CN110718271B - 一种抑制结直肠癌致病菌的益生菌配方及其筛选方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抑制结直肠癌致病菌的益生菌配方及其筛选方法，益生菌的筛选方法为：根据正常人和结直肠癌患者的肠道菌群的宏基因组数据及丰度找到结直肠癌致病菌，然后构建肠道菌群互作网络筛选可抑制结直肠癌致病菌的益生菌，调节益生菌配比最后进行验证。利用该方法得到的益生菌配方为：丁酸梭菌1.3×1010CFU/ml，粪肠球菌1×109CFU/ml，短乳杆菌1×109CFU/ml，植物乳杆菌1×109CFU/ml，鼠李糖乳杆菌1×109CFU/ml，清酒乳杆菌1×109CFU/ml，肠系膜明串珠菌1×109CFU/ml。本发明的优点在于：(1)构建了肠道菌群互作网络，使得筛选得到的益生菌配方能更好定殖于肠道；(2)得到的益生菌配方不会产生耐药性，并且安全、有效，性能优良；(3)构建了人体肠道微生物组在线仓库数据库，使结果更加普适、可靠。

Description

一种抑制结直肠癌致病菌的益生菌配方及其筛选方法
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种抑制结直肠癌致病菌的益生菌配方及其筛选方法。
背景技术
结直肠癌(colorectal cancer,CRC)，是人类常见的恶性肿瘤，目前被列为世界第三大癌症。随着人们生活水平的提高和饮食结构的改变，其发病率和死亡率呈上升趋势，严重威胁着人类的健康。已有大量研究报道CRC与多种因素有关，如肥胖、糖尿病、久坐生活方式、高脂肪饮食、吸烟、酗酒、年龄、性别、家族史等，但其确切的发病机制仍不明确。
今年越来越多的研究提出肠道菌群是CRC进展相关的一个非常重要因素。肠道菌群，作为一个类器官，与宿主肠道粘膜上皮细胞和免疫细胞有着深层的相互作用关系，其组成、数量及活性，在许多生理过程中，尤其是在炎症和免疫反应中，起着至关重要的作用。肠道菌群已被证实可能是癌症发展的枢纽点，并直接或间接参与肠道肿瘤的发生。有文献报道在结肠癌中肠道菌群的组成发生了变化，提示肠道菌群生态失衡在结直肠癌发生发展中发挥着重要作用。一些细菌的物种，如粪肠球菌、大肠杆菌、具核梭杆菌、溶血性链球菌和脆弱拟杆菌等在CRC患者的粪便和肿瘤组织中有较高的比例，而产丁酸盐的细菌在CRC患者中消耗殆尽。
开发一种药物，抵抗结直肠癌患者肠道中的致病菌，恢复癌症患者的肠菌稳态，有可能成为治疗结直肠癌的一个有效手段。目前，抗生素的滥用已造成了如耐药等一系列的困扰人们的棘手问题，人类急需寻找一种可以“替代”抗生素的抗菌治疗药物。而益生菌能通过殖民抵抗的机制，即与病原菌竞争粘附位置，抵抗病原菌的侵袭，调节宿主的免疫反应，保护人体免疫系统。另外，益生菌比致病菌更耐酸，而且其可以产生有机酸等酸性物质，营造酸性微环境，从而抑制致病菌的生长。益生菌的使用可以对抗CRC患者肠道菌群的失调，从而恢复疾病导致的肠菌生态失衡，减少细菌引起的炎症、遗传毒性、致癌途径等。
然而，目前这种益生菌的靶向治疗方法尚未在CRC中进行深入的研究，其使用仍存在一定的局限性。益生菌的抗菌活性较小，菌株在肠道中的定殖能力较差，如何将其开发成能发挥稳定药效的药物具有一定的难度；其受环境、饮食等因素影响较大，目前还没有针对中国人体质的益生菌产品。开发益生菌药物有重大的意义，也面临着急剧的挑战。
中国专利CN107937504A公开了一种抗猪大肠杆菌感染的饲用益生菌的筛选方法，包括以下步骤：大肠杆菌感染发病仔猪和抗病仔猪的筛选及其肠道内容物样品的采集；大肠杆菌感染发病仔猪和抗病仔猪肠道微生物菌群的高通量测序；大肠杆菌感染发病仔猪和抗病仔猪肠道微生物宏基因组学对比分析；以及抗大肠杆菌感染的益生菌的筛选及鉴定，然而目前可收集到的抗结直肠癌致病菌的样本很少，无法采用该方法进行抗结直肠癌致病菌的益生菌的筛选，同时该方法没有从肠道菌群的生态整体出发去筛选益生菌，因此筛选得到的益生菌配方可能在肠道内的定殖能力差。
发明内容
针对现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种安全、有效、可更好定殖于肠道，抑制结直肠癌致病菌的益生菌配方及其筛选方法
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种抑制结直肠癌致病菌的益生菌配方的筛选方法，由以下步骤组成：
S1.构建人体肠道微生物组在线仓库数据库(GMrepo,http://gmrepo.humangut.info/home)，该数据库收录了58,903个人体肠道样本，253个项目，基于所述人体肠道微生物组在线仓库数据库，搜索并下载正常人和结直肠癌患者的肠道菌群的宏基因组数据，并对所述宏基因组数据进行质量控制，即修剪和去除原始数据中的接头和低质量序列，包含双端测序和单端测序两种模式，然后对质量控制后的宏基因组数据进行评价，，得到质控后的宏基因组数据；
S2.对所述质控后的宏基因组数据进行宏基因组物种注释分析，得到正常人和结直肠癌患者的肠道菌群的物种的丰度信息；
S3.基于所述质控后的宏基因组数据和所述丰度信息，分析正常人与结直肠癌患者之间肠道菌群的差异，并进一步筛选，得到正常人和结直肠癌患者中存在差异的差异菌，将所述差异菌输入到所述人体肠道微生物组在线仓库数据库中，查看所述差异菌在正常人的肠道菌群中的丰度，其中在正常人的肠道中不存在的菌被鉴定为结直肠癌致病菌；
S4.根据S2中所述丰度信息，分别选取正常人和结直肠癌患者的肠道菌群的物种的丰度排名前50的细菌，将其合并后根据基因尺度代谢网络模型，从文献中获取所述合并后的细菌在肠道中单独培养以及两两共同培养的条件下的生长率，并基于所述生长率构建肠道菌群互作网络；
S5.基于S4所述的肠道菌群互作网络和细菌间拮抗原理，筛选抑制S3中所述的结直肠癌致病菌的益生菌，合并所有抑制致病菌的益生菌后从以下两方面对所述益生菌做进一步的筛选：一是排除会促进其他致病菌生长的益生菌；二是尽量避免益生菌之间的相互抑制作用；
S6.结合所述益生菌在正常人的肠道菌群的丰度，对S5中所述的益生菌进行优化，调节各益生菌的配比，最终得到可抑制结肠癌致病菌的益生菌配方；
S7.对S6中所述益生菌配方进行实验动物体内验证：建立结直肠癌小鼠模型；制备S6中所述益生菌配方的益生菌悬液，将结直肠癌小鼠随机分成低剂量组、高剂量组和空白对照组，其中低剂量组和高剂量组小鼠分别灌胃等体积的低浓度和高浓度的益生菌悬液，空白对照组小鼠灌胃等体积的生理盐水，每天灌胃一次，连续灌胃28天。在小鼠灌胃后第0d、7d、14d、21d、28d分别在无菌条件下取等质量的小鼠肠道内容物，备宏基因组测序，分析在灌胃前后结直肠癌小鼠粪便中致病菌和益生菌的丰度，从而确定所述益生菌配方对结肠癌致病菌的抑制效果。
优选地，S1中采用Trimmomatic软件进行所述质量控制，采用Fastqc软件进行所述质量控制后的评价，这两个软件均是本领域的常用软件。
优选地，S2中采用MetaPhIAn2软件进行所述宏基因组物种注释分析，该软件整理了17000多个参考基因组，包括13500个细菌和古菌，3500个病毒和110种真核生物，下载对应的数据库后，采用该软件可以实现精确的分类群分配以及准确的计算物种的相对丰度，其能达到种水平的精度，以及菌株水平的鉴定和追踪。
优选地，S3中采用本领域常用软件LefSe进行所述分析，采用随机森林算法进行所述差异菌的筛选，随机森林算法利用多棵决策树的集成学习策略，对样本进行训练并进行预测，输入LEfSe分析筛选得到的结直肠癌中存在显著差异的菌，随机森林可以很容易的查看模型输入特征的相对重要性，并识别癌症患者和正常人，最终得到正常人和结直肠癌患者中存在差异的差异菌。
优选地，S4中将细菌在肠道中单独培养的生长率记为S，将细菌在肠道中两两共同培养的生长率记为P，计算细菌之间的权重W＝log 2(P/S)，以所述合并后的细菌为节点，以菌株之间的权重W为边，利用本领域常用的开源软件Gephi绘制所述肠道菌群互作网络，同时采用Gephi软件中的modularity algorithm功能鉴定肠菌代谢网络中的亚群，采用Gephi软件自带的PageRank algorithm功能鉴定肠菌代谢网络中重要节点。
一种利用上述筛选方法所获得的抑制结直肠癌致病菌的益生菌配方：其中，丁酸梭菌(Clostridium butyricum)含量为1×109～5×1010CFU/ml，粪肠球菌(Enterococcusfaecium)含量为1×108～5×109CFU/ml，短乳杆菌(Lactobacillus brevis)含量为1×108～5×109CFU/ml，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)含量为1×108～5×109CFU/ml，鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)含量为1×108～5×109CFU/ml，清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)含量为1×108～5×109CFU/ml，肠系膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)含量为1×108～5×109CFU/ml。
优选地，益生菌配方中，丁酸梭菌(Clostridium butyricum)含量为1.3×1010CFU/ml，粪肠球菌(Enterococcus faecium)含量为1×109CFU/ml，短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)含量为1×109CFU/ml，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)含量为1×109CFU/ml，鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)含量为1×109CFU/ml，清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)含量为1×109CFU/ml，肠系膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)含量为1×109CFU/ml。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本申请基于肠道菌群的基因尺度代谢网络模型及细菌间拮抗原理，充分利用肠道菌群的基因组、转录组、蛋白质组和代谢组等多组学信息，将肠道菌群作为一个生态整体，构建了肠道菌群互作网络。相较于传统的益生菌配方，本申请考虑到了肠道菌群生态系统以及细菌与细菌之间的相互作用关系，筛选得到的益生菌配方能更好的定殖于肠道，最大程度的发挥抗菌作用。
(2)本申请开发的益生菌配方，相比于传统的抗生素，不会产生耐药性等严重的副作用。并且益生菌取之于人，用之于人，其安全、有效，性能优良，能有效缓解因抗生物滥用导致的对人类健康和生态环境的严重威胁。
(3)本申请的筛选方法中构建了人体肠道微生物组在线仓库数据库，收录了58,903个人体肠道样本，253个项目，基于该数据库，结合LEfSe分析和随机森林建模分析，使鉴定得到的差异致病菌更加可靠，同时利用该数据库分析正常人的肠道菌群情况，对益生菌配方进行优化，使结果更加普适、可靠。
附图说明
图1为实施例1的S3中随机森林算法筛选得到的结直肠癌致病菌图；
图2为实施例1的S4中合并后的62个细菌在菌株水平，且W＞4的肠道菌群互作网络图；
图3为实施例1的S5中筛选到的33个益生菌对结直肠癌致病菌的作用分析图；
图4为实施例1的S5中筛选到的33个益生菌之间相互作用关系图；
图5为实施例1中益生菌配方进行灌胃后，结直肠癌小鼠肠道内容物的益生菌和致病菌的丰度变化图，其中A为益生菌的丰度变化图，B为致病菌的丰度变化图；
图6为实施例2中益生菌配方进行灌胃后，结直肠癌小鼠肠道内容物的益生菌和致病菌的丰度变化图，其中A为益生菌的丰度变化图，B为致病菌的丰度变化图；
图7为实施例3中益生菌配方进行灌胃后，结直肠癌小鼠肠道内容物的益生菌和致病菌的丰度变化图，其中A为益生菌的丰度变化图，B为致病菌的丰度变化图；
图8对比例1中益生菌配方进行灌胃后，结直肠癌小鼠肠道内容物的益生菌和致病菌的丰度变化图，其中A为益生菌的丰度变化图，B为致病菌的丰度变化图；
图9对比例2中益生菌配方进行灌胃后，结直肠癌小鼠肠道内容物的益生菌和致病菌的丰度变化图，其中A为益生菌的丰度变化图，B为致病菌的丰度变化图；
具体实施方式
下面将结合本发明中的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
S1.构建了人体肠道微生物组在线仓库(GMrepo,http://gmrepo.humangut.info/home)数据库，并在该数据库中搜索并下载正常人和结直肠癌症患者的宏基因组数据，获取了结肠癌患者(53例)与健康人群(61例)的肠道菌群宏基因组双端测序信息(ENAaccession ID:ERP005534)，然后用Trimmomatic软件对数据进行质量控制，去除低质量序列和接头，并用Fastqc软件评价质量控制后的数据，得到了质控后的宏基因组数据；
S2.采用MetaPhIAn2软件进行宏基因组物种注释分析，得到了正常人和结直肠癌患者的肠道菌群的物种的丰度信息；
S3.基于S1中质控后的宏基因组数据和S2中丰度信息，采用LEfSe(LDA EffectSize)分析正常人与结直肠癌患者之间肠道菌群的差异，进一步采用随机森林算法，利用多棵决策树的集成学习策略，对样本进行训练并进行预测，输入LEfSe分析得到的结直肠癌患者的肠道菌群中与正常人的肠道菌群中存在显著差异的菌，随机森林算法可以很容易的查看模型输入特征的相对重要性，并识别癌症患者和正常人，从而得到正常人和结直肠癌患者中存在差异的差异菌，将所述差异菌输入到所述GMrepo中，查看所述差异菌在正常人的肠道菌群中的丰度。结果如附图1所示，图中不同的符号代表GMrepo数据库中收录的不同项目的数据，其中横坐标大于0表示该菌在结直肠癌患者中丰度上升，而小于0代表该菌丰度下降，而Coefficients绝对值越大，说明该菌在两组间差异越显著，经随机森林算法筛选到了21个差异菌，将筛选到的差异菌输入到GMrepo中，查看差异菌在正常人肠道的丰度，最后发现Fusobacterium nucleatum，Parvimonas micra，Peptostreptococcus stomatis，Gemella morbillorum，Porphyromonas asaccharolytica，Fusobacteriumgonidiaformans和Clostridium hathewayi在正常人肠道中不存在，即这7种菌被鉴定为结直肠癌致病菌，在菌株水平，共有13种结直肠癌致病菌。
S4.根据S2中丰度信息分别从正常人和结直肠癌患者的肠道菌群中选取丰度排名前50的细菌(这些细菌占总丰度的90％以上)，并将其合并得到62个细菌，然后根据文献Magnusdottir,S.,Heinken,A.,Kutt,L.,Ravcheev,D.A.,Bauer,E.,Noronha,A.,etal.2017.Generation of genome-scale metabolic reconstructions for 773membersof the human gut microbiota.Nat.Biotechnol.35,81–89中获得的人体肠道细菌的基因尺度代谢网络模型，并获得了合并后的62个细菌在肠道中单独培养的生长率(记为S)，以及两两共同培养时的生长率(记为P)，计算细菌之间的权重W＝log 2(P/S)，然后以细菌为节点，以细菌之间的权重W为边(如果W>0，表示细菌1单独培养时的生长率(S)小于与细菌2共同培养时的生长率(P)，认为细菌2对细菌1产生了促进作用；如果W<0,表示细菌1单独培养时的生长率S大于与细菌2共同培养时的生长率P，认为细菌2对细菌1产生了抑制作用，如果W＝0，表示细菌1单独培养时和与细菌2共同培养时，生长率没有显著差异，则细菌2对细菌1无影响)，利用开源软件Gephi绘制了肠道菌群互作网络，如附图2所示，图中展示了合并后的62个细菌在菌株水平，且W＞4的肠道菌群互作网络图，其中细菌之间的连接线的颜色不同代表了促进或者抑制效果，连接线的粗细代表了W值的绝对值大小，W值的绝对值越大，则促进或抑制效果越明显)
S5.基于S4中绘制的肠道菌群互作网络，根据细菌间拮抗原理，针对S3中13个菌株水平的致病菌，找到可抑制所述致病菌的益生菌，一共得到菌株水平的益生菌33个(如附图3或附图4中横坐标所示)。然后对得到的益生菌座根据以下两方面做进一步筛选：一是根据附图3中33个益生菌对结直肠癌致病菌的作用(附图3中，中位数值小于0代表抑制作用，大于0代表促进作用)，排除可促进其他致病菌生长的益生菌；二是根据附图4中33个益生菌之间的相互作用(附图4中，中位数值小于0代表抑制作用，大于0代表促进作用)，尽量减少选取的益生菌之间的相互抑制作用。最终得到7个菌株水平的益生菌，分别是：丁酸梭菌(Clostridium butyricum)，粪肠球菌(Enterococcus faecium)，短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)，清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)和肠系膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)。
S6.根据S5中筛选出的7个益生菌在正常人肠道中的丰度(如表1所示)，调节7个益生菌的比例，最终得到可抑制结肠癌致病菌的益生菌配方为：丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)含量为1.3×1010CFU/ml，粪肠球菌(Enterococcus faecium)含量为1×109CFU/ml，短乳杆菌(Lactobacillus brevis)含量为1×109CFU/ml，植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)含量为1×109CFU/ml，鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)含量为1×109CFU/ml，清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)含量为1×109CFU/ml，肠系膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)含量为1×109CFU/ml。
S7.根据S6中所述的益生菌配方购置相应的益生菌，使用前将其接种液体培养基中，37℃培养16h，3000rpm，4℃离心8min后，弃上清，菌泥用无菌生理盐水调整菌悬液浓度为1011CFU/mL，并按S6所述配方稀释并配制成益生菌悬液。选取4周龄，雄性，18-22g的实验小鼠，在正式实验前于恒温(22℃)、恒湿、昼夜循环12h环境中适应性饲养一周，实验期间自由饮水进食，于其前肢腋下皮下注射小鼠结直肠癌细胞细胞悬液，建立结直肠癌小鼠模型。给小鼠灌胃配制得到的益生菌悬液，每天灌胃一次，连续灌胃28天。在小鼠灌胃后第0天、7天、14天、21天、28天分别在无菌条件下取等质量的小鼠肠道内容物100mg，置于灭菌后的试管中，于-80℃冻存，备宏基因组测序。根据测序结果分析在灌胃前后结直肠癌小鼠粪便中致病菌和益生菌的丰度，结果如图5所示，其中图5-A为本实施例中益生菌的丰度变化，图5-B为本实施例中致病菌的的丰度变化(其中由于Fusobacterium gonidiaformans这一致病菌的丰度显著高于其他致病菌，因此Fusobacterium gonidiaformans的丰度对应的是图中右侧的纵坐标，其它6种致病菌的丰度对应的是图中左侧的纵坐标)。
表1筛选得到的益生菌及其在正常人肠道中的丰度
Figure BDA0002214382480000071
实施例2
与实施例1相比，本实施例的不同之处在于，步骤S6中益生菌的配方为：丁酸梭菌(Clostridium butyricum)含量为1×109CFU/ml，粪肠球菌(Enterococcus faecium)含量为1×108CFU/ml，短乳杆菌(Lactobacillus brevis)含量为1×108CFU/ml，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)含量为1×108CFU/ml，鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)含量为1×108CFU/ml，清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)含量为1×108CFU/ml，肠系膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)含量为1×108CFU/ml。最终结果如图6所示，其中图6-A为本实施例中益生菌的丰度变化，图6-B为本实施例中致病菌的丰度变化(其中由于Fusobacterium gonidiaformans这一致病菌的丰度显著高于其他致病菌，因此Fusobacterium gonidiaformans的丰度对应的是图中右侧的纵坐标，其它6种致病菌的丰度对应的是图中左侧的纵坐标)。
实施例3
与实施例1相比，本实施例的不同之处在于，步骤S6中益生菌的配方为：丁酸梭菌(Clostridium butyricum)含量为5×1010CFU/ml，粪肠球菌(Enterococcus faecium)含量为5×109CFU/ml，短乳杆菌(Lactobacillus brevis)含量为5×109CFU/ml，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)含量为5×109CFU/ml，鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)含量为5×109CFU/ml，清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)含量为5×109CFU/ml，肠系膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)含量为5×109CFU/ml。最终结果如图7所示，其中图7-A为本实施例中益生菌的丰度变化，图7-B为本实施例中致病菌的丰度变化(其中由于Fusobacterium gonidiaformans这一致病菌的丰度显著高于其他致病菌，因此Fusobacterium gonidiaformans的丰度对应的是图中右侧的纵坐标，其它6种致病菌的丰度对应的是图中左侧的纵坐标)。
对比例1
与实施例1相比，本对比例的不同之处在于，步骤S6中益生菌的配方为：丁酸梭菌(Clostridium butyricum)含量为1×108CFU/ml，粪肠球菌(Enterococcus faecium)含量为1×107CFU/ml，短乳杆菌(Lactobacillus brevis)含量为1×107CFU/ml，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)含量为1×107CFU/ml，鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)含量为1×107CFU/ml，清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)含量为1×107CFU/ml，肠系膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)含量为1×107CFU/ml。最终结果如图8所示，其中图8-A为本实施例中益生菌的丰度变化，图8-B为本实施例中致病菌的丰度变化(其中由于Fusobacterium gonidiaformans这一致病菌的丰度显著高于其他致病菌，因此Fusobacterium gonidiaformans的丰度对应的是图中右侧的纵坐标，其它6种致病菌的丰度对应的是图中左侧的纵坐标)。
对比例2
与实施例1相比，本对比例的不同之处在于，步骤S6中益生菌的配方为：丁酸梭菌(Clostridium butyricum)含量为5×1011CFU/ml，粪肠球菌(Enterococcus faecium)含量为5×1010CFU/ml，短乳杆菌(Lactobacillus brevis)含量为5×1010CFU/ml，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)含量为5×1010CFU/ml，鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)含量为5×1010FU/ml，清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)含量为5×1010CFU/ml，肠系膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)含量为5×1010CFU/ml。最终结果如图9所示，其中图9-A为本实施例中益生菌的丰度变化，图9-B为本实施例中致病菌的丰度变化(其中由于Fusobacterium gonidiaformans这一致病菌的丰度显著高于其他致病菌，因此Fusobacterium gonidiaformans的丰度对应的是图中右侧的纵坐标，其它6种致病菌的丰度对应的是图中左侧的纵坐标)。
根据实施例1-3和对比例1-2的结果可发现，在本申请所要保护的益生菌的配方范围内，益生菌的丰度增加量和致病菌的丰度降低量均比对比例较优，即本申请中的益生菌配方具有较好的益生菌的定殖效果和致病菌抑制效果，其中实施例1中的益生菌定殖效果和致病菌的抑制效果优于实施例2，虽与实施例3相差不大，但益生菌浓度相对较低，说明并不是益生菌浓度越高，对致病菌的抑制效果越好，即实施例1中所采用的益生菌配方具有最优异的定殖于肠道和抑制结直肠癌致病菌的有益效果。
综上，本申请所述的一种抑制结直肠癌致病菌的益生菌配方及其筛选方法，相比于传统的抗生素，更加安全、有效、性能优良，且不会产生耐药性等严重的副作用。另外，本申请利用人体肠道微生物组在线仓库数据库，基于肠道菌群的基因尺度代谢网络模型及细菌间拮抗原理，充分利用肠道菌群的基因组、转录组、蛋白质组和代谢组等多组学信息，将肠道菌群作为一个生态整体，构建了肠道菌群互作网络，在此基础上筛选得到的益生菌配方更可靠、普适，能更好的定殖于肠道，最大程度的发挥抗菌作用。同时本申请所要保护的益生菌的配方范围具有最优的定殖于肠道和抑制结直肠癌致病菌的效果。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (7)

1.一种抑制结直肠癌致病菌的益生菌配方的筛选方法，其特征在于，由以下步骤组成：
S1.构建人体肠道微生物组在线仓库数据库，基于所述人体肠道微生物组在线仓库数据库，搜索并下载正常人和结直肠癌患者的肠道菌群的宏基因组数据，并对所述宏基因组数据进行质量控制，对质量控制后的宏基因组数据进行评价，得到质控后的宏基因组数据；
S2.对所述质控后的宏基因组数据进行宏基因组物种注释分析，得到正常人和结直肠癌患者的肠道菌群的物种的丰度信息；
S3.基于所述质控后的宏基因组数据和所述丰度信息，分析正常人与结直肠癌患者之间肠道菌群的差异，并进一步筛选得到正常人和结直肠癌患者中存在差异的差异菌，将所述差异菌输入到所述人体肠道微生物组在线仓库数据库中，查看所述差异菌在正常人的肠道菌群中的丰度，鉴定出结直肠癌致病菌；
S4.根据S2中所述丰度信息，分别选取正常人和结直肠癌患者的肠道菌群的物种的丰度排名前50的细菌，将其合并后根据基因组尺度代谢网络模型，获取所述合并后的细菌在肠道中单独培养以及两两共同培养的条件下的生长率，并基于所述生长率构建肠道菌群互作网络；
S5.基于S4所述的肠道菌群互作网络，筛选抑制S3中所述的结直肠癌致病菌的益生菌；
S6.结合所述益生菌在正常人的肠道菌群的丰度，对S5中所述的益生菌进行优化，得到抑制结肠癌致病菌的益生菌配方；
S7.对S6中所述益生菌配方进行实验动物体内验证。
2.如权利要求1所述的一种抑制结直肠癌致病菌的益生菌配方的筛选方法，其特征在于，S1中采用Trimmomatic软件进行所述质量控制，采用Fastqc软件进行所述质量控制后的评价。
3.如权利要求1所述的一种抑制结直肠癌致病菌的益生菌配方的筛选方法，其特征在于，S2中采用MetaPhIAn2软件进行所述宏基因组物种注释分析。
4.如权利要求1所述的一种抑制结直肠癌致病菌的益生菌配方的筛选方法，其特征在于，S3中采用LefSe进行所述分析，采用随机森林算法进行所述差异菌的筛选。
5.如权利要求1所述的一种抑制结直肠癌致病菌的益生菌配方的筛选方法，其特征在于，S4中将细菌在肠道中单独培养的生长率记为S，将细菌在肠道中两两共同培养的生长率记为P，计算细菌之间的权重W＝log2(P/S)，以所述丰度排名前50的细菌为节点，以细菌之间的权重W为边，利用开源软件Gephi绘制所述肠道菌群互作网络，同时采用Gephi软件中的modularity algorithm功能鉴定肠菌代谢网络中的亚群，采用Gephi软件中的PageRankalgorithm功能鉴定肠菌代谢网络中重要节点。
6.一种采用权利要求1-5任一项所述的抑制结直肠癌致病菌的益生菌配方的筛选方法得到的益生菌配方，其特征在于，丁酸梭菌(Clostridium butyricum)含量为1×109～5×1010CFU/ml，粪肠球菌(Enterococcus faecium)含量为1×108～5×109CFU/ml，短乳杆菌(Lactobacillus brevis)含量为1×108～5×109CFU/ml，植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)含量为1×108～5×109CFU/ml，鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)含量为1×108～5×109CFU/ml，清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)1×108～5×109CFU/ml，肠系膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)含量为1×108～5×109CFU/ml。
7.如权利要求6所述的益生菌配方，其特征在于，丁酸梭菌(Clostridium butyricum)含量为1.3×1010CFU/ml，粪肠球菌(Enterococcus faecium)含量为1×109CFU/ml，短乳杆菌(Lactobacillus brevis)含量为1×109CFU/ml，植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)含量为1×109CFU/ml，鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)含量为1×109CFU/ml，清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)1×109CFU/ml，肠系膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)含量为1×109CFU/ml。
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