KR20140041710A

KR20140041710A - 칼로리 제한 및 칼로리 제한 모방체의 마커 식별

Info

Publication number: KR20140041710A
Application number: KR1020147000682A
Authority: KR
Inventors: 안젤라 마스탈로우디스; 스티브 우드; 토마스 알베르토 프롤라; 제이미 루이스 바거; 리차드 웨인드러크; 조셉 창
Original assignee: 엔에스이 프로덕츠, 인크.
Priority date: 2011-06-15
Filing date: 2012-06-15
Publication date: 2014-04-04
Also published as: WO2012174484A3; JP2016195613A; JP2014518071A; JP7355766B2; US20160257996A1; JP6904676B2; CN107217051A; WO2012174484A2; JP2019037240A; EP2721155A4; US20160186257A1; EP2721155A2; JP2022113834A; US20160208330A1; CN113801878A; CN103732745A; US20130178379A1; JP2021052803A

Abstract

칼로리 제한 (CR)의 마커는 동물을 CR 조건에 노출시킴으로써 그리고 다수의 대상 군에서 CR 조건에 반응하여 차별적으로 발현되는 하나 이상의 유전자를 선택함으로써 선택된 조직에서 식별될 수 있다. 후보 화합물은 후보 화합물로 처리된 동물내 유전자 발현 산물의 조직 수준을 CR 처리된 동물의 것과 비교함으로써 동물에 투여될 때 CR의 효과를 모방할 가능성이 있는 능력에 대해 스크링닝될 수 있다.

Description

칼로리 제한 및 칼로리 제한 모방체의 마커 식별{IDENTIFYING MARKERS OF CALORIC RESTRICTION AND CALORIC RESTRICTION MIMETICS}

정부 권리

본 발명은 국립 보건원(National Institutes of Health)의 국립 노화 연구소(National Institute on Aging)에 의해 수여된 승인 번호 제1R43AG034833-01A1호 하에 정부 지원으로 만들어졌다. 정부는 본 발명에 대해 특정한 권리를 갖는다.

발명의 분야

본 발명은 칼로리 제한의 조직-특이적 바이오마커(biomarker)를 포함하여, 칼로리 제한의 보편적인 바이오마커를 식별하기 위한 방법과 일반적으로 관련된다. 특히, 본 발명은 칼로리 제한으로 발현의 변화를 겪는 유전자의 강력한 패널, 및 칼로리 제한의 이로운 효과를 유도할 수 있는 영양분, 약물, 또는 기타 기능적 성분 (즉, "칼로리 제한 모방체")을 식별하기 위한 이들 보편적인 바이오마커의 용도를 제공한다.

배경

생의 초기에 또는 중년기에 시작하였을 때, 임의의 수준 아래의 칼로리 섭취의 제한 (CR)은 설치류와 같은 포유류를 포함하여, 다수 종의 수명을 증가시키는 것으로, 그리고 많은 연령-관련 질환의 발병을 예방하거나 지연시키는 것으로 나타났다. 실제로, 인간에서 건강 파라미터를 향상시키는 CR의 능력을 검사하기 위해 임상 실험이 개시되었다. 하지만, 음식 부족의 사회적, 생물학적, 그리고 심리학적 결과는 이 식이 요법의 광범위한 실행과 양립할 수 없었다. 이러한 이유 때문에, 연구는 칼로리 섭취 감소의 부재에서 CR의 이로운 효과를 모방할 수 있는 물질의 식별에 주력하였다. 노력은 이들 물질에 동물 또는 세포의 노출 후 CR의 전체적인 유전자 발현 프로파일을 모방할 수 있는 화합물을 찾는 것을 포함하여, CR의 하나 이상의 생리학적 또는 생화학적 효과를 모방하는 화합물을 식별하는 것을 지향하였다. 후자와 관련하여, 유전자 발현 프로파일내 전체적인 변경에 기반하여 CR을 모방하는 화합물을 식별하는 방법이 개시되었다 (Spindler et al., 미국 특허 번호 제6,406,853호).

이러한 기법의 이용가능성에도 불구하고, 검사된 생쥐 모델에서 CR 바이오마커의 보편적인, 조직-특이적 패널이 식별되지 않았다. 상이한 생쥐 계통은 고유한 유전적, 대사성 및 생리학적 특징을 가지기 때문에, 임의의 특정한 생쥐 계통에서 CR에 반응한 임의의 주어진 유전자 발현 변화는 다른 생쥐 계통 또는 유기체에서 재현될 것 같지 않다. 따라서, 지금까지 식별된 유용한 마커는 없다.

발명의 요약

본 개시에서 제시한 기술은 보편적인 CR 바이오마커를 식별함으로써 칼로리 제한 (CR) 바이오마커-즉, 다수의 상이한, 유전적으로 다양한, 동물 계통에 걸쳐 CR 반응에 일관하게 연관된 마커를 식별하기 위한 이전 노력의 부족을 극복한다. 보편적인 CR 바이오마커의 패널의 식별은 동물 계통 또는 품종에 관계없이, 그리고 또한 전체적인 유전자 발현 프로파일링의 요구 없이, CR을 모방하는 화합물의 신속한 스크리닝을 허용한다.

몇몇 구체예에서, 본 개시는 특정 조직내 CR의 강력한 그리고 보편적으로 적용가능한 유전자 발현 마커를 식별하기 위한 시스템 및 방법이 제공된다. 한 가지 구체예는 CR에 반응하여 조직에서 차별적으로 발현되는 폴리뉴클레오티드의 유전자 패널을 제공한다. 특정한 구체예는 쥣과(murine), 갯과(canine), 고양잇과(feline) 또는 인간 조직으로부터의 유전자를 포함한다. 또 다른 측면에서, 유전자 패널은 간 조직, 심장 조직, 폐 조직, 뇌 조직, 상피 조직, 결합 조직, 백색 지방, 골격근, 혈액, 신경 조직, 소변, 및 침 중 어느 하나로부터의 유전자를 포함한다.

몇몇 구체예에서, 평가된 유전자는 표 1, 표 2, 표 3, 표 4, 표 5, 표 6 또는 이의 임의의 조합에서 발견된 하나 이상의 유전자이다. 몇몇 구체예에서, 패널내 유전자는 CR 대상 및 대조군 대상 사이에서의 유전자 발현 변화를 나타낸다. 몇몇 구체예에서, 패널내 유전자는 다양한 CR 동물 모델에 걸친 그들의 확증으로 인해 선택된다.

몇몇 구체예에서, 기술은 CR의 보편적인 마커인 유전자를 혼성화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 이러한 유전자에 의해 인코딩된 폴리펩티드에 결합하는 폴리펩티드 결합제를 포함할 수 있는 조직내 CR의 보편적인 마커의 차별적인 발현을 탐지하기 위한 프로브(probe)를 제공한다. 또 다른 구체예에서, 조성물은 2개 이상 (가령, 3개 이상, 5개 이상, 10개 이상, 20개 이상, 50개 이상 등)의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 프로브를 포함한다. 더 특정한 측면에서, 폴리뉴클레오티드는 심장 조직 또는 골격근 또는 백색 지방 조직으로부터 유래한다.

한 가지 구체예에서, 키트는 표 1 내지 표 6에 열거된 유전자를 특이적으로 혼성화하는 증폭 올리고뉴클레오티드 또는 이의 단편; 및 표 1 내지 표 6에 열거된 단백질을 인코딩하는 유전자를 특이적으로 혼성화하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 단편을 포함한 라벨링된(labeled) 프로브를 포함할 수 있다. 특정한 구체예에서, 프로브는 기질(substrate) (가령, 어레이(array)의 부분으로서)에 결합된다.

몇몇 구체예에서, 본 발명은 다수의 동물 계통의 선택된 조직에서 차별적으로 발현되는 하나 이상의 유전자의 발현 프로파일의 결정에 의해 CR을 모방하기 위한 후보 화합물의 효과를 측정하는 방법을 제공한다.

본 개시는 선택된 조직내 CR의 보편적인 바이오마커의 강력한 세트(set)를 식별하기 위한 방법에 대한 발명자의 개발로부터 비롯된다. 구체예에서, 선택된 조직내 칼로리 제한 (CR)의 조직-특이적 보편적인 마커를 식별하는 방법은 다수의 대상 군에 속하는 대상을 CR 조건에 노출시키는 단계, 및 다양한 대상 군으로부터 대상내 CR에 반응하여 차별적으로 발현되는 하나 이상의 유전자를 선택하는 단계를 포함한다. 선택된 유전자는 적어도 2개, 또는 3개, 또는 그 이상의 대상 군에서 차별적으로 발현될 수 있다. 특정한 구체예에서, 선택된 유전자는 50% 이상의 검사된 대상 군에서 차별적으로 발현된다. 구체예에 따라, 대상 군은 쥣과 군, 갯과 군, 고양잇과 군, 또는 인간 군을 포함할 수 있다.

몇몇 구체예에서, 본 발명은 주어진 조건 또는 후보 화합물이 CR을 모방하는 것에서 효과적일 가능성이 있는지 평가하는 방법 또는 대상내 하나 이상의 CR 모방 혜택이 제공된다. 방법은 일차 대상을 CR에 노출시키는 단계, 일차 대상으로부터의 조직 샘플내 2개 이상의 유전자의 발현 산물의 수준을 측정하여 CR 발현 프로파일을 얻는 단계, 이차 대상에 후보 화합물을 투여하는 단계; 이차 대상으로부터의 조직 샘플내 발현 산물을 측정하는 단계; 및 수준을 비교하여 후보 화합물이 CR을 모방하는 정도를 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 마이크로어레이(microarray) 분석, 역전사효소 PCR, 정량적 역전사효소 PCR, 또는 혼성화 분석 중 어느 하나는 샘플내 발현 산물 (가령, mRNA)을 측정하는 데에 이용될 수 있다. 이렇게 평가된 다수의 후보 화합물은 이들 각각이 CR을 모방하는 정도에 기반하여 순위가 매겨질 수 있다.

도면의 간단한 설명

도 1은 대조군과 CR 처리된 군에서 생쥐의 체중을 보여주는 그래프 세트이다.

구체예의 상세한 설명

정의

용어 "투여", 및 "투여하는"은 물질이 대상에게 제공되는 방식을 나타낸다. 투여는 해당 분야에 공지된 여러 가지 경로, 가령 경구, 비경구, 경피, 흡입, 주입 등에 의해 성취될 수 있다. 따라서, 경구 투여는 약물을 포함한 경구 제형의 삼키기, 씹기, 빨기에 의해, 또는 액체 또는 반-액체 형태를 가령, 마시기 또는 위관영양을 통해 소화시킴에 의해 성취될 수 있다. 비경구 투여는 정맥내, 동맥내, 근육내, 척추강내, 또는 피하내 등으로 약물 조성물을 주사함으로써 성취될 수 있다. 경피 투여는 피부 표면 상으로 경피 제조물의 바르기, 붙이기, 밀어 펴기, 부착하기, 붓기, 압축하기, 문지르기 등에 의해 성취될 수 있다. 투여의 이들 그리고 추가적인 방법은 해당 분야에서 잘 공지된다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "조건"은 대상에게 적용되거나 또는 투여될 수 있는 임의의 외부 요인으로서 정의된다. 이 용어는 대상에게 투여될 수 있는 화합물, 대상에게 적용될 수 있는 환경 요인, 대상에 영향을 줄 수 있는 자극 등을 나타낸다. 조건은 정성적(qualitative) 또는 정량적(quantitative)일 수 있다. 따라서, 이 용어는 제약, 식품 보충제, 식이 요법, 건강 요법, 식이 보충제, 기능식품, 환경, 식품, 감정의 자극, 심리적 자극, 물리적 자극, 유전자 변형 등을 포함한다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "조직"은 세포간 물질과 함께, 구성물질을 형성하는 세포의 집합체를 의미한다. 세포는 모두 특정한 유형의 것일 수 있고, 또는 다수의 세포 유형의 것일 수도 있다. 조직은 상피 조직, 결합 조직, 근육 조직, 혈액, 또는 신경 조직에서 선택된, 하지만 이에 제한되지 않는 동물 조직의 유형 중 어느 하나일 수 있다. 조직은 임의의 동물 (가령, 인간, 생쥐 등)로부터 비롯된 것일 수 있다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "올리고뉴클레오티드"는 2개 이상의, 바람직하게는 3개 이상의 리보뉴클레오티드로 구성된 분자로서 정의된다. 이의 정확한 크기는 결과적으로, 궁극적인 기능 및 올리고뉴클레오티드의 용도에 의존하는 많은 요인에 의존할 것이다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "핵산 분자"는 DNA 또는 RNA를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 분자를 함유한 임의의 핵산을 나타낸다. 상기 용어는 4-아세틸사이토신, 8-하이드록시-N6-메틸아데노신, 아지리디닐사이토신, 슈도이소사이토신(pseudoisocytosine), 5-(카르복시하이드록실메틸) 우라실, 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸우라실, 디하이드로우라실, 이노신, N6-이소펜테닐아데닌, I-메틸아데닌, 1메틸슈도우라실, I-메틸구아닌, I-메틸이노신, 2,2-디메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸사이토신, 5-메틸사이토신, N6-메틸아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우라실, 베타-D-만노실퀘오신, 5'-메톡시카르보닐메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N6 -이소펜테닐아데닌, 우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우라실-5-옥시아세트산, 옥시부토속신, 슈도우라실, 퀘오신, 2-티오사이토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, N-우라실 5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우라실-5-옥시아세트산, 슈도우라실, 퀘오신, 2-티오사이토신, 및 2,6-디아미노퓨린을 포함하지만, 이제 제한되지 않는 DNA 및 RNA의 공지된 염기 유사체 중 어느 하나를 포함하는 서열을 내포한다.

용어 "유전자"는 폴리펩티드, 전구체, 또는 RNA (가령, rRNA, tRNA)의 생산에 필수적인 코딩 서열을 포함하는 핵산 (가령, DNA) 서열을 나타낸다. 전장 또는 단편의 바람직한 활성도 또는 기능적 특성 (가령, 효소 활성도, 리간드 결합, 신호 전달, 면역원성 등)이 보유되는 한 폴리펩티드는 전장 코딩 서열에 의해 또는 코딩 서열의 임의의 부분에 의해 인코딩될 수 있다. 상기 용어는 구조 유전자의 코딩 영역 그리고 상기 유전자가 전장 mRNA의 길이에 상응하도록 어느 하나의 말단에서 약 1 kb 이상의 거리에 걸쳐 5' 및 3' 말단 상의 코딩 영역에 인접하여 위치한 서열을 또한 내포한다. 코딩 영역의 5'에 위치한 그리고 mRNA 상에 존재하는 서열은 5' 비-번역 서열로서 나타난다. 코딩 영역의 3' 또는 다운스트림에 위치한 그리고 mRNA에 존재하는 서열은 3' 비-번역 서열로서 나타난다. 용어 "유전자"는 cDNA 및 유전자의 게놈 형태 둘 모두를 내포한다. 유전자의 게놈 형태 또는 클론은 "인트론(intron)" 또는 "개재 영역(intervening region)" 또는 "개재 서열(intervening sequence)"로 불리우는 비-코딩 서열로 방해되는 코딩 영역을 함유한다. 인트론은 핵 RNA (hnRNA) 내로 전사되는 유전자의 조각이다; 인트론은 인핸서(enhancer)와 같은 조절 요소를 함유할 수 있다. 인트론은 핵 또는 일차 전사물로부터 제거되거나 "잘려 나간다(spliced out)"; 따라서 인트론은 전령 RNA (mRNA) 전사물에서 부재한다. mRNA는 신생 폴리펩티드내 아미노산의 서열 또는 순서를 구체화하기 위해 전사 동안에 기능한다.

용어 "유전자 패널" 및 이의 변이체는 식별된 유전자의 군, 그리고 특히 몇 가지 일반적인 특성 또는 특징에 기반하여 선택된 군을 나타낸다. 예를 들어, 유전자 패널은 몇 가지 치료법 또는 환경 요인 (가령 칼로리 제한 요법)에 의해 변형되는 것으로 발견된 다수의 유전자를 포함할 수 있다. 이 용법에 따라, 용어 "패널"은 유전자의 그룹핑(grouping), 가령 "클러스터(cluster)", "시그니처(signature)", "슈퍼마커(supermarker)", "패턴(pattern)" 등을 명시하는 다른 명칭에 의해 나타내질 수 있다.

본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "발현"은 전사, 번역, 또는 둘 모두를 나타내는 데에 사용될 수 있다. 이에 따라, "발현 산물"은 전사의 산물 (가령, mRNA), 그리고 번역의 산물 (가령, 폴리펩티드)을 나타낸다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "유전자 발현 수준에서의 변화"는 대조군 대상내 수준과 비교하여 검사 대상 (가령, CR 대상 또는 검사 조건에 노출된 대상)내 더 높거나 더 낮은 수준의 유전자 발현 (가령, mRNA 또는 단백질 발현)을 나타낸다.

2개의 DNA 서열은 적어도 약 75% (바람직하게는 적어도 약 80%, 그리고 더 바람직하게는 적어도 약 90% 또는 95%)의 뉴클레오티드가 DNA 서열의 정의된 길이에 대해 일치할 때 "실질적으로 상동"이다. 실질적으로 상동인 서열은 서열 데이터 은행(sequence data bank)에서, 또는 예를 들어 특정한 시스템에 대해 정의된 바와 같은 엄격한 조건 하에 서던(Southern) 혼성화 실험에서 이용가능한 표준 소프트웨어를 이용하여 서열을 비교함으로써 식별될 수 있다. 적절한 혼성화 조건을 정의하는 것은 해당 분야의 기술 내에 있다. 가령, Maniatis et al., supra; DNA Cloning, Vols. I & II, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra를 참고한다.

용어 "표준 혼성화 조건"은 혼성화 및 세척 둘 모두를 위해 5배의 식염수-나트륨-시트레이트 (SSC) 완충액 및 65℃와 실질적으로 동일한 염 및 온도 조건을 나타낸다. 하지만, 해당 분야의 통상의 기술자는 이러한 "표준 혼성화 조건"이 완충액내 나트륨 및 마그네슘의 농도, 뉴클레오티드 서열 길이 및 농도, 미스매치(mismatch) 퍼센트, 포름아미드 퍼센트 등을 포함한 특정한 조건에 의존한다는 점을 이해할 것이다. 또한 "표준 혼성화 조건"의 결정에서 중요한 것은 혼성화하는 2개의 서열이 RNA-RNA, DNA-DNA 또는 RNA-DNA인지 아닌지이다. 이러한 표준 혼성화 조건은 잘 공지된 제조법에 따라 해당 분야의 통상의 기술자에 의해 쉽게 결정되며, 여기서 혼성화는 원한다면, 더욱 엄격한 세척과 함께 예측되거나 결정된 T_m보다 전형적으로 10-20℃ 아래이다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "상보적인" 또는 "상보성"은 염기-쌍 규칙으로 관련되는 폴리뉴클레오티드 (즉, 뉴클레오티드의 서열)과 관련하여 사용된다. 예를 들어, 서열 "5'-A-G-T-3'"은 서열 "3'-T-C-A-5'"와 상보적이다. 상보성은 "부분적"일 수 있으며, 여기서 핵산의 염기의 단지 일부만이 염기 쌍 규칙에 따라 일치된다. 또는, 핵산 사이의 "완전한" 또는 "전체" 상보성이 있을 수 있다. 핵산 가닥 사이의 상보성 정도는 핵산 가닥 사이 혼성화의 효능 및 강도에 유의적인 효과를 가진다. 이것은 핵산 사이의 결합에 의존하는 탐지 방법뿐만 아니라, 증폭 반응에서도 특정한 중요성에 속한다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "증폭 올리고뉴클레오티드"는 표적 핵산, 또는 이의 보체에 혼성화하고, 그리고 핵산 증폭 반응에 참여하는 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. 증폭 올리고뉴클레오티드의 예시는 주형 핵산에 혼성화하는 및 증폭 과정에서 중합효소에 의해 연장되는 3' OH 말단을 함유하는 "프라이머"이다. 증폭 올리고뉴클레오티드의 또 다른 예시는 중합효소에 의해 연장되지는 않지만 (가령, 3' 차단된 말단을 가지므로) 증폭에 참여하거나 증폭을 촉진시키는 올리고뉴클레오티드이다. 증폭 올리고뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드 또는 유사체, 또는 증폭 반응에 참여하지만 표적 핵산에 상보적이지 않은 또는 표적 핵산에 함유되지 않는 추가적인 뉴클레오티드를 임의선택적으로 포함할 수 있다. 증폭 올리고뉴클레오티드는 표적 또는 주형 서열에 상보적이지 않은 서열을 함유할 수 있다. 예를 들어, 프라이머의 5' 영역은 표적 핵산에 비-상보적인 프로모터 서열을 포함할 수 있다 ("프로모터-프라이머"로 언급됨). 해당 분야의 통상의 기술자는 프라이머로서 기능하는 증폭 올리고뉴클레오티드가 변형되어 5' 프로모터 서열을 포함하고, 따라서 프로모터-프라이머로서 기능할 수 있다는 점을 이해할 것이다. 유사하게, 프로모터-프라이머는 프로모터 서열의 제거에 의해, 또는 프로모터 서열 없이 합성에 의해 변형될 수 있고 그리고 여전히 프라이머로서 기능할 수 있다. 3' 차단된 증폭 올리고뉴클레오티드는 프로모터 서열을 제공할 수 있고 폴리머화를 위한 주형으로서 역할을 할 수 있다 ("프로모터-제공자"로 언급됨).

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "프라이머"는 정제된 제한 소화에서와 같이 자연적으로 발생하든지 또는 합성으로 생산되는, 올리고뉴클레오티드를 나타내며, 여기서 상기 올리고뉴클레오티드는 핵산 가닥에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건 하에 배치될 때 (즉, 뉴클레오티드 및 유도제 가령, DNA 중합효소의 존재에서 그리고 적합한 온도 및 pH에서) 합성의 개시점으로서 작용할 수 있다. 프라이머는 증폭에서의 최대 효능을 위해 바람직하게는 단일 가닥이지만, 대안적으로 이중 가닥이 될 수도 있다. 이중 가닥이라면, 프라이머는 연장 산물을 제조하는 데에 이용되기 전에 이의 가닥을 분리시키기 위해 우선 처리된다. 바람직하게, 프라이머는 올리고데옥시리보뉴클레오티드이다. 프라이머는 유도제의 존재에서 연장 산물의 합성을 준비시키기 위해 충분히 길어야 한다. 프라이머의 정확한 길이는 온도, 프라이머 공급원 및 방법의 용도를 포함하여, 많은 요인에 의존할 것이다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "프로브"는 정제된 제한 소화에서와 같이 자연적으로 발생하든지 또는 합성으로, 재조합으로 또는 PCR 증폭에 의해 생산되는, 올리고뉴클레오티드 (즉, 뉴클레오티드의 서열)을 나타내며, 여기서 상기 올리고뉴클레오티드는 또 다른 관심 올리고뉴클레오티드의 적어도 일부에 혼성화할 수 있다. 프로브는 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있다. 프로브는 특정한 유전자 서열의 탐지, 식별 및 단리에서 유용하다. 본 발명에서 이용된 임의의 프로브는 임의의 "리포터 분자(reporter molecule)"로 라벨링될 것이고, 따라서 효소 (가령, ELISA, 그리고 효소-기반 조직화학 어세이), 형광, 방사능, 및 발광 시스템을 포함하지만, 이제 제한되지 않는 임의의 탐지 시스템에서 탐지가능하다는 점이 고려된다. 본 발명이 임의의 특정한 탐지 시스템 또는 라벨에 제한된다는 것은 의도되지 않는다.

"단리된 올리고뉴클레오티드" 또는 "단리된 폴리뉴클레오티드"에서와 같이, 핵산에 관하여 사용될 때 용어 "단리된"은 일반적으로 천연 공급원과 연관되는 적어도 하나의 성분 또는 오염물질로부터 식별되고 분리된 핵산 서열을 나타낸다. 단리된 핵산은 자연에서 발견되는 것과는 다른 형태 또는 셋팅(setting)에서 존재한다. 대조적으로, 비-단리된 핵산은 핵산, 가령 그들이 자연에서 존재하는 상태에서 발견되는 DNA 및 RNA를 포함한다. 예를 들어, 주어진 DNA 서열 (가령, 유전자)은 근처 유전자에 근접한 숙주 세포 염색체 상에서 발견되고; RNA 서열, 가령 특정 단백질을 인코딩하는 특이적인 mRNA 서열은 다수의 단백질을 인코딩하는 수많은 기타 mRNA와의 혼합물로서 세포에서 발견된다. 하지만, 주어진 단백질을 인코딩하는 단리된 핵산은 예로서, 주어진 단백질을 일반적으로 발현하는 세포내 이러한 핵산을 포함하며, 여기서 핵산은 천연 세포의 것과는 다른 염색체 위치에 있거나, 그렇지 않으면 자연에서 발견되는 것과 다른 핵산 서열의 측면에 배치된다. 단리된 핵산, 올리고뉴클레오티드, 또는 폴리뉴클레오티드는 단일-가닥 또는 이중-가닥 형태로 존재할 수 있다. 단리된 핵산, 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드가 단백질을 발현하는 데에 활용되기 위함일 때, 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드는 최소로 센스(sense) 또는 코딩 가닥을 함유할 것이지만 (즉, 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드는 단일-가닥일 수 있음), 센스 및 안티-센스 가닥 둘 모두를 함유 할 수 있다 (즉, 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드는 이중-가닥일 수 있음).

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "정제된" 또는 "정제하기 위한"은 샘플로부터 성분 (가령, 오염물질)의 제거를 나타낸다. 예를 들어, 항체는 오염된 비-면역글로불린 단백질의 제거에 의해 정제되고; 그들은 또한 표적 분자에 결합하지 않는 면역글로불린의 제거에 의해 정제된다. 비-면역글로불린 단백질의 제거 및/또는 표적 분자에 결합하지 않는 면역글로불린의 제거는 샘플내 표적-반응 면역글로불린의 퍼센트 증가를 야기한다. 또 다른 예시에서, 재조합 폴리펩티드는 박테리아 숙주 세포에서 발현되고 그리고 폴리펩티드는 숙주 세포 단백질의 제거에 의해 정제된다; 따라서 재조합 폴리펩티드의 퍼센트는 샘플에서 증가된다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "대상" 및 "환자"는 임의의 동물, 가령 개, 고양이, 새, 가축, 생쥐, 쥐(rat), 및 인간과 같은 포유류를 나타낸다.

구절 "후보 화합물" 또는 "후보 물질"은 생체 기능의 질병, 병, 아픔, 또는 질환을 치료하거나 예방하는 데에 또는 그렇지 않으면 노화를 거스르는 것과 같이, 샘플의 생리학적 또는 세포 상태를 변경하는 데에 이용될 수 있는 임의의 화학적 엔티티(entity), 제약, 약물 등을 나타낸다. 검사 화합물은 공지된 및 잠재적인 치료학적 화합물 둘 모두를 포함한다. 검사 화합물은 본 발명의 스크리닝 방법을 이용하여 스크리닝함으로써 치료제로 결정될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "식품 재료"는 인간 또는 비-인간 동물에게 급식되는 임의의 식품 유형을 나타낸다. 식품 재료는 식품 성분 (가령, 반죽, 플레이크(flake)), 식품 중간물 (산물 또는 성분을 만드는 데에 이용되는 전환 단계) 및 식품 구성요소를 포함한다. 식품 재료는 식물, 곰팡이, 또는 동물 기원의 재료 또는 합성 공급원의 재료일 수 있다. 식품 재료는 신체 영양분 가령 탄수화물, 단백질, 지방, 비타민, 미네랄, 섬유질, 셀룰로오스 등을 함유할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "기능식품"은 인간 또는 동물에 의해 소모될 때 식이 또는 건강 혜택을 제공할 수 있는 임의의 화합물 또는 화학물질을 나타낸다. 기능식품의 예시는 비타민, 미네랄, 파이토뉴트리언트(phytonutrient) 등을 포함한다. 기능식품의 의도는 식품과는 연관될 수 없는 건강 혜택 또는 바람직한 생리학적 효과를 주기 위함이다.

본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "제약학적 약제 또는 약물"은 환자에게 적절하게 투여될 때 치료학적 효과를 유도할 수 있는 화학적 화합물 또는 조성물을 나타낸다. 본 명세서에서 기타 화학 용어는 The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985), 참조로서 본 명세서에 편입됨)에 의해 예시화된 바와 같이, 해당 분야에서 기존의 용법에 따라 사용된다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "식이 보충제"는 총 일일 섭취량 또는 농축물, 대사산물, 구성성분, 추출물, 또는 이들의 조합을 증가시킴으로써 규정식(diet)을 보충하는 데에 인간에 의해 사용하기 위한 비타민, 미네랄, 미량영양소, 파이토뉴트리언트, 허브 또는 기타 식물, 아미노산, 식이 물질을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 하나 이상의 식이 성분을 가지고 있거나 함유하는 규정식을 보충하는 것으로 의도되는 산물을 나타낸다. 유사한 정의가 세계의 다른 지역, 가령 유럽에 존재한다. "식이 보충제" 또는 유사한 식료품에 관한 상이한 명칭은 가령, "식품 보충제", "기능식품", "기능성 식품" 또는 단순하게 "식품"으로 전 세계에서 사용된다. 본 맥락에서 용어 "식품 보충제"는 임의의 이러한 명칭 또는 정의를 포함시킨다.

본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "유전자 변형"은 외인성 DNA의 의도적인 도입에 의한 전구체 세포의 유전자형의 안정한 또는 일시적인 변경을 나타낸다. DNA는 합성한 것이거나, 자연적으로 파생될 수 있으며, 그리고 유전자, 유전자 부분, 또는 기타 유용한 DNA 서열을 함유할 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "유전자 변형"은 자연적으로 발생한 변경 가령 자연적인 바이러스 활성도, 자연적인 유전자 재조합 등을 통해 발생한 것을 또한 포함할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "환경 조건"은 환경의 물질적 측면을 하나 이상 포함하는 것으로 정의된다. 환경 조건은 대상에 영향을 줄 수 있는 또는 영향을 줄 수 없는 임의의 외부 요인을 포함할 수 있다 (온도, 기압, 가스 농도, 산소 수준, 방사선, 공기 중 미립자 등).

용어 "식이 요법"은 식품 재료, 성분, 또는 물을 포함한 성분의 혼합물을 나타내며, 이는 시간이 지남에 따라 동물 대상에 의해 소모된다. 용어 "식이 요법"은 소모되는 특정 식품 재료, 다양한 식품 재료, 소모되는 부피, 식품 재료의 공급원, 급식 빈도, 급식 시간 등을 고려할 수 있다.

용어 "건강 요법"은 동물 대상의 일일 활동을 나타내며, 이는 시간이 지남에 따라, 대상의 전반전인 건강에 영향을 줄 수 있다. 용어 "건강 요법"은 식이 요법, 보충제의 용도, 제약의 용도, 운동, 수면/휴식, 스트레스 등을 고려할 수 있다.

용어 "제제" 및 "조성물"은 본 명세서에서 상호교환적으로 사용될 수 있다.

농도, 양, 용해도, 및 기타 수치 데이터는 범위 형식으로 본 명세서에서 제시될 수 있다. 이러한 범위 형식은 단지 편의와 간결성을 위해 이용되고 범위 제한으로서 명료하게 나열된 수치만 포함하는 것뿐만 아니라 각각의 수치 및 부분-범위(sub-range)가 명료하게 나열된 것처럼 범위 내에 내포된 모든 개별적인 수치 또는 부분-범위를 포함하도록 융통성 있게 해석되어야 한다는 것으로 이해된다. 예를 들어, 0.1 내지 5 ng/ml의 농도 범위는 0.1 ng/ml 및 5 ng/ml의 명료하게 나열된 농도 제한을 포함하는 것뿐만 아니라 개별적인 농도 가령 0.2 ng/ml, 0.7 ng/ml, 1.0 ng/ml, 2.2 ng/ml, 3.6 ng/ml, 4.2 ng/ml, 및 부분-범위 가령, 0.3-2.5 ng/ml, 1.8-3.2 ng/ml, 2.6-4.9 ng/ml 등을 포함하도록 해석되어야 한다. 이 해석은 범위의 폭 또는 설명되는 특징에 상관 없이 적용되어야 한다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "약(about)"은 치수, 공식화, 파라미터, 및 기타 수량 및 특징이 정확하지 않고 그리고 정확할 필요는 없지만, 대략적일 수 있고 및/또는 원하는 대로, 더 크거나 더 작을 수 있다는 것을 의미하며, 이는 내성, 전환 계수, 반올림, 측정 오차 등 및 통상의 기술자에게 공지된 기타 요인을 반영한다. 추가로, 달리 명시되지 않는 한, 용어 "약"은 범위 및 수치 데이터에 관한 상기 논의와 일치하는, "정확하게"를 명확히 포함할 것이다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "실질적으로"는 작용, 특징, 특성, 상태, 구조, 항목, 또는 결과의 완전한 또는 거의 완전한 규모 또는 정도를 나타낸다. 예를 들어, "실질적으로" 둘러싸인 물체는 물체가 완전하게 둘러싸이거나 거의 완전하게 둘러싸인 것을 의미할 것이다. 절대적인 완전성으로부터 편차의 정확한 허용가능 정도는 몇몇 경우에, 특정 상황에 의존할 수 있다. 하지만, 일반적으로 완성에 가까움은 절대적 및 전체 완성이 얻어진 것처럼 동일한 전반적인 결과를 같도록 할 것이다. "실질적으로"의 용도는 작용, 특징, 특성, 상태, 구조, 항목, 또는 결과의 완전한 또는 거의 완전한 결핍을 나타내는 데에 부정적 함축에서 사용될 때 동일하게 적용가능하다. 예를 들어, 입자가 "실질적으로 없는" 조성물은 입자가 완전하게 결핍이거나, 또는 입자가 거의 완전하게 결핍일 것이며, 여기서 입자가 거의 완전하게 결핍인 것은 입자가 완전하게 결핍된 것과 같이 효과가 동일하다. 다시 말해, 성분 또는 요소가 "실질적으로 없는" 조성물은 이의 측정가능한 효과가 없는 한 이러한 항목을 여전히 실제로 함유할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 다수의 항목, 구조 요소, 구성적 요소, 및/또는 재료는 편의를 위해 공통 목록에서 제시될 수 있다. 하지만, 이들 목록은 목록의 각각의 구성원이 분리된 그리고 고유한 구성원으로서 개별적으로 식별되는 것처럼 이해되어야 한다. 따라서, 이러한 목록의 어떠한 개별적인 구성원도 반대로 명시됨 없이 오로지 공통 군내 이들의 제시에 기반하여 동일한 목록의 임의의 기타 구성원의 사실상 등가물로서 이해되어서는 안된다.

본 발명은 기관-특이적 기반에 기초하여 CR의 대사 효과를 모방하는 조건을 식별하기 위한 방법과 일반적으로 관련된다. 특히, 본 발명은 CR로 발현에서의 변화를 겪는 유전자의 패널을 제공한다. 이 유전자의 패널은 CR에 대한 마커를 제공한다. 패널은 CR을 모방하는 효과를 갖는 조건 (가령 제약, 치료요법, 식품, 보충제, 환경 요인 등)에 대해 조사하는 데에 이용될 수 있다.

본 발명을 실시하기 위한 특정한 예시적인 구체예가 아래에서 더 상세하게 설명된다. 본 발명은 이들 특정한 구체예에 제한되지 않는다.

유전자 발현의 평가

매우 다양한 기술이 본 발명의 마커의 유전자 발현을 평가하는 데에 이용될 수 있다. 예시적인 방법, 키트, 및 시약이 본 명세서에서 설명된다.

몇몇 구체예에서, 마이크로어레이가 마커 발현을 평가하는 데에 이용된다. 마이크로어레이는 CR과 연관된 그리고 표 1-3에서 식별된 유전자에 대한 특이성을 갖는 다수의 상이한 올리고뉴클레오티드를 갖는 것으로 고려되며, 상기 올리고뉴클레오티드는 고형 지지체의 표면에 부착된다. 몇몇 구체예에서, 샘플은 검사 대상 (가령, 노화시 이의 효과에 대해 CR과 비교되는 조건 하에 대상) 그리고, 임의선택적으로, 대조군 대상의 조직 RNA 샘플로부터 제조되고 그리고 제조된 샘플은 혼성화를 위해 마이크로어레이에 적용된다는 점이 고려된다. 대조군 샘플과 비교하여 검사 샘플의 차별적인 혼성화 또는 미리 설정된(pre-established) 대조군 값 (가령 CR 하에 얻은 발현 프로파일로부터)과 비교하여 검사 샘플의 발현양은 노화에서 검사된 조건의 효과를 식별한다.

상이한 종류의 생물학적 어세이는 DNA 마이크로어레이 (가령, cDNA 마이크로어레이 및 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이); 단백질 마이크로어레이; 조직 마이크로어레이; 형질감염 또는 세포 마이크로어레이; 화학적 화합물 마이크로어레이; 그리고, 항체 마이크로어레이를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 마이크로어레이로 명명된다. 일반적으로 유전자 칩(chip), DNA 칩, 또는 바이오칩으로 공지된, DNA 마이크로어레이는 발현 프로파일링의 목적을 위해 어레이를 형성하거나 동시에 수 천 개의 유전자에 대해 발현 수준을 모니터링하는 고형 표면 (가령, 유리, 플라스틱 또는 실리콘 칩)에 부착된 미세한 DNA 점(DNA spot)의 수집이다. 부착된 DNA 조각은 프로브로 공지되고, 수 천개의 이들은 단일 DNA 마이크로어레이에서 이용될 수 있다. 마이크로어레이는 질병 및 정상 세포에서 유전자 발현을 비교함으로써 질병 유전자를 식별하는 데에 이용될 수 있다. 마이크로어레이는 유리 슬라이드(slide) 상에 뾰족한 핀(fine-pointed pin)으로 인쇄(printing); 미리 만들어진 마스크(mask)를 이용한 사진평판(photolithography); 역학적인 마이크로미러(micromirror) 장치를 이용한 사진평판; 잉크-제트(ink-jet) 인쇄; 또는 미소전극 어레이 상의 전기화학을 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 다양한 기술을 이용하여 제작될 수 있다.

서던 및 노던(Northern) 블로팅(blotting)이 각각, 특이적 DNA 또는 RNA 서열을 탐지하는 데에 또한 이용될 수 있다. 샘플로부터 추출된 DNA 또는 RNA는 분열되고, 매트릭스 겔 상에서 전기영동으로 분리되고, 그리고 막 여과기로 이동된다. DNA 또는 RNA가 결합된 여과기는 관심 서열과 상보적인 라벨링된 프로브로 혼성화 처리된다. 여과기에 결합된 혼성화된 프로브가 탐지된다. 절차의 변형은 역 노던 블롯이며, 여기서 막에 부차된 기질 핵산은 단리된 DNA 단편의 수집물이고 프로브는 조직으로부터 추출되고 라벨링된 RNA이다.

게놈 DNA 및 mRNA는 탐지에 앞서 또는 탐지와 동시에 증폭될 수 있다. 핵산 증폭 기술의 실례적 비-제한 예시는 중합효소 연쇄 반응 (PCR), 역전사 중합효소 연쇄 반응 (RT-PCR), 전사-매개 증폭 (TMA), 리가아제 연쇄 반응 (LCR), 가닥 치환 증폭 (SDA), 및 핵산 서열 기반 증폭 (NASBA)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 해당 분야의 통상의 기술자는 특정한 증폭 기술 (가령, PCR)은 증폭에 앞서 RNA가 DNA로 역전사되는 것을 요구하고 (가령, RT-PCR), 반면에 다른 증폭 기술은 직접적으로 RNA를 증폭시킨다는 것 (가령, TMA 및 NASBA)을 인지할 것이다.

일반적으로 PCR로 언급되는, 중합효소 연쇄 반응 (미국 특허 번호 제4,683,195호, 제4,683,202호, 제4,800,159호 및 제4,965,188호, 이들 각각은 이들 전체로 참조로서 본 명세서에 편입됨)은 표적 핵산 서열의 복사 수를 기하급수적으로 증가시키는 데에 다중 주기의 변성, 반대 가닥에 프라이머 쌍의 어닐링(annealing), 및 프라이머 연장을 이용한다. RT-PCR로 불리는 변형에서, 역전사효소 (RT)는 mRNA로부터 상보적인 DNA (cDNA)를 만드는 데에 이용되고, 이후 cDNA는 PCR에 의해 증폭되어 다수의 DNA 복사물을 생산한다. PCR의 기타 여러 가지 순열에 대하여, 가령, 미국 특허 번호 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,800,159호; Mullis et al., Meth. Enzymol. 155: 335 (1987); 및, Murakawa et al., DNA 7: 287 (1988)을 참고하고, 이들 각각은 이들 전체로 참조로서 본 명세서에 편입된다.

일반적으로 TMA로 언급되는, 전사 매개 증폭 (미국 특허 번호 제5,480,784호 및 제5,399,491호, 이들 각각은 이들 전체로 참조로서 본 명세서에 편입됨)은 실질적으로 일정한 온도, 이온 강도, 및 pH의 조건 하에 자가촉매적으로 다수의 표적 핵산 서열 복사물을 합성하며 여기서 표적 서열의 많은 RNA 복사물은 추가적인 복사물을 자가촉매적으로 발생시킨다. 가령, 미국 특허 번호 제5,399,491호 및 제5,824,518호를 참고하고, 이들 각각은 이들 전체로 참조로서 본 명세서에 편입된다. 미국 공개공보 번호 제20060046265호 (이의 전체로 참조로서 본 명세서에 편입됨)에서 설명된 변형에서, TMA는 TMA 공정 민감도 및 정확성을 개선하기 위해 차단 모이어티(moiety), 종결 모이어티, 및 기타 변형 모이어티의 용도를 임의선택적으로 포함한다.

일반적으로 LCR로 언급되는, 리가아제 연쇄 반응 (Weiss, R., Science 254: 1292 (1991), 이의 전체로 참조로서 본 명세서에 편입됨)은 표적 핵산의 인접한 영역에 혼성화하는 두 가지 상보적인 DNA 올리고뉴클레오티드 세트를 이용한다. DNA 올리고뉴클레오티드는 반복된 주기의 열 변성, 혼성화 및 결찰에서 DNA 리가아제에 의해 공유결합으로 연결되어 탐지가능한 이중-가닥 결찰 올리고뉴클레오티드 산물을 생산한다.

일반적으로 SDA로 언급되는, 가닥 치환 증폭 (Walker, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 392-396 (1992); 미국 특허 번호 제5,270,184호 및 제5,455,166호, 이들 각각은 이들 전체로 참조로서 본 명세서에 편입됨)은 표적 서열의 반대 가닥에 프라이머 서열 쌍을 어닐링하는 주기, 이중 헤미포스포로티오에이트화된(hemiphosphorothioated) 프라이머 연장 산물을 생산하기 위해 dNTPαS의 존재에서 프라이머 연장, 반 변형된 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위의 엔도뉴클레아제-매개 니킹(nicking), 그리고 존재하는 가닥을 치환하기 위해 및 다음 차례의 프라이머 어닐링, 니킹, 및 가닥 치환을 위한 가닥을 생산하기 위해 끊긴 부위(nick)의 3' 말단으로부터 중합효소-매개 프라이머 연장을 이용하며, 이는 산물의 기하학적인 증폭을 야기한다. 호열성 SDA (tSDA)은 본질적으로 동일한 방법에서 더 높은 온도로 호열성 엔도뉴클레아제 및 중합효소를 이용한다 (유럽 특허 번호 제0 684 315호).

다른 증폭 방법은 예를 들어, 일반적으로 NASBA로 언급되는, 핵산 서열 기반 증폭 (미국 특허 번호 제5,130,238호, 이의 전체로 참조로서 본 명세서에 편입됨); 프로브 분자 자체를 증폭시키는 데에, 일반적으로 Qβ 복제효소로 언급되는, RNA 복제효소를 이용하는 것 (Lizardi et al., BioTechnol. 6: 1197 (1988), 이의 전체로 참조로서 본 명세서에 편입됨); 전사 기반 증폭 방법 (Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173 (1989)); 그리고, 자가-유지 서열 복제 (Guatelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874 (1990), 이의 각각은 이의 전체로 참조로서 본 명세서에 편입됨)를 포함한다. 공지된 증폭 방법의 추가적인 논의를 위하여, Persing, David H., "In Vitro Nucleic Acid Amplification Techniques" in Diagnostic Medical Microbiology: Principles and Applications (Persing et al., Eds.), pp. 51-87 (American Society for Microbiology, Washington, DC (1993))을 참고한다.

비-증폭된 또는 증폭된 핵산은 임의의 기존 수단에 의해 탐지될 수 있다. 예를 들어, 몇몇 구체예에서, 표 1-3에서 선택된 패널로부터의 핵산은 탐지가능하게 라벨링된 프로브를 이용한 혼성화 및 결과적 혼성체의 측정에 의해 탐지된다. 탐지 방법의 실례적 비-제한 예시는 하기 설명된다.

한 가지 예시적 탐지 방법인, 혼성화 보호 어세이(Hybridization Protection Assay) (HPA)는 표적 서열에 화학발광 올리고뉴클레오티드 프로브 (가령, 아크리디늄 에스테르-라벨링된 (AE) 프로브)를 혼성화하는 단계, 선택적으로 비혼성화된 프로브 상에 존재하는 화학발광 라벨을 가수분해하는 단계, 및 광도계내 남아있는 프로브로부터 생산된 화학발광을 측정하는 단계를 포함한다. 가령, 미국 특허 번호 제5,283,174호 및 Norman C. Nelson et al., Nonisotopic Probing, Blotting, and Sequencing, ch. 17 (Larry J. Kricka ed., 2d ed. 1995, 이들 각각은 이들 전체로 참조로서 본 명세서에 편입됨)을 참고한다.

또 다른 예시적 탐지 방법은 실시간(real-time)으로 증폭 공정의 정량적 평가에 대해 제공한다. "실시간"으로 증폭 공정의 평가는 증폭 반응 동안에 지속적으로 또는 주기적으로 반응 혼합물내 앰플리콘(amplicon)의 양을 측정하는 것, 및 초기에 샘플내 존재하는 표적 서열의 양을 계산하는 데에 측정된 값을 이용하는 것을 포함한다. 실시간 증폭에 기반하여 샘플내 존재하는 초기 표적 서열의 양을 측정하기 위한 다양한 방법이 해당 분야에 잘 공지된다. 이들은 미국 특허 번호 제6,303,305호 및 제6,541,205호에서 개시된 방법을 포함하며, 이들 각각은 이들 전체로 참조로서 본 명세서에 편입된다. 초기에 샘플내 존재하는 표적 서열의 수량을 측정하기 위한, 하지만 실시간 증폭에 기반하지 않는 또 다른 방법은 미국 특허 번호 제5,710,029호에서 개시되며, 이의 전체는 참조로서 본 명세서에 편입된다.

증폭 산물은 다양한 자가-혼성화 프로브를 통해 실시간으로 탐지될 수 있으며, 이들 중 대부분은 머리핀(stem-loop) 구조를 갖는다. 이러한 자가-혼성화 프로브는, 프로브가 표적 서열에 대한 혼성화를 통해 자가-혼성화된 상태 또는 변경된 상태에 있는지에 따라, 그들이 탐지가능한 신호를 다르게 방출하도록 라벨링된다. 비-제한 예시로써, "분자 토치(molecular torch)"는 접합 영역 (가령, 비-뉴클레오티드 연결자)에 의해 연결되는 그리고 예정된 혼성화 어세이 조건 하에 서로에 혼성화하는 자가-상보성의 별개 영역 ("표적 결합 도메인" 및 "표적 폐쇄 도메인"으로 언급됨)을 포함하는 자가-혼성화 프로브의 유형이다. 바람직한 구체예에서, 분자 토치는 표적 결합 도메인에서, 길이가 1 내지 약 20개 염기이고 가닥 치환 조건 하에 증폭 반응내 존재하는 표적 서열에 혼성화를 위해 접근가능한 단일-가닥 기반 영역을 함유한다. 가닥 치환 조건 하에, 표적 서열의 존재에서 제외하고는, 분자 토치의 두 가지 상보적인 영역의 혼성화가 선호되며, 여기서 상기 상보적인 영역은 완전히 또는 부분적으로 상보적일 수 있고, 여기서 상기 표적 서열은 표적 결합 도메인에서 존재하는 단일 가닥 영역에 결합하고 표적 폐쇄 도메인의 전부 또는 일부를 치환할 것이다. 분자 토치의 표적 결합 도메인 및 표적 폐쇄 도메인은 분자 토치가 표적 서열에 혼성화될 때보다는 분자 토치가 자가-혼성화될 때 상이한 신호가 생산되도록 배치된 탐지가능한 라벨 또는 상호작용 라벨 쌍 (가령, 발광성 /소광제)을 포함하며, 그렇게 함으로써 비혼성화된 분자 토치의 존재에서 검사 샘플내 프로브:표적 이중복합체의 탐지를 허용한다. 분자 토치 및 다양한 유형의 상호작용 라벨 쌍은 미국 특허 번호 제6,534,274호에 개시되며, 이의 전체로 참조로서 본 명세서에 편입된다.

자가-상보성을 갖는 탐지 프로브의 또 다른 예시는 "분자 비콘(molecular beacon)"이다. 분자 비콘은 표적 상보적인 서열을 갖는 핵산 분자, 증폭 반응에서 존재하는 표적 서열의 부재시 닫힌 입체구조에서 프로브를 유지하는 친화도 쌍 (또는 핵산 팔(arm)), 및 프로브가 닫힌 입체구조 안에 있을 때 상호작용하는 라벨 쌍을 포함한다. 표적 서열 및 표적 상보성 서열의 혼성화는 친화도 쌍의 구성원을 분리하고, 그렇게 함으로써 프로브를 열린 입체구조로 변화시킨다. 열린 입체구조로의 변화는 예를 들어 형광단 및 소광제 (가령, DABCYL 및 EDANS)일 수 있는, 라벨 쌍의 감소된 상호작용에 기인하여 탐지가능하다. 분자 비콘은 미국 특허 번호 제5,925,517호 및 제6,150,097호에서 개시되며, 이는 이의 전체로 참조로서 본 명세서에 편입된다.

다른 자가-혼성화 프로브는 해당 분야의 통상의 기술자에게 잘 공지된다. 비-제한 예시로써, 미국 특허 번호 제5,928,862호 (이는 이의 전체로 참조로서 본 명세서에 편입됨)에서 개시된 것들과 같은 상호작용 라벨을 갖는 프로브 결합 쌍은 본 발명에서 이용하기 위해 개조될 수 있다. 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP)을 탐지하는 데에 이용된 프로브 시스템이 또한 본 발명에서 활용될 수 있다. 추가적인 탐지 시스템은 미국 공개공보 번호 제20050042638호에서 개시된 바와 같이, "분자 스위치(molecular switche)"를 포함하며, 상기 문헌은 이의 전체로 참조로서 본 명세서에 편입된다. 다른 프로브, 가령 삽입 염료 및/또는 형광색소를 포함한 것들도 또한 본 발명에서 증폭 산물의 탐지를 위해 유용하다. 가령, 미국 특허 번호 제5,814,447호 (이는 이의 전체로 참조로서 본 명세서에 편입됨)를 참고한다.

데이터 분석

몇몇 구체예에서, 컴퓨터-기반 분석 프로그램은 탐지 어세이에 의해 발생된 미가공 데이터 (가령, 표 1-6에 열거된 유전자로 구성된 군에서 선택된 유전자의 패널 발현의 존재, 부재, 또는 양)를 임상의 또는 연구원을 위한 예측 값의 데이터로 해석하는 데에 이용된다. 사용자는 임의의 적합한 평균을 이용하여 예측 데이터에 접근할 수 있다. 따라서, 몇몇 바람직한 구체예에서, 본 발명은 유전학 또는 분자 생물학을 교육받지 않았을 수도 있는 사용자가 미가공 데이터를 이해할 필요가 없다는 추가적인 혜택을 제공한다. 데이터는 이의 가장 유용한 형태로 사용자에게 직접 제시된다. 그러면 사용자는 대상의 관리를 최적화하기 위하여 (또는 사용자가 그 대상이라면 그들 스스로를 위해) 정보를 즉시 활용할 수 있다.

본 발명은 어세이를 수행하는 실험실, 정보 제공자, 의료인, 및 대상에게 그리고 상기 이들로부터 정보를 받고, 가공처리하고, 그리고 전송할 수 있는 임의의 방법을 고려한다. 예를 들어, 본 발명의 몇몇 구체예에서, 샘플 (가령, 생검 또는 혈액 및 혈청 샘플)은 대상으로부터 얻고 세계 어떤 곳에서든 위치한 (가령, 대상이 거주하는 또는 정보가 궁극적으로 이용되는 국가와는 다른 국가에서), 프로파일링 서비스 기관 (가령, 의료시설에 있는 임상 실험실, 게놈 프로파일링 사업체 등)에 제출되어 미가공 데이터를 발생시킨다. 샘플이 조직 또는 다른 생물학적 샘플을 포함하는 경우, 대상은 샘플을 얻어 프로파일링 센터로 보내기 위해 의료원을 방문할 수 있고, 또는 대상은 그들이 스스로 샘플 (가령, 소변 샘플)을 수집하여 직접 프로파일링 센터에 상기 샘플을 보낼 수 있다. 샘플이 이전에 결정된 생물학적 정보를 포함하는 경우, 정보는 대상에 의해 직접 프로파일링 서비스 기관으로 보내질 수 있다 (가령, 정보를 포함하는 정보 카드는 컴퓨터에 의해 스캐닝될 수 있고 데이터는 전자 통신 시스템을 사용하여 프로파일링 센터의 컴퓨터로 전송될 수 있다). 프로파일링 서비스 기관에 의해 일단 수신되면, 샘플은 가공되어 대상을 위해 바람직한 진단 또는 징후 정보에 특이적인, 프로파일이 생성된다 (즉, 발현 데이터).

이후 프로파일 데이터는 사용자에 의해 해석에 적합한 형식으로 제조된다. 예를 들어, 미가공 발현 데이터를 제공하는 것보다는, 특정한 치료 선택사항을 위한 추천에 따라, 제조된 형식이 대상에 대한 가능성 (가령, 검사된 조건이 CR을 모방할 가능성)을 나타낼 수 있다. 데이터는 임의의 적합한 방법에 의해 사용자에게 보여질 수 있다. 예를 들어, 몇몇 구체예에서, 프로파일링 서비스 기관은 사용자를 위해 인쇄될 수 있거나 (가령, 관리 시점에) 컴퓨터 화면 상에 사용자에게 보여질 수 있는 보고서를 만든다.

몇몇 구체예에서, 정보는 관리 시점에 또는 지역 시설에서 우선 분석된다. 이후 미가공 데이터는 추가 분석을 위해 및/또는 미가공 데이터를 임상의 또는 환자를 위해 유용한 정보로 전환시키기 위해 중앙 가공처리 시설로 보내진다. 중앙 가공처리 시설은 개인정보 (모든 데이터는 획일적인 보안 프로토콜로 중앙 시설에 저장됨), 속도, 그리고 데이터 분석의 일관성의 장점을 제공한다. 이후 중앙 가공처리 시설은 대상의 치료 후 데이터의 운명을 조절할 수 있다. 예를 들어, 전자 통신 시스템을 이용하여, 중앙 시설은 임상의, 대상, 또는 연구원에게 데이터를 제공할 수 있다.

몇몇 구체예에서, 대상은 전자 통신 시스템을 사용하여 데이터에 직접 접근할 수 있다. 대상은 결과에 기반하여 추가적인 개입 또는 상담을 선택할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 데이터는 연구 용도를 위해 이용된다. 예를 들어, 데이터는 질병의 특정 상태 또는 단계의 유용한 지표자로서 마커의 포함 또는 제거를 추가로 최적화하는 데에 이용될 수 있다.

몇몇 구체예에서, 본 명세서에 설명된 방법은 CR이 발현의 변화를 야기하는 유전자의 패널을 형성하는 데에 이용될 수 있다. 패널내 유전자는 대상 군에 걸쳐 변화의 규모, 변화의 동향 또는 징조, 통계적 유의성의 수준, 변화의 견고성(robustness)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 추가적 기준에 따라 선택될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같은 "대상 군"은 속(genus) 또는 종(species), 특히 유전 성분을 가진 것 내에서 임의의 식별가능한 그룹핑, 가령, 계통, 품종, 종족 군을 나타낸다. 한 측면에서, 유전자는 쥣과, 갯과, 고양잇과, 또는 인류를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 적합한 분류군에서 식별된다.

유전자의 패널에 대한 유전자 발현내 특정한 변화 패턴은 대상의 개인 또는 군에서 CR 효과의 프로파일로서 역할을 할 수 있다. 이 CR 발현 프로파일은 결과적으로 유전자 발현에서 CR의 효과를 모방하는 물질 및 기타 치료법을 식별하는 데에 이용될 수 있다. 따라서 이러한 물질은 CR의 다른 효과를 모방하는 것으로 예상될 수 있다. 따라서, CR-관련 유전자 패널 및 발현 프로파일은 이들 대상에게 CR의 효과를 주는 목적을 위하여 대상에게 투여를 위한 물질을 스크리닝하는 데에 이용될 수 있다.

본 기술의 한 측면에서, 유전자 패널은 개체로부터 결과의 해석이 대형 대상 군에 대해 추정될 수 있도록, 광범위한 유전적 다양성을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 특정 계통 생쥐내 성분을 스크리닝하는 것으로부터 얻은 발현 프로파일은 다수 계통의 생쥐에서 성분의 유사한 효과를 예측하는 데에 이용될 수 있다. 또 다른 예시에서, 특정 종족 군에 속하는 개체에서 식별된 유전자를 포함하는 유전자 패널은 종족 군에 걸쳐 효과적인 CR 모방에 대해 스크리닝하는 데에 이용될 수 있다.

구체예에서, 더 특정한 유전자 패널은 상기 설명된 전체 패널내 유전자 서브세트(subset)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 하나의 이러한 패널은 조직 또는 조직 유형에 더 특이적인 CR-반응 유전자를 포함할 수 있다. 또 다른 예시에서,　검사 조건 하에 더 풍부한 발현을　보여주거나,　물질　투입량에 더 또는 덜 민감한, 유전자의 서브세트가 이용될 수 있다. 이들 기준은 특이적인 패널을 위한 유전자가 특정한 목적에 기여하기 위하여 선택될 수 있는 포괄적인 요인은 아니다. 한 측면에서, 더욱 특이적인 패널은 전체 패널에 대하여 검사하기 위한 후보로서 물질을 식별하기 위해 초기 스크리닝 단계에서 활용될 수 있는 해석가능한 결과를 더 빠르게 및/또는 더 쉽게 제공할 수 있다.

본 기술에 따른 유전자 패널 및 방법은 제제를 위한 성분을 선택하는 것에서 이용될 수 있다. 구체예에서, 후보 화합물이 동물에게 투여될 때 CR의 효과를 모방하는 것에서 유용할 가능성이 있는지 결정하기 위한 방법은 후보 화합물로 동물을 처리하는 단계; CR 유전자 패널로부터 다수의 유전자의 발현을 측정하는 단계; 및 후보 화합물이 이들 유전자의 CR 발현 프로파일을 모방하는 지 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 특정한 예시에서, CR 프로파일 발현은 패널내 유전자의 발현 산물을 측정하기 위해 CR 처리된 동물의 조직을 분석함으로써 얻어질 수 있다. 물질-처리 동물내 이들 유전자의 발현은 물질이 CR을 모방하는지 그리고 어느 정도로 모방하는지 결정하기 위해 CR 발현 프로파일과 비교될 수 있다. 한 가지 구체예에서, 분석된 유전자는 CR-반응 유전자의 전체 패널에서 선택될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 분석된 유전자는 더 특이적인 패널에서 선택된다. 특정 예시에서, 다수의 물질로부터 생성된 샘플은 특이적인 검사 패널에서 유전자이 발현을 측점함으로써 초기에 스크리닝된다. 이후 물질은 각각의 물질이 CR을 모방하는 정도를 명시하는 치수(measurements) 또는 지수(indices)에 기반하여 순위가 매겨진다. 한 측면에서, 지수 및 순위는 기존의 통계 도구를 이용하여 발생될 수 있다. 또 다른 측면에서, 순위는 CR 프로파일, 검사 패널내 유전자수, 유의적으로 영향 받은 유전자수, 또는 이들의 임의 조합에 관하여 처리-유도 배수 변화를 포함하는 코딩 시스템을 사용하여 적어도 부분적으로 이루어질 수 있다. 이후 제제는 순위를 매긴 물질 중 하나 이상을 선택함으로써 만들어질 수 있다. 추가적인 확증 단계로서, 제제 또는 하나 이상의 물질은 전체 유전자 패널에 대하여 검사될 수 있다.

조성물

본 발명의 진단 방법에서의 용도를 위한 조성물은 프로브, 증폭 올리고뉴클레오티드, 및 항체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 특히 바람직한 조성물은 관심 대상으로부터 얻은 생물학적 샘플 (가령, 조직 샘플)로부터, 표 1-6에 나열된 하나 이상의 유전자의 발현 수준을 탐지하기 위해 유용하고, 필수적이고, 또는 충분하다.

이들 조성물 중 어느 하나는, 단독으로 또는 본 발명의 다른 조성물과 조합하여, 키트 형태로 제공될 수 있다. 예를 들어, 단일 라벨링 프로브 및 증폭 올리고뉴클레오티드 쌍은 표 1-6에 나열된 유전자로 구성된 군에서 선택된 유전자의 패널의 증폭 및 탐지 및/또는 정량화를 위한 키트로 제공될 수 있다. 키트는 시약 그 자체, 완충제, 대조 시약 (가령, 조직 샘플, 양성 및 음성 대조군 샘플 등), 고형 지지체, 라벨, 글로 표현된 및/또는 그림으로 나타낸 설명서 및 제품 정보, 저해제, 라벨링 및/또는 탐지 시약, 패키지 환경 조절 (가령, 얼음, 건조제) 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 어세이를 위해 필수적이거나 충분한 임의의 및 모든 성분을 포함할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 키트는 요구되는 성분의 서브세트를 제공하며, 여기서 사용자가 남아있는 성분을 공급할 것이라는 점이 예상된다. 몇몇 구체예에서, 키트는 2개 이상의 분리된 용기를 포함하며 여기서 각각의 용기는 전달되어야할 성분의 서브세트를 보관한다.

실시예

실시예 1 - CR 및 대조군 대상에서 차별적으로 발현되는 유전자의 식별

대조 규정식을 급식한 생쥐와 비교할 때 CR 생쥐에서 차별적으로 발현된 유전자를 식별하기 위해 본 발명의 구체예의 전개 동안에 실험이 수행되었다. 7개의 상이한 생쥐 계통 (129S1/SvImJ, C57BL/6J, BALB/cJ, C3H/HeJ, CBA/J, DBA/2J, 및 B6C3F1/J)은 2월령부터 5월령까지 칼로리 제한된 (CR) 규정식을 받았다. 생쥐에게 AIN93M 포뮬라(formula)에 기반한 대조 규정식 또는 유사한 영양 조성물을 가지지만 30-50% 칼로리 제한을 나타내는 규정식을 급식하였다. 음식 할당량은 각각의 계통의 대사에 맞추었다. 시험 기간에 걸쳐 각각의 계통의 체중에서 CR 규정식의 효과가 도 1에서 보여진다. 5월령 때 대조 및 CR 규정식의 생쥐로부터 조직을 수집하였다. CR 및 대조군 생쥐 사이에서 20,789개 유전자의 유전자 발현 수준을 비교하였다. 심장 조직에서, 70개 유전자가 CR에 반응하여 유전자 발현에서 매우 유의적인 변화를 보였고 (표 1를 참고; 7개 계통 중 4개에서 <0.01의 p-값 컷오프 그리고 C57BL/6J 계통내 발현에서 >=1.2-배 또는 <=-1.2 배수 변화 (FC)); 근육 조직에서, 94개 유전자가 CR에 반응하여 유전자 발현에서 매우 유의적인 변화를 보였고 (표 2를 참고; 7개 계통 중 5개에서 <0.01의 p-값 컷오프 그리고 C57BL/6J 계통내 발현에서 >=1.3-배 또는 <=-1.3 FC); 백색 지방 조직에서, 165개 유전자가 CR에 반응하여 유전자 발현에서 매우 유의적인 변화를 보였다 (표 3을 참고; 7개 계통 중 6개에서 <0.01의 p-값 컷오프 그리고 C57BL/6J 계통내 발현에서 >=1.5-배 또는 <=-1.5 FC).

심장 조직에서 RT-PCR 분석을 위해 이용될 수 있는 마커의 패널을 발생시키기 위하여, 표 1로부터 8개의 잠재적인 CR 마커를 RT-PCR로 어레이 데이터의 확인을 위해 선택하였다 (표 4). 마이크로어레이 실험에서 풍부한 발현, CR에 반응하여 유전자 발현에서 강력한 변화, 및/또는 CR 규정식에 의해 영향 받은 대사 경로와의 사전(previous) 연관성을 포함하는 (하지만 이에 제한되지 않는) 다수의 요인에 기반하여 유전자를 선택하였다. 어레이 연구에서 이용된 RNA 샘플보다는 대조군 및 CR C57BL/6J 생쥐의 분리된 코호트로부터 RNA 샘플을 이용하여, 정량적 RT-PCR 분석은 모든 유전자가 CR에 의해 유의적으로 변화되었다는 것을 나타내었다.

근육 조직에서 RT-PCR 분석을 위해 이용될 수 있는 마커의 패널을 발생시키기 위하여, 표 2로부터 10개의 잠재적인 CR 마커를 RT-PCR로 어레이 데이터의 확인을 위해 선택하였다 (표 5). 마이크로어레이 실험에서 풍부한 발현, CR에 반응하여 유전자 발현에서 강력한 변화, 및/또는 CR 규정식에 의해 영향 받은 대사 경로와의 사전 연관성을 포함하는 (하지만 이에 제한되지 않는) 다수의 요인에 기반하여 유전자를 선택하였다. 어레이 연구에서 이용된 RNA 샘플보다는 C57BL/6J 생쥐의 분리된 코호트로부터 RNA 샘플을 이용하여, 정량적 RT-PCR 분석은 모든 유전자가 CR에 의해 유의적으로 변화되었다는 것을 나타내었다.

백색 지방 조직에서 RT-PCR 분석을 위해 이용될 수 있는 마커의 패널을 발생시키기 위하여, 표 3으로부터 15개의 잠재적인 CR 마커를 RT-PCR로 어레이 데이터의 확인을 위해 선택하였다 (표 6). 마이크로어레이 실험에서 풍부한 발현, CR에 반응하여 유전자 발현에서 강력한 변화, 및/또는 CR 규정식에 의해 영향 받은 대사 경로와의 사전 연관성을 포함하는 (하지만 이에 제한되지 않는) 다수의 요인에 기반하여 유전자를 선택하였다. 어레이 연구에서 이용된 RNA 샘플보다는 C57BL/6J 생쥐의 분리된 코호트로부터 RNA 샘플을 이용하여, 정량적 RT-PCR 분석은 모든 유전자가 CR에 의해 유의적으로 변화되었다는 것을 나타내었다.

실시예 2 - 칼로리 제한의 모방을 위한 성분 검사

급식 연구:

Jackson Laboratories로부터 6주령인 C57BL/6J 생쥐를 구입하였고 Barger JL, et al. (2008) A Low Dose of Dietary Resveratrol Partially Mimics Caloric Restriction and Retards Aging Parameters in Mice. PLoS ONE 3(6): e2264 (http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0002264)에서 이전에 설명된 바와 같이 상기 생쥐를 유지시켰다. 간단히, 생쥐를 신발상자 우리에 수용하고 주(we다 당 24 그램 (~84 kcal)의 AIN-93M 규정식을 제공하였다 (월요일 및 수요일에 7 그램 그리고 금요일에 10그램). 8주령에 시작해서 22주령까지 지속하여, 생쥐는 a) AIN-93M 규정식으로 유지되거나 (대조군), b) 8-16주령부터 63 kcal/주의 변형된 AIN93M을 제공하는 칼로리 제한 (CR) 규정식이 공급되고 이후 16-22주령부터 49 kcal/주의 변형된 AIN93M을 제공하는 규정식으로 추가 감소되거나; 또는 c) 다음 검사 성분 중 하나로 보충된 AIN93M 규정식이 할당되었다: 1) 5,000 mg/kg 규정식 용량의 베자피브레이트; 2) 1,909 mg/kg 규정식 용량의 메트포르민; 3) 1,800 mg/kg 규정식 용량의 L-카르니틴; 4) 18 mg/체중 kg 용량의 블러드 오렌지 추출물; 5) 22 mg/체중 kg 용량의 보라색 옥수수 추출물; 6) 30 mg/체중 kg 용량의 레스베라트롤; 및 7) 17.6 mg/체중 kg 용량의 퀘르세틴. 22주령에서, 생쥐로부터 조직을 수집하고, 액체 질소에서 급속-냉동시키고 그리고 추후 분석을 위해 -80℃에서 저장하였다.

CR을 모방하는 능력에 대해 성분을 스크리닝하기 위하여, 모든 군의 생쥐의 백색 지방 조직으로부터 단리된 RNA 상에서 정량적 실시간 PCR (RT-qPCR) 분석을 수행하였다. RT-qPCR 실험을 위한 실험 방법 및 데이터 분석은 이전에 Barger, JL et al., (2008) Short-term consumption of a resveratrol-containing nutraceutical mixture mimics gene expression of long-term caloric restriction in mouse heart, Exp. Gerontology 43(9):859 (http://dx.doi.org/10.1016/j.exger.2008.06.013)에서 발행되었다. 간단히, 대조군 동물과 비교하여 CR 및 처리군에 대해 표 6에 나열된 각각의 유전자에 대하여 유전자 발현에서의 변화 규모를 결정하였다. 개별적인 유전자에 대해 발현에서의 변화가 통계적으로 유의한지 결정하는 데에 양방적(two-tailed) t-검사 (등분산을 가정함)를 이용하였다. 발현 ("배수 변화") 값에서 변화의 규모는 통계적 분석을 위한 정상상태 가정을 정합하기 위해 log₂-조정되었다.

결과

CR 모방은 CR 군내 유전자에 대해 관찰된 배수 변화의 퍼센트로서 검사 군에 대한 유전자 각각에서 관찰된 배수 변화로 표현되었다. 표 7은 유전자 각각에 대한 성분 각각에 의해 성취된 CR 모방을 보여주며 상기 모방은 그 성분에 의해 유의적으로 변화되었다.

CR 모방 성분 순위 매기기

검사된 성분은 유전자 패널에 걸쳐 그들의 모방 효과에 기반하였다. 성분 각각에 대해 유의적으로 변화된 유전자 모두에 대한 모방 값의 평균을 내었다.

한 가지 순위 매기기 기법에서, 평균 모방 (CR의 일부로서)을 유의적으로 변화된 유전자의 수로 곱하여 모방 지수 (CMII)를 얻었다. 표 8에서 보여지는 바와 같이, 베자피브레이트는 CR 모방에서 가장 효과적이었고, 반면에 퀘르세틴은 가장 낮은 정도의 CR 모방을 보여주었다.

또 다른 순위 매기기 기법은 모든 유전자에 걸쳐 효과를 반영하는 데에 이용되었다. 유전자 각각에 대한 이의 모방 점수에 기반하여 각각에 다수의 포인트를 부여함으로써 성분 각각에 대하여 유전자 당　CR　모방 지수　(CRMI)를 계산하였다. 양성 모방 값에 대해 양성 포인트가 주어졌다 (11 내지 20% = 1 포인트, 21 내지 30% = 2 포인트, 31 내지 40% = 3 포인트 등). 음성 점수에 상응하여 음성 모방 값 (즉 여기서 유전자 발현 효과는 CR에 대해 관찰된 것과 반대였음)을 얻었다 (즉 -11 내지 -20% = -1 포인트, -21 내지 -30% = -2 포인트, -31 내지 -40% = 3 포인트 등). 모방 값의 통계적 유의성을 위해 5 포인트를 추가하였다. 성분 각각에 대한 평균 CRMI는 표 8에서 보여진다.

실시예 3

베자피브레이트에 의한 CR 모방에서 용량의 효과 검사

실시예 2의 실험 프로토콜에서, 5,000 mg/kg 규정식의 베자피브레이트를 더 낮은 용량 (100 및 500 mg/kg)과 또한 비교하였다. 표 9는 그 투입량에 의해 유의적으로 변화되었던 유전자 각각에 대한 투입량 각각으로 성취된 CR 모방의 정도를 보여준다.

실시예 2에서와 같이 500 mg/kg 및 100 mg/kg 용량에 대해 모방 지수를 계산하였다. 표 10에서 보여진 바와 같이, 베자피브레이트가 CR을 모방하였던 정도는 용량-의존적이었다.

전술한 실시예가 하나 이상의 특정한 적용에서 본 발명의 원리의 예시이지만, 실행의 형태, 용도 및 세부사항에서의 수많은 형태가 발명 능력의 행사 없이, 그리고 본 발명의 원리 및 개념으로부터 벗어남 없이 이루어질 수 있다는 점이 해당 분야의 통상의 기술자에게 명확할 것이다. 이에 따라, 하기 제시된 청구범위에 의한 것을 제외하고는, 본 발명이 제한되는 것은 의도되지 않는다.

Claims

CR에 반응하여 조직에서 차별적으로 발현되는 다수의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자 패널(gene panel)에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 표 1 내지 6에 열거된 유전자에서 선택되는 것을 특징으로 하는 유전자 패널.
제1항에 있어서, 조직은 쥣과(murine) 대상으로부터 유래한 것임을 특징으로 하는 유전자 패널.
제1항에 있어서, 조직은 갯과(canine) 대상 또는 고양잇과(feline) 대상으로부터 유래한 것임을 특징으로 하는 유전자 패널.
제1항에 있어서 조직은 인간 대상으로부터 유래한 것임을 특징으로 하는 유전자 패널.
제1항에 있어서, 조직은 간 조직, 심장 조직, 폐 조직, 뇌 조직, 상피 조직, 결합 조직, 백색 지방, 골격근, 혈액, 신경 조직, 소변, 및 침으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 유전자 패널.
제5항에 있어서, 조직은 심장 조직이고 폴리뉴클레오티드는 표 1에 열거된 유전자에서 선택되는 것을 특징으로 하는 유전자 패널.
제6항에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 표 4에 열거된 유전자에서 선택되는 것을 특징으로 하는 유전자 패널.
제5항에 있어서, 조직은 골격근이고 폴리뉴클레오티드는 표 2에서 선택되는 것을 특징으로 하는 유전자 패널.
제8항에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 표 5에 열거된 유전자에서 선택되는 것을 특징으로 하는 유전자 패널.
제5항에 있어서, 조직은 백색 지방이고 폴리뉴클레오티드는 표 3에서 선택되는 것을 특징으로 하는 유전자 패널.
제10항에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 표 6에 열거된 유전자에서 선택되는 것을 특징으로 하는 유전자 패널.
조직내 CR의 보편적인 마커의 차별적인 발현을 탐지하기 위한 프로브(probe)에 있어서, 다음 중 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 프로브:
a) 표 1 내지 3에 열거된 유전자를 특이적으로 혼성화하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 단편; 또는
b) 표 1 내지 6에 열거된 유전자에 의해 인코딩된 폴리펩티드에 결합하는 폴리펩티드 결합제.
제12항에 있어서, 조직은 심장 조직이고 프로브는 표 1에 열거된 유전자에서 선택된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 프로브.
제13항에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 표 4에 열거된 유전자에서 선택되는 것을 특징으로 하는 프로브.
제12항에 있어서, 조직은 골격근이고 프로브는 표 2에서 선택된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 프로브.
제15항에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 표 5에 열거된 유전자에서 선택되는 것을 특징으로 하는 프로브.
제12항에 있어서, 조직은 백색 지방이고 프로브는 표 3 에서 선택된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 프로브.
제17항에 있어서 폴리뉴클레오티드는 표 6에 열거된 유전자에서 선택되는 것을 특징으로 하는 프로브.
조직내 차별적인 유전자 발현을 탐지하기 위한 조성물에 있어서, 상기 조성물은 2개 이상의 프로브를 포함하며, 여기서 프로브는 다음을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물:
a) 표 1 내지 6에 열거된 2개 이상의 유전자에 특이적으로 혼성화하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 단편; 또는
b) 표 1 내지 6에 열거된 2개 이상의 유전자에 의해 인코딩된 폴리펩티드에 결합하는 폴리펩티드 결합제.
제19항에 있어서, 조직은 심장 조직이고 프로브는 표 1에 열거된 유전자에서 선택된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제20항에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 표 4에 열거된 유전자에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제19항에 있어서, 조직은 골격근이고 프로브는 표 2에서 선택된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제22항에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 표 5에 열거된 유전자에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제19항에 있어서, 조직은 백식 지방이고 프로브는 표 3에서 선택된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제24항에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 표 6에 열거된 유전자에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제19항에 있어서, 프로브는 PCR에 적합한 올리고뉴클레오티드 프라이머인 것을 특징으로 하는 조성물.
제19항에 있어서, 프로브는 항체인 것을 특징으로 하는 조성물.
다음을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트:
a) 표 1 내지 6에 열거된 유전자를 특이적으로 혼성화하는 증폭 올리고뉴클레오티드 또는 이의 단편; 및
b) 표 1 내지 6에 열거된 단백질을 인코딩하는 유전자를 특이적으로 혼성화하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 단편을 포함한 라벨링된(labeled) 프로브.
제28항에 있어서, 프로브는 기질(substrate)에 결합되는 것을 특징으로 하는 키트.
제28항에 있어서, 다음으로 구성된 군에서 선택된 적어도 하나의 성분을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트: 완충제, 대조 시약, 고형 지지체, 라벨, 설명서, 저해제, 라벨링 시약, 탐지 시약, 및 건조제.
선택된 조직내 칼로리 제한 (CR)의 조직-특이적 보편적인 마커를 식별하는 방법에 있어서, 다음을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법: a) 다수의 대상 군에 속하는 대상을 CR 조건에 노출시키는 단계; 및 b) 다양한 상기 다수의 대상 군으로부터 대상내 CR에 반응하여 차별적으로 발현되는 하나 이상의 유전자를 선택하는 단계.
제31항에 있어서, 선택된 유전자는 2개 이상의 대상 군에서 차별적으로 발현되는 것을 특징으로 하는 방법.
제31항에 있어서, 선택된 유전자는 3개 이상의 대상 군에서 차별적으로 발현되는 것을 특징으로 하는 방법.
제31항에 있어서, 선택된 유전자는 50% 이상의 검사된 대상 군에서 차별적으로 발현되는 것을 특징으로 하는 방법.
제31항에 있어서, 조직은 간조직, 심장 조직, 폐 조직, 뇌 조직, 상피 조직, 결합 조직, 백색 지방, 골격근, 혈액, 신경 조직, 소변 및 침으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제35항에 있어서, 조직은 심장 조직인 것을 특징으로 하는 방법.
제35항에 있어서, 조직은 골격근인 것을 특징으로 하는 방법.
제35항에 있어서, 조직은 백색 지방인 것을 특징으로 하는 방법.
제35항에 있어서, 유의성 수준은 p<0.01인 것을 특징으로 하는 방법.
제31항에 있어서, 대상 군은 쥣과인 것을 특징으로 하는 방법.
제31항에 있어서, 대상 군은 갯과 또는 고양잇과인 것을 특징으로 하는 방법.
제31항에 있어서, 대상 군은 인간인 것을 특징으로 하는 방법.
후보 화합물이 대상에게 투여될 때 CR의 효과를 모방하는 데에 효과적일 것인지 결정하기 위한 방법에 있어서, 방법은 다음을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
a) 일차 대상을 CR에 노출시키는 단계;
b) 일차 대상으로부터의 조직 샘플내 표 1 내지 3에 열거된 2개 이상의 유전자의 발현 산물의 수준을 측정하여 CR 발현 프로파일을 얻는 단계;
c) 이차 대상에 후보 화합물을 투여하는 단계;
d) 이차 대상으로부터의 조직 샘플내 발현 산물의 수준을 측정하는 단계; 및
e) b) 및 d)에서의 수준을 비교하여 후보 화합물이 CR을 모방하는 정도를 결정하는 단계.
제43항에 있어서, 조직은 간 조직, 심장 조직, 폐 조직, 뇌 조직, 상피 조직, 결합 조직, 백색 지방, 골격근, 혈액, 신경 조직, 소변, 및 침으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제44항에 있어서, 조직은 심장 조직인 것을 특징으로 하는 방법.
제44항에 있어서, 조직은 골격은인 것을 특징으로 하는 방법.
제44항에 있어서, 조직은 백색 지방인 것을 특징으로 하는 방법.
제44항에 있어서, 상기 측정하는 단계는 제12항 또는 제19항에서와 같은 조성물을 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제48항에 있어서, 프로브는 기질에 결합되는 것을 특징으로 하는 방법.
제48항에 있어서, 프로브는 어레이(array)에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제48항에 있어서, 프로브는 PCR에 적합한 올리고뉴클레오티드 프라이머인 것을 특징으로 하는 방법.
제48항에 있어서, 프로브는 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
제43항에 있어서, 상기 생플내 상기 발현 산물의 측정 단계는 마이크로어레이(microarray) 분석, 역전사효소 PCR, 정량적 역전사효소 PCR, 및 혼성화 분석으로 구성된 군에서 선택된 탐지 기술을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제43항에 있어서, 후보 화합물이 CR을 모방하는 정도에 기반하여 다수의 후보 화합물의 순위를 매기는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.