TWI629607B - 建立腸道菌數據庫的方法和相關檢測系統 - Google Patents
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Abstract
本發明是關於建立腸道菌數據庫的方法和相關檢測系統，特別是建立一種具有於體外評估宿主健康狀況的量化指標的腸道菌數據庫的方法。其次，本發明所提供的腸道菌的檢測系統，該檢測系統包括一電腦系統，該電腦系統能處理分析腸道菌的相關生物資訊並產出具有於體外評估宿主健康狀況的量化指標的腸道菌數據庫。
Description
本發明是關於建立腸道菌數據庫的方法和腸道菌檢測系統，特別是關於建立一種具有於體外評估宿主健康狀況的量化指標的腸道菌數據庫。
近幾年的醫學研究才逐步發現，人類自身的健康狀況和存在於下消化道系統中的腸道菌群關係，遠比我們想像更加緊密。甚至與許多疾病有高度的相關性，但目前仍缺乏透過對體內腸道菌的研究進而建立系統性的體外評估並藉此瞭解宿主的健康狀況。
因此，在現今追求精準醫療和預防醫學的趨勢下，這些與人類健康關係最緊密的腸道菌群，未來勢必成為精準醫療的標的，對於發展建立一具有於體外評估宿主健康狀況的量化指標的腸道菌數據庫實為一亟需研發的項目和課題。
鑒於上述之發明背景，為了符合產業上之要求，本發明的第一目的在於提供一建立腸道菌數據庫的方法，特別是關於建立一種具有於體外評估宿主健康狀況的量化指標的腸道菌數據庫的方法。
本發明的第二目的在於提供一種具備人工智慧模組的腸道
菌的檢測系統，該檢測系統包括一電腦系統，該電腦系統能處理分析腸道菌的相關生物資訊並產出具有於體外評估宿主健康狀況的量化指標的腸道菌數據庫。
本發明的第一目的係提供一種建立腸道菌數據庫的方法，所述的方法包含以下步驟：
步驟一、輸入腸道菌的基因定序資訊至一電腦系統，該電腦系統包括一總體基因體分析軟件、一已知腸道菌基因庫和一疾病關聯性菌群資料庫。
步驟二、使用上述的電腦系統進行腸道菌的分類，其特徵在於該腸道菌的基因定序資訊經總體基因體分析軟件將所述的腸道菌的各基因定序資訊利用演算法(UCLUST)以兩兩基因定序資訊相似程度(Sequence Similarity)>97%進行群組，並和該已知腸道菌基因庫進行比對，獲得各群組所屬之操作分類單元(Operational Taxonomic Unit,OTU)，同時藉由各操作分類單元於該已知腸道菌基因庫中標註所屬生物分類資訊進行對應，藉此輸出該腸道菌的基因定序資訊所屬的腸道菌分類資訊及其豐度(abundance)；
步驟三、利用上述的電腦系統進行所述的腸道菌分類資訊和所述的疾病關聯性菌群資料庫的交叉比對，藉此輸出關聯性菌群的分類資訊，該關聯性菌群的分類資訊包括：癌症關聯性菌群、心血管關聯性菌群、新陳代謝關聯性菌群、自體免疫發炎關聯性菌群、腸胃道疾病關聯性菌群和精神關聯性菌群，其中上述的各關聯性菌群還包括該關聯性菌群的正相關菌群和該關聯性菌群的負相關菌群；
步驟四、由所述的電腦系統計算輸出所述的各關聯性菌群中所包含的腸道菌的檢測值，其中所述的腸道菌的檢測值的計算公式如下：
，其中x表示該腸道菌豐度(abundance)；
步驟五、由所述的電腦系統計算輸出所述的各關聯性菌群所包含的腸道菌的參考值範圍，該腸道菌的參考值範圍於本發明圖式中是以普通人表示，其中所述的腸道菌的參考值範圍的計算公式如下：，其中std表示標準差(standard deviation)；
步驟六、由所述的電腦系統根據步驟三所得到的該關聯性菌群的分類資訊和步驟四所得到的腸道菌的檢測值，並結合步驟五所述的腸道菌的參考值範圍輸出分析圖，該分析圖包括至少一雷達圖；
步驟七、由所述的電腦系統使用如下公式計算輸出上述的關聯性菌群的整體保護力評估值(V)，所述的關聯性菌群的整體保護力評估值(V)是作為在體外評估宿主健康狀況的指標；關聯性菌群的整體保護力評估值(V)=P[(1-(Ap/Apr)]+N[(An/Anr)-1]，其中P表示關聯性菌群中正相關菌群的權重值，且0≦P≦1；N表示關聯性菌群中負相關菌群的權重值，且0≦N≦1；Ap表示正相關菌群所屬腸道菌檢測值於雷達圖中所構成的多邊形區域的面積；Apr表示正相關菌群所屬腸道菌參考值範圍於雷達圖中所構成的多邊形區域的面積；An表示負相關菌群所屬腸道菌檢測值於雷達圖中所構成的多邊形區域的
面積；Anr表示負相關菌群所屬腸道菌參考值範圍於雷達圖中所構成的多邊形區域的面積；和
步驟八、由所述的電腦系統根據步驟三至步驟七的輸出結果建立一腸道菌數據庫，該腸道菌數據庫包括所述的關聯性菌群的分類資訊、腸道菌的檢測值R(x)、腸道菌的參考值範圍、分析圖、關聯性菌群的整體保護力評估值(V)、腸道菌多樣性指標評估和腸道菌落類型。
具體的，所述的建立腸道菌群數據庫的方法，還包含一提取糞便樣本中所含腸道菌的細菌去氧核糖核酸的步驟和一基因放大定序程序。
具體的，所述的基因放大定序程序包含如下步驟：對該糞便樣本中所含腸道菌的細菌去氧核糖核酸進行聚合酶鏈鎖反應(PCR)達到該細菌去氧核糖核酸的擴增放大的目的；使用與所述的腸道菌的16S核醣體核醣核酸基因(16S rRNA gene)V3-V4序列互補的一對正反引子，利用聚合酶鏈鎖反應(PCR)放大出V3-V4片段，其長度約550bp；對所述的V3-V4片段進行純化步驟，再以聚合酶鏈鎖反應(PCR)反應放大並再純化成約630bp大小的文庫(library)；使用分析儀器測量上述文庫的大小和使用螢光定量法(Qubit)測量該文庫濃度，調整該文庫濃度後加到表面帶有互補轉接子序列的定序晶片上；利用基因定序儀(MiSeq)的橋式聚合酶鏈鎖反應(bridge amplification)增幅以放大螢光檢測的訊號；和重覆進行螢光標記移除與偵測，藉此得到所述的腸道菌基因定序資訊，該腸道菌基因定序資訊的雙邊定序長度約為2*300bp。較佳地，所述的基因放大定序程序是次世代基因定序程序。
具體的，所述的關聯性菌群的整體保護力評估值(V)是作為在體外評估宿主健康狀況的指標，如果所述的關聯性菌群的整體保護力評估值(V)是大於或等於零，所述的電腦系統輸出表示宿主健康狀況正常的標示；如果所述的關聯性菌群的整體保護力評估值(V)是小於零，所述的電腦系統輸出表示宿主健康狀況異常的標示。
具體的，所述的腸道菌多樣性指標評估是以香農多樣性指數(Shannon’s diversity index)的最小值1.86及最大值4.89作為評估基準，如果糞便樣本的香農多樣性指數大於或等於3.375，該糞便樣本的腸道菌多樣性指標評估判定為高；如果檢體的香農多樣性指數是介於3.375到2.6175之間，該糞便樣本的腸道菌多樣性指標評估判定為普通；如果糞便樣本的香農多樣性指數小於或等於2.6175，該糞便樣本的腸道菌多樣性指標評估判定為低。
具體的，所述的腸道菌落類型包含普雷沃氏菌屬型(Prevotella)、擬桿菌屬型(Bacteroides)、埃希氏菌屬型(Escherichia)及瘤胃球菌屬型(Ruminococcus)；該檢體之腸道菌落類型判斷是以上述4腸道菌屬檢測值大小作比較，並選擇檢測值是最大值的腸道菌屬作為所述的腸道菌落類型。
具體的，所述的腸道菌數據庫是儲存在一雲端數據庫和一腸道菌群的檢測系統。
藉由本發明所述之建立腸道菌數據庫的方法定期檢測相關的腸道菌並進行趨勢分析，能更精準地評估疾病相關聯性菌群。且非常適合應用在腸道益生菌及益生元的配方開發，以改變腸道菌的組成與數量。
本發明的第二目的在於提供一具備人工智慧模組的腸道菌的檢測系統，該腸道菌的檢測系統包括一樣本採集器，該樣本採集器用於
收集糞便樣本、一基因資訊處理分析系統，該基因資訊處理分析系統包括一基因文庫量測儀器和一基因定序儀、和一電腦系統，該電腦系統接收上述基因資訊處理分析系統所輸出的基因定序資訊，並執行如第一目的所述的建立腸道菌數據庫的方法的步驟，藉此建立一包括關聯性菌群的分類資訊、腸道菌檢測值R(x)、腸道菌參考值範圍、分析圖、關聯性菌群的整體保護力評估值(V)、腸道菌多樣性指標評估和腸道菌落類型的腸道菌數據庫。
具體的，所述的基因定序資訊是經由如下步驟所得到：提取一糞便樣本中所含腸道菌的細菌去氧核糖核酸；進行聚合酶鏈鎖反應(PCR)進行該細菌去氧核糖核酸的擴增放大；使用與所述腸道菌的16S核醣體核醣核酸基因(16S rRNA gene)V3-V4序列互補的一對正反引子，利用聚合酶鏈鎖反應(PCR)放大出V3-V4片段，其長度約550bp；對所述的V3-V4片段進行純化步驟，再以聚合酶鏈鎖反應(PCR)反應放大並再純化成約630bp大小的文庫(library)；使用分析儀器測量上述文庫的大小和使用螢光定量法(Qubit)測量該文庫濃度，調整該文庫濃度後加到表面帶有互補轉接子序列的定序晶片上；利用基因定序儀(MiSeq)的橋式聚合酶鏈鎖反應(bridge amplification)增幅以放大螢光檢測的訊號；和重覆進行螢光標記移除與偵測，藉此得到所述的腸道菌基因定序資訊，該腸道菌基因定序資訊的雙邊定序長度約為2*300bp。
較佳地，該腸道菌的檢測系統是用於體外評估受檢者的生理狀況，所述的生理狀況包括消化系統的生理狀況、代謝系統的生理狀況、免疫系統的生理狀況、消化道細胞的生理狀況、中樞神經系統的生理狀況和心血管系統的生理狀況。
為了能徹底地瞭解本發明，將在下列的描述中提出詳盡的步驟及其組成。顯然地，本發明的施行並未限定於該領域的技藝者所熟習的特殊細節。另一方面，眾所周知的組成或步驟並未描述於細節中，以避免造成本發明不必要的限制。本發明的較佳實施例會詳細描述如下，然而除了這些詳細描述之外，本發明還可以廣泛地施行在其它的實施例中，且本發明的範圍不受限定，其以申請專利範圍書的範圍為准。
根據本發明第一具體實施例，本發明提供一種建立腸道菌數據庫的方法，詳細的步驟如下所述：
步驟一：提供一糞便樣本500毫克(mg)以上。
步驟二：該糞便樣本利用QIAGEN提供之QIAmp Fast DNA Stool Mini試劑盒進行腸道菌去氧核糖核酸(DNA)提取。經分離後，該DNA產量約為10至50ug及濃度為50至150ng/ul之間，接續進行PCR擴增，將DNA濃度調整至50ng/ul，並使用與所述腸道菌16S核醣體核醣核酸基因(16S rRNA gene)V3-V4序列互補的一對正反引子，利用聚合酶鏈鎖反應(PCR)放大出V3-V4片段，長度約550bp，放大後產物使用Geneaid提供之GeneHlow Gel/PCR純化試劑盒純化，由於放大後的序列尾端皆設計有Illumina突出轉接子(overhang adapters)，因此可以藉此突出轉接子序列(overhang adapters)，以Illumina提供之Nextera XT Index試劑盒，利用含條碼barcodes與Illumina定序接頭序列(P5,P7)的正反引子，將上述純化過後的產物進一步以PCR反應放大並利用AMPure XP磁珠純化成約630bp大小的文庫(library)。
步驟三：利用Agilent bioanalyzer 2100測量待測文庫之大小及使用螢光定量法(Qubit)測量待測文庫濃度，調整待測文庫濃度後加到表面帶有互補轉接子序列的定序晶片上，並利用基因定序儀(MiSeq)之橋式聚
合酶鏈鎖反應(bridge amplification)將樣本增幅以放大螢光檢測的訊號，因不同鹼基加上不同的螢光標記，經雷射激發後，可根據螢光的顏色來辯認互補的DNA。經重覆進行螢光標記移除與偵測，即可偵測眾多腸道菌的基因定序資訊(發邊定序長度為2*300bp)。
步驟四：輸入所述的眾多腸道菌基因定序資訊至一電腦系統，該電腦系統的軟件包括一已知總體基因體分析軟件(QIIME)、一已知腸道菌基因庫(Greengenes Database)和一疾病關聯性菌群資料庫。眾多腸道菌基因定序資訊經總體基因體分析軟件(QIIME)將各基因定序資訊利用所含演算法(UCLUST)以兩兩基因定序資訊相似程度(Sequence Similarity)>97%進行群組，並和該已知腸道菌基因庫進行比對，獲得各群組所屬之操作分類單元(Operational Taxonomic Unit,OTU)，同時藉由各操作分類單元於腸道菌基因庫中標註所屬生物分類資訊如：界、門、綱、目、科、屬、種進行對應，即可獲得各腸道菌基因定序資訊所屬生物分類資訊及其豐度(abundance)。
所述的疾病關聯性菌群資料庫是根據過去研究文獻顯示諸多特定腸道菌與各項疾病有關聯性存在，透過收集並彙整與疾病關聯性菌群所建立，並輸入至所述的電腦系統的儲存裝置以做為腸道菌資料比對分類的用途。
步驟五：利用上述的電腦系統進行所述的腸道菌分類資訊和所述的疾病關聯性菌群資料庫的交叉比對，藉此輸出關聯性菌群的分類資訊，該關聯性菌群的分類資訊包括：癌症關聯性菌群、心血管關聯性菌群、新陳代謝關聯性菌群、自體免疫發炎關聯性菌群、腸胃道疾病關聯性菌群和精神關聯性菌群，其中上述的各關聯性菌群還包括該關聯性菌群的正相關菌群和該關聯性菌群的負相關菌群。
步驟六：由所述的電腦系統計算得到步驟五所述的關聯性菌群中所包含的腸道菌的檢測值，其中所述的腸道菌檢測值的計算公式如下：，其中x表示該腸道菌豐度(abundance)。
步驟七：由所述的電腦系統根據步驟一至步驟五建立一宿主的血液樣本檢查正常的糞便檢體的各腸道菌檢測值並重複上述步驟針對人類微生物組計畫(Human Microbiome Project,HMP)中所提供之正常人糞便16S rRNA定序資訊建立正常人腸道菌參考值範圍，其中所述腸道菌參考值範圍的計算公式如下：，其中std表示標準差(standard deviation)。
步驟八：由所述的電腦系統根據步驟五所得到的該關聯性菌群和步驟六所得到的該關聯性所屬各腸道菌檢測值，並結合步驟七所得該關聯性所屬各腸道菌參考值範圍輸出至少一分析圖，該分析圖包括至少一雷達圖。
步驟九：由所述的電腦系統根據步驟六、七和八所得到該關聯性菌群所屬腸道菌檢測值、腸道菌參考值範圍和對應於雷達圖中所構成的n邊形區域及座標(x 0,y 0),(x 1,y 1),...,(x n-1,y n-1)，並使用如下公式得到區域面積：
A表示n邊形區域所構成面積。
步驟十、由所述的電腦系統使用如下公式計算輸出上述的關聯性菌群的整體保護力評估值(V)，所述的關聯性菌群的整體保護力評估值(V)是作為在體外評估宿主健康狀況的指標；關聯性菌群的整體保護力評估值(V)=P[1-(Ap/Apr)]+N[(An/Anr)-1]，其中P表示關聯性菌群中正相關菌群的權重值，且0≦P≦1；N表示關聯性菌群中負相關菌群的權重值，且0≦N≦1；Ap表示正相關菌群所屬腸道菌檢測值於雷達圖中所構成的多邊形區域的面積；Apr表示正相關菌群所屬腸道菌參考值範圍於雷達圖中所構成的多邊形區域的面積；An表示負相關菌群所屬腸道菌檢測值於雷達圖中所構成的多邊形區域的面積；Anr表示負相關菌群所屬腸道菌參考值範圍於雷達圖中所構成的多邊形區域的面積；和
步驟十一、由所述的電腦系統根據步驟五至步驟十的輸出結果建立一腸道菌數據庫，該腸道菌數據庫包括所述的關聯性菌群的分類資訊、腸道菌的檢測值R(x)、腸道菌的參考值範圍、分析圖、關聯性菌群的整體保護力評估值(V)、腸道菌多樣性指標評估和腸道菌落類型。
所述的關聯性菌群的整體保護力評估值(V)是作為體外利用腸道菌分析量化數據評估宿主的健康狀況的基準，當所述的關聯性菌群的整體保護力評估值(V)是大於或等於零，所述的電腦系統輸出表示宿主健康狀況正常的標示；如果所述的關聯性菌群的整體保護力評估值(V)是小於
零，所述的電腦系統輸出表示宿主健康狀況異常的標示。
再者，該整體保護力評估值(V)和關聯性菌群所屬的腸道菌的分佈、腸道菌的檢測值和參考值範圍相關，具體的表示是以如下公式表示其關聯性。
關聯性菌群的整體保護力評估值(V)=P[1-(Ap/Apr)-1]+N[(An/Anr)-1]
P表示關聯性菌群中正相關菌群的權重值，該權重值P因不同的疾病關聯性菌群而異，但是根據電腦系統統計的結果，該P值的範圍是0≦P≦1，以第二型糖尿病關聯性菌群為例，其P值是0.538。
N表示關聯性菌群中負相關菌群的權重值，該權重值N因不同的疾病關聯性菌群而異，但是根據電腦系統統計的結果，該N值的範圍是0≦N≦1，以第二型糖尿病關聯性菌群為例，其N值是0.462。
其次，根據本發明所提供的腸道菌數據庫的建立方法，電腦系統經由腸道菌基因定序資訊的判定分類結果和既有的疾病關聯性菌群資料庫的交叉比對輸出關聯性菌群的所屬腸道菌，並且再進一步細分所屬腸道菌為該關聯性菌群的正相關菌群或是負相關菌群，所述的正相關菌群是有害菌群，而所述的負相關菌群是有益菌群。
於一疾病關聯性菌群的具體實施例，所述的癌症關聯性菌群包括大腸癌關聯性菌群，該大腸癌關聯性菌群是由梭桿菌屬(Fusobacterium)、幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori)和脆弱類桿菌(Bacteroides fragilis)所組成。
於一疾病關聯性菌群的具體實施例，所述的心血管關聯性菌群包括動脈粥狀硬化關聯性菌群，該動脈粥狀硬化關聯性菌群是由包括顫
螺旋菌屬(Oscillospira)、毛螺旋菌科(Lachnospiraceae)和瘤胃球菌屬(Ruminococcus)的正相關菌群和包括柯林斯菌(Coriobacteriaceae)、丹毒絲菌科(Erysipelotrichaceae)和支原體屬(Allobaculum)的負相關菌群所組成。
於一疾病關聯性菌群的具體實施例，所述的新陳代謝關聯性菌群包括第二型糖尿病關聯性菌群，該第二型糖尿病關聯性菌群是由包括親黏阿克曼氏菌(Akkermansia_muciniphila)、梭狀芽孢桿菌(Clostridium hathewayi)、遲緩埃格特菌(Eggerthella lenta)、另枝菌屬(Alistipes)、梭菌屬(Clostridium)、普氏菌屬(Parabacteroides)和毛螺旋菌科(Lachnospiraceae)的正相關菌群和包括柔嫩梭菌(Faecalibacterium prausnitzii)、副流感嗜血桿菌(Haemophilus parainfluenzae)、真(優)桿菌屬(Eubacterium)、柔嫩梭菌屬(Faecalibacterium)、丹毒絲菌科(Erysipelotrichaceae)和梭菌目(Clostridiales)的負相關菌群所組成。
於一疾病關聯性菌群的具體實施例，所述的自體免疫發炎關聯性菌群包括第一型糖尿病關聯性菌群，該第一型糖尿病關聯性菌群是由包括擬桿菌門(Bacteroidetes)、擬桿菌屬(Bacteroides)、棒狀桿菌屬(Catenibacterium)、普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)、Akkermansia和代號02d06(Greengenes Database菌屬)的正相關菌群和包括厚壁菌門(Firmicutes)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)和普雷沃氏菌屬(Prevotella)的負相關菌群所組成。
於一疾病關聯性菌群的具體實施例，所述的腸胃道疾病關聯性菌群包括克隆氏症關聯性菌群，該克隆氏症關聯性菌群是由包括丁酸梭菌屬(Butyricicoccus)、擬桿菌屬(Bacteroides)、羅斯氏菌屬(Roseburia)和瘤胃球菌屬(Ruminococcus)的正相關菌群和包括糞球菌屬(Coprococcus)、柔嫩梭菌屬(Faecalibacterium)、布勞特氏菌屬(Blautia)和顫螺旋菌屬(Oscillospira)
的負相關菌群所組成。
於一疾病關聯性菌群的具體實施例，所述的精神關聯性菌群包括憂鬱症關聯性菌群，該憂鬱症關聯性菌群是由包括棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、紡錘狀細菌屬(Christensenella)、乳桿菌屬(Lactobacillus)和糞球菌屬(Coprococcus)的負相關菌群所組成。
根據本發明第二實施例，本發明提供的一種腸道菌的檢測系統，其特徵在於該腸道菌的檢測系統包括一樣本採集器、一基因資訊處理分析系統，該基因資訊處理分析系統包括一基因文庫量測儀器和一基因定序儀、和一電腦系統，該電腦系統接收上述基因資訊處理分析系統所輸出的基因定序資訊，並執行如本發明第一實施例所述的建立腸道菌數據庫的方法，藉此建立一包括關聯性菌群的分類資訊、腸道菌檢測值R(x)、腸道菌參考值範圍、分析圖、關聯性菌群的整體保護力評估值(V)、腸道菌多樣性指標評估和腸道菌落類型的腸道菌數據庫。
所述的基因定序資訊是經由如下步驟所得到：提取一糞便樣本中所含腸道菌的細菌去氧核糖核酸；進行聚合酶鏈鎖反應(PCR)進行該細菌去氧核糖核酸的擴增放大；使用與所述腸道菌的16S核醣體核醣核酸基因(16S rRNA gene)V3-V4序列互補的一對正反引子，利用聚合酶鏈鎖反應(PCR)放大出V3-V4片段，其長度約550bp；對所述的V3-V4片段進行純化步驟，再以聚合酶鏈鎖反應(PCR)反應放大並再純化成約630bp大小的文庫(library)；使用分析儀器測量上述文庫的大小和使用螢光定量法(Qubit)測量該文庫濃度，調整該文庫濃度後加到表面帶有互補轉接子序列的定序晶片上；利用基因定序儀(MiSeq)的橋式聚合酶鏈鎖反應(bridge amplification)增幅以放大螢光檢測的訊號；和重覆進行螢光標記移除與偵測，藉此得到所述的腸道菌基因定序資訊，該腸道菌基因定序資訊的雙邊定序長度約為
2*300bp。
較佳地，該腸道菌的檢測系統是應用關聯性菌群的整體保護力評估值(V)用於體外評估受檢者的生理狀況，所述的生理狀況包括消化系統的生理狀況、代謝系統的生理狀況、免疫系統的生理狀況、消化道細胞的生理狀況、中樞神經系統的生理狀況和心血管系統的生理狀況。
關於利用本發明的建立腸道菌數據庫的方法所得到的數據庫內容，特別是關聯性菌群的整體保護力評估值(V)，發明人於此執行本發明第一具體實施例所述的各個詳細步驟，總共十一個步驟，對一糞便樣本進行該糞便檢體的腸道菌數據庫建立，最後電腦系統輸出的結果包括關聯性菌群的分類、該關聯性菌群的所屬腸道菌、腸道菌檢測值、參考值範圍、關聯性菌群的整體保護力評估值(V)和宿主健康狀況標示、腸道菌多樣性指數和腸道菌落類型。
範例一
以下是根據本發明所提供的建立腸道菌數據庫的方法所建立的一宿主的糞便樣本的腸道菌資料庫的詳細數據。
表1是所述宿主的糞便樣本的關聯性菌群及其所包括的各腸道菌、腸道菌檢測值和參考值範圍，其中記號(+)表示該腸道菌是屬於正相關菌群；記號(-)表示該腸道菌是屬於負相關菌群。
表2是電腦系統根據本發明的第一具體實施例步驟八至步驟十所提供的公式進行演算得到範例一所述宿主的糞便樣本的正(+)負(-)相關菌群的權重值、檢測值面積、參考值面積和整體保護力評估值(V)。
表3是範例一所述的宿主的糞便樣本的關聯性菌群的整體保護力評估值(V)和對應該關聯性菌群的宿主健康狀況標示，當整體保護力評估值大於或等於0時，電腦系統輸出宿主在該關聯性菌群的健康狀況評估結果是正常，標示燈號為綠色；當整體保護力評估值小於0時，電腦系統輸出宿主在該關聯性菌群的健康狀況評估結果是異常，標示燈號為黃色(保護力評估值在0到-0.5之間)或紅色(保護力評估值在-0.5以下)。
範例一所述的宿主的糞便樣本的腸道菌多樣性指標的數值結果是3.98，該數值大於3.375，電腦系統輸出的評估結果為高。
範例一所述的宿主的糞便樣本的腸道菌落類型的判斷是以下述4種腸道菌屬檢測值大小作比較判定，其腸道菌落類型包括普雷沃氏菌屬型(Prevotella)、擬桿菌屬型(Bacteroides)、埃希氏菌屬型(Escherichia)及瘤胃球菌屬型(Ruminococcus)；並選擇檢測值是最大值的腸道菌屬作為所述的腸道菌落類型，演算分析結果如圖13所示，其中擬桿菌屬(Bacteroides)的檢測值最大，其檢測值是31.11，因此，範例一的宿主的糞便樣本的腸道菌落類型是擬桿菌屬(Bacteroides)型。
本發明所提供的建立腸道菌數據庫的方法，是利用次世代基因定序和總體基因體分析的技術取得糞便樣本中所含腸道菌的基因資訊，進一步利用電腦系統進行演算和資料庫比對輸出該糞便樣本中的所含腸道菌的菌屬、豐度、關聯性菌群的分類資訊、腸道菌的檢測值、腸道菌參考值範圍和分析圖等資訊，同時以電腦系統進行該分析圖的演算分析後輸出關聯性菌群的整體保護力評估值的量化評估指標，藉此評估宿主的健康狀況。其次，本發明所提供的建立腸道菌數據庫的方法也同時輸出腸道菌的多項性指標評估和腸道菌落類型的評估結果。
綜上所述，本發明是藉由非常少的糞便樣本數量，取得該糞便樣本所含腸道菌的基因定序信息後，利用電腦系統以人工智慧模組化的方式進行定性的分析並建立量化評估指標，以建立完整的腸道菌數據庫。
本發明所述的建立腸道菌數據庫的方法和相關檢測系統能提供完整的腸道菌資訊，有助於疾病的預防和健康狀況的評估，並且可進一步應用在預防醫學和精準醫療的領域。
以上所述，僅是本發明的較佳實施例和範例而已，並非對本發明作任何形式上的限制，雖然本發明已以較佳實施例和範例揭露如上，任何熟悉本專業的技術人員，在不脫離本發明技術方案範圍內，當可利用上述揭示的方法及技術內容作出些許的更動或修飾為等同變化的等效實施例，但凡是未脫離本發明技術方案的內容，依據本發明的技術實質對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化與修飾，均仍屬於本發明技術方案的範圍內。
圖1是本發明所述的建立腸道菌數據庫的方法的步驟流程圖；圖2是範例一所述宿主的糞便樣本的大腸癌關聯性菌群的分析圖；圖3是範例一所述宿主的糞便樣本的動脈粥狀硬化關聯性菌群的正相關菌群分析圖；圖4是範例一所述宿主的糞便樣本的動脈粥狀硬化關聯性菌群的負相關菌群分析圖；圖5是範例一所述宿主的糞便樣本的第二型糖尿病關聯性菌群的正相關菌群分析圖；圖6是範例一所述宿主的糞便樣本的第二型糖尿病關聯性菌群的負相關菌群分析圖；圖7是範例一所述宿主的糞便樣本的第一型糖尿病關聯性菌群的正相關菌群分析圖；圖8是範例一所述宿主的糞便樣本的第一型糖尿病關聯性菌群的負相關菌群分析圖；圖9是範例一所述宿主的糞便樣本的克隆氏症關聯性菌群的正相關菌群分析圖；圖10是範例一所述宿主的糞便樣本的克隆氏症關聯性菌群的負相關菌群分析圖；
圖11是範例一所述宿主的糞便樣本的憂鬱症關聯性菌群的分析圖；圖12是範例一所述宿主的糞便樣本的腸道菌多樣性指數的分佈圖；和圖13是範例一所述宿主的糞便樣本的腸道菌落類型的分析圖。
Claims (11)
- 建立腸道菌數據庫的方法，該方法包含如下步驟：(1)輸入腸道菌的基因定序資訊至一電腦系統，該電腦系統包括一總體基因體分析軟件、一已知腸道菌基因庫和一疾病關聯性菌群資料庫；(2)使用上述的電腦系統進行腸道菌的分類，其特徵在於該腸道菌的基因定序資訊經總體基因體分析軟件將所述的腸道菌的各基因定序資訊利用演算法(UCLUST)以兩兩基因定序資訊相似程度(Sequence Similarity)>97%進行群組，並和該已知腸道菌基因庫進行比對，獲得各群組所屬之操作分類單元(Operational Taxonomic Unit,OTU)，同時藉由各操作分類單元於該已知腸道菌基因庫中標註所屬生物分類資訊進行對應，藉此輸出該腸道菌的基因定序資訊所屬的腸道菌分類資訊及其豐度(abundance)；(3)利用上述的電腦系統進行所述的腸道菌分類資訊和所述的疾病關聯性菌群資料庫的交叉比對，藉此輸出關聯性菌群的分類資訊，該關聯性菌群的分類資訊包括：癌症關聯性菌群、心血管關聯性菌群、新陳代謝關聯性菌群、自體免疫發炎關聯性菌群、腸胃道疾病關聯性菌群和精神關聯性菌群，其中上述的各關聯性菌群還包括該關聯性菌群的正相關菌群和該關聯性菌群的負相關菌群；(4)由所述的電腦系統計算輸出所述的各關聯性菌群中所包含的腸道菌的檢測值，其中所述的腸道菌的檢測值的計算公式如下： ，其中x表示該腸道菌豐度(abundance)； (5)由所述的電腦系統計算輸出所述的各關聯性菌群所包含的腸道菌的參考值範圍，其中所述的腸道菌的參考值範圍的計算公式如下：，其中std表示標準差(standard deviation)；(6)由所述的電腦系統根據步驟(3)所得到的該關聯性菌群的分類資訊和步驟(4)所得到的腸道菌的檢測值，並結合步驟(5)所述的腸道菌的參考值範圍輸出分析圖，該分析圖包括至少一雷達圖；(7)由所述的電腦系統使用如下公式計算輸出上述的關聯性菌群的整體保護力評估值(V)，所述的關聯性菌群的整體保護力評估值(V)是作為在體外評估宿主健康狀況的指標；關聯性菌群的整體保護力評估值(V)=P[1-(Ap/Apr)]+N[(An/Anr)-1]其中P表示關聯性菌群中正相關菌群的權重值，且0≦P≦1；N表示關聯性菌群中負相關菌群的權重值，且0≦N≦1；Ap表示正相關菌群所屬腸道菌檢測值於雷達圖中所構成的多邊形區域的面積；Apr表示正相關菌群所屬腸道菌參考值範圍於雷達圖中所構成的多邊形區域的面積；An表示負相關菌群所屬腸道菌檢測值於雷達圖中所構成的多邊形區域的面積；Anr表示負相關菌群所屬腸道菌參考值範圍於雷達圖中所構成的多邊形區域的面積；和 (8)由所述的電腦系統根據步驟(3)至步驟(7)的輸出結果建立一腸道菌數據庫，該腸道菌數據庫包括所述的關聯性菌群的分類資訊、腸道菌的檢測值R(x)、腸道菌的參考值範圍、分析圖、關聯性菌群的整體保護力評估值(V)、腸道菌多樣性指標評估和腸道菌落類型。
- 如申請專利範圍1所述的建立腸道菌數據庫的方法，還包含一提取糞便樣本中所含腸道菌的細菌去氧核糖核酸的步驟和一基因放大定序程序。
- 如申請專利範圍2所述的建立腸道菌數據庫的方法，所述的基因放大定序程序包括如下步驟：(1)對該糞便樣本中所含腸道菌的細菌去氧核糖核酸進行聚合酶鏈鎖反應(PCR)達到該細菌去氧核糖核酸的擴增放大；(2)使用與所述的腸道菌的16S核醣體核醣核酸基因(16S rRNA gene)V3-V4序列互補的一對正反引子，利用聚合酶鏈鎖反應(PCR)放大出V3-V4片段，其長度約550bp；(3)對所述的V3-V4片段進行純化步驟，再以聚合酶鏈鎖反應(PCR)反應放大並再純化成約630bp大小的文庫(library)；(4)使用分析儀器測量上述文庫的大小和使用螢光定量法(Qubit)測量該文庫濃度，調整該文庫濃度後加到表面帶有互補轉接子序列的定序晶片上；(5)利用基因定序儀(MiSeq)的橋式聚合酶鏈鎖反應(bridge amplification)增幅以放大螢光檢測的訊號；和(6)重覆進行螢光標記移除與偵測，藉此得到所述的腸道菌基因定序資訊，該腸道菌基因定序資訊的雙邊定序長度約為2*300bp。
- 如申請專利範圍1所述的建立腸道菌數據庫的方法，如果所述的關聯性菌群的整體保護力評估值(V)是大於或等於零，則所述的電腦系統輸出表示宿主健康狀況正常的標示；如果所述的關聯性菌群的整體保護力評估值(V)是小於零，則所述的電腦系統輸出表示宿主健康狀況異常的標示。
- 如申請專利範圍1所述的建立腸道菌數據庫的方法，所述的腸道菌多樣性指標評估是以香農多樣性指數(Shannon’s diversity index)的最小值1.86及最大值4.89作為評估基準，如果糞便樣本的香農多樣性指數大於或等於3.375，該糞便樣本的腸道菌多樣性指標評估判定為高；如果檢體的香農多樣性指數是介於3.375到2.6175之間，該糞便樣本的腸道菌多樣性指標評估判定為普通；如果糞便樣本的香農多樣性指數小於或等於2.6175，該糞便樣本的腸道菌多樣性指標評估判定為低。
- 如申請專利範圍1所述的建立腸道菌數據庫的方法，所述的腸道菌落類型包括普雷沃氏菌屬型(Prevotella)、擬桿菌屬型(Bacteroides)、埃希氏菌屬型(Escherichia)及瘤胃球菌屬型(Ruminococcus)；該檢體之腸道菌落類型判斷是以上述4種腸道菌屬檢測值的大小作比較，並選擇檢測值是最大值的腸道菌屬作為所述的腸道菌落類型。
- 如申請專利範圍1所述的建立腸道菌數據庫的方法，所述的腸道菌數據庫是儲存在一雲端數據庫和一腸道菌群的檢測系統。
- 如申請專利範圍1所述的建立腸道菌數據庫的方法，係應用在腸道益生菌及益生元的配方開發。
- 一種腸道菌的檢測系統，該腸道菌的檢測系統包括一樣本採集器，該樣本採集器用於收集糞便樣本、一基因資訊處理分析系統，該基因資訊處理分析系統包括一基因文庫量測儀器和一基因定序儀、和一電腦系統，該電腦系統接收上述基因資訊處理分析系統所輸出的基因定序資訊，並執行如申請專利範圍1所述的建立腸道菌數據庫的方法，藉此建立一包括關聯性菌群的分類資訊、腸道菌檢測值R(χ)、腸道菌參考值範圍、分析圖、關聯性菌群的整體保護力評估值(V)、腸道菌多樣性指標評估和腸道菌落類型的腸道菌數據庫。
- 如申請專利範圍9所述的腸道菌的檢測系統，所述的基因定序資訊是經由如下步驟所得到：(1)提取一糞便樣本中所含腸道菌的細菌去氧核糖核酸；(2)進行聚合酶鏈鎖反應(PCR)進行該細菌去氧核糖核酸的擴增放大；(3)使用與所述腸道菌的16S核醣體核醣核酸基因(16S rRNA gene)V3-V4序列互補的一對正反引子，利用聚合酶鏈鎖反應(PCR)放大出V3-V4片段，其長度約550bp； (4)對所述的V3-V4片段進行純化步驟，再以聚合酶鏈鎖反應(PCR)反應放大並再純化成約630bp大小的文庫(library)；(5)使用分析儀器測量上述文庫的大小和使用螢光定量法(Qubit)測量該文庫濃度，調整該文庫濃度後加到表面帶有互補轉接子序列的定序晶片上；(6)利用基因定序儀(MiSeq)的橋式聚合酶鏈鎖反應(bridge amplification)增幅以放大螢光檢測的訊號；和(7)重覆進行螢光標記移除與偵測，藉此得到所述的腸道菌基因定序資訊，該腸道菌基因定序資訊的雙邊定序長度約為2*300bp。
- 如申請專利範圍9所述的腸道菌的檢測系統，該腸道菌的檢測系統是用於體外評估受檢者的生理狀況，所述的生理狀況包括消化系統的生理狀況、代謝系統的生理狀況、免疫系統的生理狀況、消化道細胞的生理狀況、中樞神經系統的生理狀況和心血管系統的生理狀況。
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