确定的T_m低10-20℃，并且如需以较高严格性洗涤。

如本文所用，术语“互补”或“互补性”涉及通过碱基配对规则关联的多核苷酸（即，核苷酸序列）使用。例如，序列“5'-A-G-T-3”与序列“3'-T-C-A-5”互补。互补性可以是“部分的”的，其中仅一些核酸碱基按照碱基配对规则匹配。或者，核酸之间可以存在“完全”或“全部”互补性。核酸链之间的互补程度对核酸链之间的杂交效率和强度具有显著影响。这在扩增反应以及取决于核酸之间结合的检测方法中尤其具有重要性。

如本文所用，术语“扩增寡核苷酸”意指与目标核酸或其互补体杂交并且参与核酸扩增反应的寡核苷酸。扩增寡核苷酸的实例是“引物”，其与模板核酸杂交并且包含在扩增过程中通过聚合酶延伸的3'OH端。扩增寡核苷酸的另一实例是不通过聚合酶延伸（例如，因为其具有3'拦截端）但参与或促进扩增的寡核苷酸。扩增寡核苷酸可任选地包括修饰的核苷酸或类似物或参与扩增反应但不与目标核酸互补或包含在目标核酸中的另外的核苷酸。扩增寡核苷酸可包含不与目标或模板序列互补的序列。例如，引物的5'区可包括与目标核酸非互补的启动子序列（被称为“启动子-引物”）。本领域技术人员将理解，充当引物的扩增寡核苷酸可被修饰以包括5'启动子序列，因此充当启动子-引物。类似地，启动子-引物可通过去除启动子序列或无启动子序列合成而被修饰，并且仍充当引物。3'阻断的扩增寡核苷酸可提供启动子序列并且充当聚合模板（被称为“启动子-供体”）。

如本文所用，术语“引物”意指无论是天然存在的——如纯化的限制酶消化中——还是合成生成的，在被置于引起与核酸链互补的引物延伸产物合成的条件（即，在核苷酸和引发剂如DNA聚合酶存在的情况下并且处于适当的温度和pH）时，能够充当合成起始点的寡核苷酸。为在扩增中获得最大效率，引物优选是单链的，但可以可选地是双链的。如果是双链的，引物首先被处理以使其链分离，然后用于制备延伸产物。优选地，引物是寡脱氧核糖核苷酸。引物必须足够长，以在引发剂存在的情况下引起延伸产物的合成。引物的确切长度将取决于多种因素，包括温度、引物来源和方法的使用。

如本文所用，术语“探针”意指无论是天然存在的——如纯化的限制酶消化中——还是合成地、重组地或通过PCR扩增生成的，能够与至少部分另一目标寡核苷酸杂交的寡核苷酸（即，核苷酸序列）。探针可以是单链的或双链的。探针可用于检测、识别和分离具体基因序列。考虑用于本发明的任意探针将标记有任意“报告分子”，使得其可于任何检测系统中被检测到，包括但不限于酶（例如，ELISA以及酶基组织化学分析）、荧光性、放射性和发光性系统。并不意图本发明受限于任何具体检测系统或标记。

术语“分离”，在关于核酸使用时，如在“分离的寡核苷酸”或“分离的多核苷酸”中，意指这样的核酸序列：被识别和分离自通常在其天然来源中与其关联的至少一种组分或污染物。分离的核酸存在的形式或情况不同于其在自然界存在的形式或情况。相反，非分离的核酸包括在自然界中存在状态下被发现的核酸如DNA和RNA。例如，给定DNA序列（例如，基因）被发现于宿主细胞染色体上，接近于相邻基因；RNA序列，如编码特定蛋白质的特定mRNA序列，作为与编码多种蛋白质的多种其他mRNA的混合物，被发现于细胞中。但是，分离的编码给定蛋白质的核酸包括，例如，这样的在细胞中通常表达给定蛋白质的核酸：其中核酸处于不同于天然细胞的染色体位置，或通过与自然界发现不同的核酸序列以其他方式被侧接。分离的核酸、寡核苷酸或多核苷酸可以单链或双链形式存在。当分离的核酸、寡核苷酸或多核苷酸被用于表达蛋白质时，寡核苷酸或多核苷酸将至少包含正义或编码链（即，寡核苷酸或多核苷酸可以是单链的），但可包含正义和反义链（即，寡核苷酸或多核苷酸可以是双链的）。

如本文所用，术语“纯化的”或“纯化”意指去除样品的组分（例如，污染物）。例如，抗体通过去除污染性非免疫球蛋白被纯化；其也通过去除不结合目标分子的免疫球蛋白被纯化。去除非免疫球蛋白和/或去除不结合目标分子的免疫球蛋白导致样品中的目标反应性免疫球蛋白的百分比增加。在另一实例中，重组多肽在细菌宿主细胞中表达，并且该多肽通过去除宿主细胞蛋白质被纯化；从而样品中的重组多肽的百分比增加。

如本文所用，术语“对象”和“患者”意指任何动物，如哺乳动物，如狗、猫、鸟、家畜、小鼠、大鼠和人。

短语“候选化合物”或“候选物质”意指可用于治疗或预防身体功能的疾病、症候、弊病或病症，或以其他方式改变样品生理或细胞状况如抗衰老的任何化学实体、药品、药物及类似物。测试化合物包括已知的和潜在的治疗性化合物。通过应用本发明的筛选方法进行筛选，测试化合物可被确定为治疗剂。

如本文所用，术语“食物材料”意指喂食人或非人动物的任何食物类型。食物材料包括食物组分（如面团、薄片（flakes））、食物中间体（用于制成产物或组分的过渡步骤）和食物成分。食物材料可以是植物、真菌或动物来源或者合成来源的材料。食物材料可包含机体营养物，如糖类、蛋白质、脂肪、维生素、矿物质、纤维、纤维素等。

如本文所用，术语“营养物”意指在被人或动物食用时可提供饮食或健康益处的任何化合物或化学剂。营养物实例包括维生素、矿物质、植物营养素及其他物质。营养物的目的是赋予健康益处或期望的生理效果，其可不与食物关联。

术语“药剂或药物”如本文所用意指在被适当地给予患者时能够引起治疗效果的化学化合物或组合物。本文其他化学术语按照本领域常规用法使用，如TheMcGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms（Parker，S.，Ed.，McGraw-Hill，SanFrancisco（1985），其被引入本文作为参考）所示。

如本文所用，术语“饮食补充物”意指目的在于补充饮食的、具有或包含一种或多种食用成分的产品，该食用成分包括但不限于：维生素、矿物质、微量营养素、植物营养素、草药或其他植物剂、氨基酸、食用物质，其为人所用以通过增加总日常摄入来补充饮食；或浓缩物、代谢物、组成物、提取物或这些类项的组合。类似的定义在世界上的其他区域存在，例如，在欧洲。关于“饮食补充物”或类似的食品的不同命名在世界范围内使用，如“食品补充物”、“营养物”、“功能性食物”或简称“食物”。在本文中，术语“食物补充物”涵盖任何这样的命名或定义。

术语“遗传修饰”，如本文所用，意指通过有意引入外源DNA，前体细胞基因型的稳定或瞬态改变。DNA可以是合成的或自然衍生的，并且可包含基因，基因的部分或其他可用的DNA序列。术语“遗传修饰”，如本文所用，还可包括天然存在的改变，如通过天然病毒活性、天然遗传重组等发生的改变。

如本文所用，术语“环境条件”被限定为包括环境的一个或多个物理方面。环境条件可包括可以或不可影响对象的任何外部因素（温度、大气压力、气体浓度、氧水平、辐射、气载颗粒等）。

术语“饮食方案”意指动物对象随时间消耗的食物材料、成分或包括水的成分混合物。术语“饮食方案”可考虑消耗的具体食物材料、食物材料种类、消耗体积、食物材料来源、喂食频率、喂食时间等。

术语“健康方案”意指随时间可影响对象整体健康状况的动物对象日常活动。术语“健康方案”可考虑饮食方案、补充物应用、药物应用、锻炼、睡眠/休息、压力等。

术语“制剂”和“组合物”在本文中可互换使用。

浓度、含量、溶解度及其他数值数据可在本文中以范围形式显示。要理解，这种范围形式的使用仅以方便和简化为目的，并且应被灵活解释为不仅包括以范围限值明确描述的数值，而且包括该范围内包括的所有单个数值或子范围，如同各数值和子范围被明确描述。例如，浓度范围0.1至5ng/ml应被解释为不仅包括明确描述的浓度限值0.1ng/ml和5ng/ml，而且包括单个浓度如0.2ng/ml、0.7ng/ml、1.0ng/ml、2.2ng/ml、3.6ng/ml、4.2ng/ml和子范围如0.3-2.5ng/ml、1.8-3.2ng/ml、2.6-4.9ng/ml等。这种解释应当适用，而与范围宽度或所描述的特征无关。

如本文所用，术语“约”表示尺寸、制剂、参数、及其他数量和特征不是并且不需是精确的，而可按需近似和/或较大或较小，其反映公差、转换因数、取整、测量误差及类似情况及技术人员已知的其他因素。进一步，除非另外说明，术语“约”将明确包括“确切值”，与上文关于范围和数值数据的讨论一致。

如本文所用，术语“基本上”意指作用、特征、特性、状态、结构、项目或结果的完全或接近完全的规模或程度。例如，被“基本上”封闭的对象将意为对象被完全封闭或接近完全封闭。绝对完全的确切偏差容许度在可一些情况下取决于具体背景。但是，总体而言，完全的接近程度将具有相同的整体结果——如同获得绝对的和全部的完全。“基本上”的使用同样适用于当以负面含义表示完全或接近完全无作用、特征、特性、状态、结构、项目或结果时。例如，“基本上不含”颗粒的组合物将是完全无颗粒或接近完全无颗粒，效果将如同其完全无颗粒。换句话说，“基本上不含”一种成分或元素的组合物实际上可仍包含该项目，只要其效果无可测出。

如本文所用，以方便为目的，多种项目、结构元素、组成元素和/或材料可呈现在同一列表中。但是，这些列表应被解释为如同列表中的各成员被单独确定为独立的和独有的成员。因此，在无相反明示的情况下，这种列表中的单独成员不应仅基于其在同一群组中的呈现就被解释为事实上是同一列表中的任何其他成员的等价物。

本发明总体上涉及在器官特异性基础上识别模拟CR代谢效果的条件的方法。具体地，本发明提供经历在CR下表达变化的基因的小组。这种基因小组提供CR标记物。该小组可用于探测条件（例如，药物、治疗、食物、补充物、环境因素等），其具有模拟CR的效果。

实践本发明的某些示例性实施方式在下文中被更详细描述。本发明不限于这些具体实施方式。

基因表达评估

多种技术可用于评估本发明标记物的基因表达。本文描述了示例性方法、试剂盒和反应剂。

在一些实施方式中，微阵列被用于评估标记物表达。

考虑微阵列具有多种不同的寡核苷酸，其对于与CR相关并且在表1-3中确定的基因具有特异性，连接于固体支撑物的表面上。考虑在一些实施方式中，由测试对象（例如，在一定条件下的对象，该条件将与CR进行比较，以获得其对衰老的影响）的组织RNA样品制备样品，并且任选地，对照对象和制备的样品被施加至微阵列以杂交。考虑测试样品相对于对照样品的差异杂交或测试样品相对于预先建立的对照值（例如，来自CR下获得的表达概况）的表达量确定测试条件对衰老的影响。

不同种类的生物学分析被称为微阵列，包括但不限于：DNA微阵列（例如，cDNA微阵列和寡核苷酸微阵列）；蛋白质微阵列；组织微阵列；转染或细胞微阵列；化学化合物微阵列；和抗体微阵列。DNA微阵列，被称为基因芯片，DNA芯片或生物芯片，是附于固体表面（例如，玻璃，塑料或硅芯片）的微观DNA斑点的集合，形成阵列，目的在于同时进行表达概况分析或监测数千基因的表达水平。附加的DNA区段已知作为探针，数千附加DNA区段可用于单DNA微阵列。微阵列可通过比较疾病和正常细胞中的基因表达用于识别疾病基因。微阵列可利用多种技术制备，包括但不限于：利用细点销（fine-pointed pins）在玻片上印刷；利用预制掩模（pre-made masks）光刻；利用动态微镜装置光刻；喷墨印刷；或在微电极阵列上的电化学。

DNA和RNA印迹也可分别用于检测具体DNA或RNA序列。提取自样品的DNA或RNA被片段化，在基质凝胶上电泳分离，并转移至膜过滤器。过滤器结合的DNA或RNA和与目标序列互补的标记探针进行杂交。检测结合于过滤器的杂交探针。程序的变型是逆RNA印迹，其中附于膜的底物核酸是分离的DNA片段的集合，并且探针是提取自组织并且被标记的RNA。

基因组DNA和mRNA可在检测前或与检测同时被扩增。核酸扩增技术的示例性非限制性实例包括但不限于，聚合酶链式反应（PCR）、逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）、转录介导的扩增（TMA）、连接酶链式反应（LCR）、链置换扩增（SDA）和基于核酸序列的扩增（NASBA）。本领域技术人员将理解，某些扩增技术（例如，PCR）要求RNA在扩增前被逆转录至DNA（例如，RT-PCR），而其他扩增技术直接扩增RNA（例如，TMA和NASBA）。

聚合酶链式反应（美国专利号4,683,195、4,683,202、4,800,159和4,965,188，其全部内容均被引入本文作为参考），通常被称为PCR，对相反链应用引物对的多次变性、退火循环，并利用引物延伸呈指数增加目标核酸序列的拷贝数。在被称为RT-PCR的变型中，利用逆转录酶（RT）由mRNA制备互补DNA（cDNA），然后通过PCR扩增cDNA，以生成多拷贝的DNA。关于其他不同PCR变型，参见，例如，美国专利号4,683,195、4,683,202和4,800,159；Mullis et al.，Meth.Enzymol.155：335（1987）；和Murakawa et al.，DNA7：287（1988），其全部内容均被引入本文作为参考。

转录介导的扩增（美国专利号5,480,784和5,399,491，其各自的全部内容均被引入本文作为参考），通常被称为TMA，在多个RNA拷贝的目标序列自动催化地生成另外的拷贝的温度、离子强度和pH的、基本上恒定的条件下，自动催化地合成多拷贝的目标核酸序列。参见，例如，美国专利号5,399,491和5,824,518，其全部内容均被引入本文作为参考。在美国公开号20060046265（其全部内容被引入本文作为参考）所述的变型中，TMA任选地合并阻断部分、终止部分及其他修饰部分的应用，以提高TMA方法的灵敏度和准确度。

连接酶链式反应（Weiss，R.，Science254：1292（1991），其全部内容被引入本文作为参考），通常被称为LCR，利用与目标核酸邻近区杂交的两组互补DNA寡核苷酸。DNA寡核苷酸在热变性、杂交和连接的反复循环中通过DNA连接酶共价连接，生成可检测的双链、连接的寡核苷酸产物。

链置换扩增（Walker，G.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：392-396（1992）；美国专利号5,270,184和5,455,166，其各自的全部内容均被引入本文作为参考），通常被称为SDA，对目标序列的相反链应用退火引物序列对循环，在dNTPαS存在的情况下利用引物延伸生成双链体半硫化磷酸酯引物延伸产物，应用核酸内切酶介导的半修饰限制核酸内切酶识别位点切口，和应用聚合酶介导的自切口3'端的引物延伸，以置换现有链和产生用于下一轮引物退火、切口和链置换的链，导致产物几何扩增。嗜热SDA（tSDA）以基本上相同的方法在较高温度下应用嗜热核酸内切酶和聚合酶（欧洲专利号0684315）。

其他扩增方法包括，例如：基于核酸序列的扩增（美国专利号5,130,238，其全部内容被引入本文作为参考），通常被称为NASBA；利用RNA复制酶扩增探针分子本身的方法（Lizardi et al.，BioTechnol.6：1197（1988），其全部内容被引入本文作为参考），其通常被称为Qβ复制酶；基于转录的扩增方法（Kwoh et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:1173（1989））；和自动维持序列复制（Guatelli et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA87：1874（1990），其全部内容均被引入本文作为参考）。为进一步讨论已知的扩增方法，参见Persing,David H.,“In Vitro Nucleic Acid AmplificationTechniques”in Diagnostic Medical Microbiology:Principles and Applications(Persinget al.,Eds.),pp.51-87(American Society for Microbiology,Washington,DC(1993))。

非扩增或扩增核酸可通过任何常规手段检测。例如，在一些实施方式中，来自选自表1-3的小组的核酸，通过与可检测标记探针杂交和测量生成的杂交体来检测。检测方法的示例性非限制性实例在下文描述。

一种示例性检测方法，杂交保护分析（HPA）包括使化学发光性寡核苷酸探针（例如，吖啶酯标记的（AE）探针）与目标序列杂交，选择性杂交存在于未杂交探针上的化学发光性标记，和在光度计中测量由剩余探针产生的化学发光度。参见，例如，美国专利号5,283,174和Norman C.Nelson et al.，Nonisotopic Probing，Blotting，and Sequencing，ch.17（Larry J.Kricka ed.，2d ed.1995，其全部内容均被引入本文作为参考）。

另一示例性检测方法提供对扩增过程的实时定量评价。扩增过程的“实时”评价包括在扩增反应期间连续或周期性测定反应混合物中的扩增子量，和利用该测定值计算样品中最初存在的目标序列量。基于实时扩增确定样品中存在的最初目标序列量的多种方法在本领域公知。这些方法包括美国专利号6,303,305和6,541,205公开的方法，其全部内容均被引入本文作为参考。另一测定样品中最初存在的目标序列数量但非基于实时扩增的方法被公开于美国专利号5,710,029，其全部内容被引入本文作为参考。

扩增产物可通过利用不同的自杂交探针被实时检测，多数自杂交探针具有茎-环结构。这种自杂交探针被标记，使得其发出不同可检测信号，这取决于探针是否处于自杂交状态或通过与目标序列杂交而处于改变的状态。作为非限制性实例，“分子火炬”（molecular torches）是一类自杂交探针，其包括自互补区别区（被称为“目标结合域”和“目标收拢域”(target closing domain)）的不同区，该自互补区别区通过接合区（例如，非核苷酸连接体）连接并且在预定杂交分析条件下相互杂交。在优选实施方式中，分子火炬包含目标结合域中的单链碱基区，其长度为1至约20个碱基，并且适于在链置换条件下杂交于扩增反应中存在的目标序列。在链置换条件下，除在目标序列存在的情况下外——目标序列将结合于目标结合域中存在的单链区并置换全部或部分目标收拢域，分子火炬的两个可完全或部分的互补的互补区的杂交是优先的。分子火炬的目标结合域和目标收拢域包括被布置的可检测标记或相互作用标记对（例如，发光剂/淬灭剂），使得在分子火炬自杂交时产生的信号不同于分子火炬与目标序列杂交时，从而允许在未杂交的分子火炬存在的情况下检测测试样品中的探针:目标双链体。分子火炬和多种类型的相互作用标记对被公开于美国专利号6,534,274，其全部内容被引入本文作为参考。

具有自互补性的检测探针的另一实例是“分子信标”。分子信标包括具有目标互补序列的核酸分子、在扩增反应中不存在目标序列的情况下使探针保持闭合构象的亲和对（或核酸臂）、和在探针处于闭合构象时相互作用的标记对。目标序列和目标互补序列的杂交使亲和对的成员分离，从而使探针转变为开放构象。由于标记对的相互作用减少，转变成开放构象是可检测的，该标记对可以是，例如，荧光基团和淬灭剂（例如，DABCYL和EDANS）。分子信标被公开于美国专利号5,925,517和6,150,097，其全部内容被引入本文作为参考。

其他自杂交探针对于本领域技术人员而言是公知的。作为非限制性实例，具有相互作用标记的探针结合对，如公开于美国专利号5,928,862（其全部内容被引入本文作为参考）的那些，可适用于本发明。用于检测单核苷酸多态性（SNPs）的探针系统也可用于本发明。另外的检测系统包括“分子开关”，其被公开于美国公开号20050042638，其全部内容被引入本文作为参考。其他探针，如包括嵌入染料和/或荧光染料的那些，也可用于本发明的扩增产物检测。参见，例如，美国专利号5,814,447（其全部内容被引入本文作为参考）。

数据分析

在一些实施方式中，利用基于计算机的分析程序为临床医师或研究员将检测分析生成的原始数据（例如，基因小组表达的存在、不存在或量，该基因选自表1-6所列基因）转换成的预测值数据。用户可应用任何适当的手段访问预测数据。因此，在一些优选实施方式中，本发明提供进一步益处：可能未经遗传学或分子生物学培训的用户无需理解原始数据。数据以其最适用形式直接呈现给用户。然后用户能够立即利用该信息优化对象医护（或用于其自身，如果用户即为对象）。

本发明考虑能够向和从执行分析的实验室、信息提供者、医务人员和对象接收、处理和发送信息的任何方法。例如，在本发明一些实施方式中，样品（例如，活组织检查或者血液或血清样品）获自对象，并被提交给位于世界上任何区域（例如，与对象居住或最终应用信息的国家不同的国家）的概况分析服务点（profilingservice）（例如，医疗设施的临床实验室、基因组概况分析公司等），以生成原始数据。当样品包括组织或其他生物学样品时，对象可前往医疗中心以获得样品并将其送至概况分析中心，或对象可自己收集样品（例如，尿液样品）并直接将其发送至概况分析中心。当样品包括此前确定的生物学信息时，该信息可由对象直接送至概况分析服务点（例如，包含可通过计算机扫描的信息的信息卡，并且利用电子通信系统将数据发送至分析中心的计算机）。在被概况分析服务点接收后，样品被处理，并且生成图谱（即，表达数据），对于对象所需的诊断或预后信息是特异的。

然后图谱数据被制成适于用户理解的形式。例如，制备形式不是提供原始表达数据，而是可为对象呈现概率（例如，测试条件模拟CR的概率），连同具体处理选择的建议。数据可通过任何适当的方法显示给用户。例如，在一些实施方式中，概况分析服务点生成可打印给用户的报告（例如，在医护点）或在计算机监测器上显示给用户。

在一些实施方式中，信息首先在医护点或区域设施被分析。然后原始数据被发送至中央处理设备，以进行进一步分析和/或使原始数据转换成临床医师或患者可用的信息。中央处理设备提供隐私性（全部数据以统一的安全协议存储在中央设施）、速度和数据分析一致性优势。然后中央处理设备可控制对象治疗后的数据的去向。例如，利用电子通信系统，中央设施可将数据提供给临床医师、对象或研究员。

在一些实施方式中，对象能够利用电子通信系统直接访问数据。对象可基于结果选择进一步干预或咨询。在一些实施方式中，数据用于研究用途。例如，数据可用于进一步优化作为具体条件或疾病阶段的可用指示的标记物的内含或清除。

在一些实施方式中，可利用本文所述方法产生其中CR导致表达变化的基因小组。小组中的基因可根据进一步标准被选择，该进一步标准包括但不限于变化量级、变化方向或标志、统计学显著性水平、整个对象组的变化稳健性。“对象组”，如本文所用，意指在一个种属或物种范围内任何可辨别的分组，具体地具有一种遗传因素——例如品系、品种和种族——的一组。一方面，基因被确定在一个适当分类群中，包括但不限于鼠科动物、犬科动物、猫科动物或原始人。

基因小组的基因表达变化的具体样式可充当对象或对象组中CR影响的图谱。这种CR表达概况可依次用于识别物质以及模拟CR对基因表达的影响的其他处理。因此这种物质可被预期模拟其他CR效果。因此，CR相关的基因小组和表达概况可用于筛选被给予对象以向那些对象赋予CR效果的物质。

在本技术一方面，基因小组可展示广泛的遗传多样性，使得个体结果的解释可被外推至对象大组。例如，获自筛选小鼠具体品系成分的表达概况可用于预测小鼠多种品系成分的类似效果。在另一实例中，包括在属于具体种族的个体中被识别的基因的基因小组可用于筛选整个种族组的有效CR模拟物。

在实施方式中，更具体的基因小组可包括上述整个小组中的基因亚组。例如，一个这种小组可包括对组织或组织类型具有较高特异性的CR响应性基因。在另一实例中，可应用基因亚组，其在测试条件下显示较大量表达，或者或多或少对物质剂量敏感。这些标准不是可对具体小组的基因进行选择以服务于具体目的详尽因素。一方面，更具体的小组可提供较快和/或较容易解释的结果，该结果可用于初期筛选步骤以识别物质，作为针对整个小组测试的候选物。

根据本技术的基因小组和方法可用于选择制剂组分。在实施方式中，确定候选化合物在被给予动物时是否能够用于模拟CR效果的方法可包括用候选化合物处理动物；测量来自CR基因小组的多种基因的表达；和确定候选化合物是否模拟那些基因的CR表达概况。在具体实例中，CR表达概况可通过如下获得：分析进行CR的动物的组织，以测量小组中的基因的表达产物。该物质处理过的动物中的那些基因的表达可与CR表达概况进行比较，以确定该物质是否模拟CR和模拟程度。在一个实施方式中，分析的基因可选自CR响应性基因的整个小组。在另一实施方式中，分析的基因选自更具体的小组。在具体实例中，最初通过测量具体测试小组中的基因的表达筛选由多种物质生成的样品。然后基于测定结果或指示各物质模拟CR的程度的指数排列该物质。一方面，指数和排列可利用统计学工具常规建立。另一方面，排列可至少部分应用编码系统进行，该编码系统包括：处理引起的相对于CR概况的倍数变化、测试小组中的基因数量、显著影响的基因数量或其任意组合。然后可通过选择排列物质中的一种或多种制备制剂。作为进一步的验证步骤，可针对完整基因小组测试制剂或一种或多种物质。

组合物

用于本发明的诊断方法的组合物包括但不限于，探针、扩增寡核苷酸和抗体。特别优选的组合物可用于，被需要用于或足以检测来自从目标对象获得的生物学样品（例如，组织样品）的、表1-6所列一种或多种基因的表达水平。

这些组合物中的任一种，单独或组合本发明的其他组合物，可被以试剂盒形式提供。例如，单标记探针和扩增寡核苷酸对可被提供在试剂盒中，用于扩增和检测和/或定量选自选自表1-6所列基因的基因的小组。试剂盒可包括分析所需或足用于以分析的任意和全部组分，包括但不限于，反应剂本身、缓冲液、对照试剂（例如，组织样品、阳性和阴性对照样品等.）、固体载体、标记、书写和/或图示说明和产物信息、抑制剂、标记和/或检测试剂、包装环境控制（例如，冰、干燥剂等）及类似物。在一些实施方式中，试剂盒提供所需组分亚组，其中预期用户将提供其余组分。在一些实施方式中，试剂盒包括两种或更多种独立的容器，其中各容器容纳所要递送的组分亚组。

实施例

实施例1–识别CR和对照对象中差异表达的基因

在本发明实施方式开展期间进行实验，以识别CR小鼠中与喂食对照饮食的小鼠相比差异表达的基因。七种不同品系的小鼠（129S1/SvImJ、C57BL/6J、BALB/cJ、C3H/HeJ、CBA/J、DBA/2J和B6C3F1/J）从两个月至五个月龄接受热量限制（CR）饮食。小鼠被喂食基于AIN93M配方的对照饮食或具有类似营养物组成但显示30-50%热量限制的饮食。食物配额修改适于各品系的代谢。经过试验期CR饮食对各品系体重的影响显示在图1中。在5个月龄时收集对照和CR饮食的小鼠的组织。在CR和对照小鼠之间比较20,789个基因的基因表达水平。在心脏组织中，70个基因显示响应CR的高度显著的基因表达变化（参见表1；7个品系中4个品系的p值界限<0.01，并且C57BL/6J品系中的表达的a>=1.2倍或<=-1.2倍变化（FC））；在肌肉组织中，94个基因显示响应CR的高度显著的基因表达变化（参见表2；7个品系中5个品系的p值界限<0.01，并且C57BL/6J品系中的表达的a>=1.3倍或<=-1.3FC）；在白脂肪组织中，165个基因显示响应CR的高度显著的基因表达变化（参见表3；7个品系中6个品系的p值界限<0.01，并且C57BL/6J品系中的表达的a>=1.5倍或<=-1.5FC）。

表1.心脏组织

表2.骨骼肌组织

表3.白脂肪组织（WAT）

为生成可用于心脏组织的RT-PCR分析的标记物小组，来自表1的八种可能的CR标记物被选择用于通过RT-PCR确定阵列数据（表4）。基于多种因素选择基因，包括（但不限于）：在微阵列实验中大量表达，响应CR的稳健的基因表达变化，和/或之前的与CR饮食影响的代谢途径的关联。利用来自独立于阵列研究所用那些的对照和CR C57BL/6J小鼠群组的RNA样品，定量RT-PCR分析表明，全部基因均被CR显著改变。

表4.心脏组织

为生成可用于肌肉组织的RT-PCR分析的标记物小组，来自表2的十种可能的CR标记物被选择用于通过RT-PCR确定阵列数据（表5）。基于多种因素选择基因，包括（但不限于）：在微阵列实验中大量表达，响应CR的稳健的基因表达变化，和/或之前的与CR饮食影响的代谢途径的关联。利用来自独立于阵列研究所用那些的CR C57BL/6J小鼠群组的RNA样品，定量RT-PCR分析表明，全部基因均被CR显著改变。

表5.骨骼肌组织

为生成可用于白脂肪组织的RT-PCR分析的标记物小组，来自表3的十五种可能的CR标记物被选择用于通过RT-PCR确定阵列数据（表6）。基于多种因素选择基因，包括（但不限于）：在微阵列实验中大量表达，响应CR的稳健的基因表达变化，和/或之前的与CR饮食影响的代谢途径的关联。利用来自独立于阵列研究所用那些的CR C57BL/6J小鼠群组的RNA样品，定量RT-PCR分析表明，全部基因均被CR显著改变。

表6.白脂肪组织

实施例2-测试热量限制模拟物的成分

喂食研究：

处于6周龄C57BL/6J小鼠购自Jackson Laboratories并如之前Barger JL等（2008）A Low Dose of Dietary Resveratrol Partially Mimics Caloric Restriction andRetards Aging Parameters in Mice.PLoS ONE3（6）：e2264（http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0002264）所述抚养。简而言之，小鼠分别被置于鞋盒笼中，并被每周供给24克（～84kcal）AIN-93M饮食（星期一和星期三7克，星期五10克）。在8周龄开始并持续到22周龄，将小鼠a）保持AIN-93M饮食（对照组），b）喂食热量限制（CR）饮食——在8-16周龄提供63kcal/周的修饰AIN93M，然后进一步减少至饮食——在16-22周龄提供49kcal/周的修饰AIN93M；或c）分配AIN93M饮食，该AIN93M饮食补充有下列测试成分中的一种：1）苯扎贝特（bezafibrate），剂量为5,000mg/kg饮食；2）甲福明，剂量为1,909mg/kg饮食；3）L-肉毒碱，剂量为1,800mg/kg饮食；4）血橙提取物，剂量为18mg/kg体重；5）紫玉米提取物，剂量为22mg/kg体重；6）白藜芦醇，剂量为30mg/kg体重；和7）槲皮素，剂量为17.6mg/kg体重。在22周龄，收集小鼠的组织，将其在液氮中快速冷冻并在-80℃下储存，用于稍后分析。

为筛选其模拟CR能力的成分，对来自全部小鼠组的白脂肪组织分离的RNA进行定量实时PCR（RT-qPCR）分析。RT-qPCR实验的实验方法和数据分析此前已被公开于Barger，JL等，（2008）Short-term consumption of a resveratrol-containingnutraceutical mixture mimics gene expression of long-term caloric restriction in mouseheart,Exp.Gerontology43(9):859（http://dx.doi.org/10.1016/j.exger.2008.06.013）。简而言之，对于CR和处理组的表6所列每种基因，确定与对照动物相比的基因表达变化量级。利用双尾t检验（假设方差相等）确定各基因的表达变化是否在统计学上显著。表达变化（“倍数变化”）值的量级经log₂-调整，以符合统计分析的正态假设。

结果

CR模拟以对于测试组各基因观察到的倍数变化表示，如CR组中该基因所观察到的倍数变化百分比。表7显示通过各基因的各成分实现的CR模拟，各基因通过该成分显著改变。

表7

	Acaca	Acss2	Cd68	Gpd2	Ifi27l2a	Me1	Nampt	Ndufs4	Parm1	Serpine1	Slc2a4
												苯扎贝特	59%	21%	58%	93%	75%	24%	233%	108%	47%	-	113%
甲福明	17%	-	-	27%	-	11%	-	-	10%	-	-
												L-肉毒碱	5%	-	-	15%	-	-	84%	40%	3%	52%	16%
血橙提取物	8%	-	-	11%	54%	-	75%	22%	3%	-	19%
												紫玉米提取物	10%	-	-	-	-	5%	76%	-	-	48%	-
白藜芦醇	8%	-	-	10%	-	-	65%	-	-	55%	-
												槲皮素	-	-	-	5%	-	-	-	-	-	-	35%

排列CR模拟物成分

基于在整个基因小组中其模拟物效果来测试成分。对各成分，对全部显著变化基因的模拟值取平均。

在一个排列方法中，平均模拟物（作为CR的分数）乘以显著变化基因数，以获得模拟物指数（CMII）。如表8所示，苯扎贝特模拟CR最有效，而槲皮素显示最低CR模拟程度。

另一排列方法用于反映在全部基因中的效果。通过基于各基因其模拟分值赋予各成分多个点，计算各成分的每个基因的CR模拟物指数（CRMI）。将正点给予正模拟值（11至20%=1点，21至30%=2点，31至40%=3点，等）。负模拟值（即，其中基因表达效果与CR所观察到的相反）接收相应负分值（即，-11至-20%=-1点，-21至-30%=-2点，-31至-40%=3点，等）。增加五个点，用于模拟物值的统计学显著性。各成分的平均CRMI显示在表8中。

表8

实施例3

测试剂量对苯扎贝特的CR模拟的效果

在实施例2的实验方案中，还将5,000mg/kg饮食的苯扎贝特与较低剂量（100和500mg/kg）进行比较。表9显示各基因通过各剂量实现的CR模拟程度，各基因通过该剂量显著变化。

表9

如实施例2计算500mg/kg和100mg/kg剂量的模拟指数。如表10所示，苯扎贝特模拟CR的程度具有剂量依赖性。

表10

虽然前述实施例以一种或多种具体应用示例了本发明的原理，但对于本领域技术人员显而易见的是，可进行形式、用法和实施细节方面的多种改动，而无需实践创造性劳动，并且不脱离本发明的原理和思路。因此，除如所附权利要求所述以外，不意图本发明受到限制。

Claims

1.基因小组，包括响应CR在组织中差异表达的多种多核苷酸，其中所述多核苷酸选自表1至6所列的基因。

2.权利要求1所述的基因小组，其中所述组织来自鼠科动物对象。

3.权利要求1所述的基因小组，其中所述组织来自犬科动物对象或猫科动物对象。

4.权利要求1所述的基因小组，其中所述组织来自人类对象。

5.权利要求1所述的基因小组，其中所述组织选自肝组织、心脏组织、肺组织、脑组织、上皮组织、结缔组织、白脂肪、骨骼肌、血液、神经组织、尿液、和唾液。

6.权利要求5所述的基因小组，其中所述组织是心脏组织，并且所述多核苷酸选自表1所列基因。

7.权利要求6所述的基因小组，其中所述多核苷酸选自表4所列基因。

8.权利要求5所述的基因小组，其中所述组织是骨骼肌，并且所述多核苷酸选自表2。

9.权利要求8所述的基因小组，其中所述多核苷酸选自表5所列基因。

10.权利要求5所述的基因小组，其中所述组织是白脂肪，并且所述多核苷酸选自表3。

11.权利要求10所述的基因小组，其中所述多核苷酸选自表6所列基因。

12.用于检测组织中通用CR标记物的差异表达的探针，包括下列之一：

a）特异性杂交表1至3所列基因或其片段的多核苷酸；或

b）与表1至6所列基因编码的多肽结合的多肽结合剂。

13.权利要求12所述的探针，其中所述组织是心脏组织，并且所述探针包括选自表1所列基因的多核苷酸。

14.权利要求13所述的探针，其中所述多核苷酸选自表4所列基因。

15.权利要求12所述的探针，其中所述组织是骨骼肌，并且所述探针包括选自表2的多核苷酸。

16.权利要求15所述的探针，其中所述多核苷酸选自表5所列基因。

17.权利要求12所述的探针，其中所述组织是白脂肪，并且所述探针包括选自表3的多核苷酸。

18.权利要求17所述的探针，其中所述多核苷酸选自表6所列基因。

19.用于检测组织中的差异基因表达的组合物，所述组合物包括两种或更多种探针，其中所述探针包括：

a）与表1至6所列的两种或更多种基因或其片段特异性杂交的多核苷酸；或

b）与表1至6所列的两种或更多种基因编码的多肽结合的多肽结合剂。

20.权利要求19所述的组合物，其中所述组织是心脏组织，并且所述探针包括选自表1所列基因的多核苷酸。

21.权利要求20所述的组合物，其中所述多核苷酸选自表4所列基因。

22.权利要求19所述的组合物，其中所述组织是骨骼肌，并且所述探针包括选自表2的多核苷酸。

23.权利要求22所述的组合物，其中所述多核苷酸选自表5所列基因。

24.权利要求19所述的组合物，其中所述组织是白脂肪，并且所述探针包括选自表3的多核苷酸。

25.权利要求24所述的组合物，其中所述多核苷酸选自表6所列基因。

26.权利要求19所述的组合物，其中所述探针是适于PCR的寡核苷酸引物。

27.权利要求19所述的组合物，其中所述探针是抗体。

28.试剂盒，包括：

a）特异性杂交表1至6所列基因或其片段的扩增寡核苷酸；和

b）标记探针，包括特异性杂交表1至6所列、编码蛋白质的基因或其片段的多核苷酸。

29.权利要求28所述的试剂盒，其中所述探针结合于底物。

30.权利要求28所述的试剂盒，进一步包括选自下列的至少一种组分：缓冲液、对照试剂、固体支撑物、标记、说明书、抑制剂、标记试剂、检测试剂和干燥剂。

31.识别选定组织中的组织特异性通用热量限制（CR）标记物的方法，包括：a）使属于多个对象组的对象暴露于CR条件；和b）在来自所述多个对象组中的多个的对象中选择响应CR差异表达的一种或多种基因。

32.权利要求31所述的方法，其中所述选择的基因在两个或更多对象组中差异表达。

33.权利要求31所述的方法，其中所述选择的基因在三个或更多对象组中差异表达。

34.权利要求31所述的方法，其中所述选择的基因在50%或更多测试对象组中差异表达。

35.权利要求31所述的方法，其中所述组织选自肝组织、心脏组织、肺组织、脑组织、上皮组织、结缔组织、白脂肪、骨骼肌、血液、神经组织、尿液、和唾液。

36.权利要求35所述的方法，其中所述组织是心脏组织。

37.权利要求35所述的方法，其中所述组织是骨骼肌。

38.权利要求35所述的方法，其中所述组织是白脂肪。

39.权利要求35所述的方法，其中所述显著性水平为p<0.01。

40.权利要求31所述的方法，其中所述对象组是鼠科动物。

41.权利要求31所述的方法，其中所述对象组是犬科动物或猫科动物。

42.权利要求31所述的方法，其中所述对象组是人类。

43.确定候选化合物在被给予对象时是否可以有效模拟CR效果的方法，所述方法包括：

a）使第一对象暴露于CR；

b）测量来自所述第一对象的组织样品中两种或更多种表1至3所列基因的表达产物水平，以获得CR表达概况；

c）给予第二对象所述候选化合物；

d）测量来自所述第二对象的组织样品中所述表达产物的水平；和

e）比较b）和d）中所述的水平，以确定所述候选化合物模拟CR的程度。

44.权利要求43所述的方法，其中所述组织选自肝组织、心脏组织、肺组织、脑组织、上皮组织、结缔组织、白脂肪、骨骼肌、血液、神经组织、尿液、和唾液。

45.权利要求44所述的方法，其中所述组织是心脏组织。

46.权利要求44所述的方法，其中所述组织是骨骼肌。

47.权利要求44所述的方法，其中所述组织是白脂肪。

48.权利要求44所述的方法，其中所述测量利用权利要求12或权利要求19所述的组合物进行。

49.权利要求48所述的方法，其中所述探针结合于底物。

50.权利要求48所述的方法，其中所述探针处于阵列中。

51.权利要求48所述的方法，其中所述探针是适于PCR的寡核苷酸引物。

52.权利要求48所述的方法，其中所述探针是抗体。

53.权利要求43所述的方法，其中所述样品中的所述表达产物测量包括选自微阵列分析、逆转录酶PCR、定量逆转录酶PCR和杂交分析的检测技术。

54.权利要求43所述的方法，进一步包括基于所述候选化合物模拟CR的程度排列多种候选化合物。