CN103724411B

CN103724411B - 一种抗昆虫毒素及其编码序列以及重组毒素的制备与应用

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Publication number: CN103724411B
Application number: CN201310443624.6A
Authority: CN
Inventors: 华卫建
Original assignee: JIANGSU INSTITUTE OF EDUCATION
Current assignee: JIANGSU INSTITUTE OF EDUCATION
Priority date: 2013-06-21
Filing date: 2013-09-26
Publication date: 2014-12-10
Anticipated expiration: 2033-09-26
Also published as: CN103724411A

Abstract

本发明涉及一种抗昆虫毒素及其编码序列以及重组毒素的制备与应用。本发明通过构建cDNA文库，从中国江苏少棘蜈蚣毒腺中克隆得到蜈蚣抗昆虫毒素基因。并通过将密码子优化后全合成的重组蜈蚣抗昆虫毒素基因Scolotoxin-Ssm2.2与载体pSUMO-Mutant连接得到重组表达载体pSUMO-M-Scolotoxin-Ssm2.2，将该重组表达载体转化大肠杆菌BL21（DE3)，筛选得到高效表达菌株。表达产物经亲和层析，得到具有生物学活性的多肽——rScolotoxin-Ssm2b。本发明提供的多肽rScolotoxin-Ssm2b具有昆虫神经毒性和昆虫致死作用，可用于制备神经生物学研究的工具试剂和生物杀虫剂，也可用于蜈蚣神经毒素空间结构及药理学活性等研究。

Description

一种抗昆虫毒素及其编码序列以及重组毒素的制备与应用

技术领域

本发明涉及一种抗昆虫毒素及其编码序列以及重组毒素的制备与应用，更为具体的说是涉及一种中国江苏少棘蜈蚣抗昆虫毒素基因Scolotoxin-Ssm2.2及其编码的多肽Scolotoxin-Ssm2b和该多肽的重组制备技术，以及该毒素在神经生物学研究和杀虫药物开发中的应用。

背景技术

蜈蚣（centipede）是节肢动物门Arthropoda唇足纲Chilopoda动物的总称，全世界约有3300种（Edgecombe, G.D., Giribet, G., Ann. Rev. Entomol. 2007. 52, 151-170.）。蜈蚣科Scolopendridae蜈蚣（以下所称蜈蚣皆指此类）为其中最凶猛的捕食者，主要以昆虫和小型无脊椎动物为食，大型蜈蚣也能捕食蟾蜍、蛇、以至蝙蝠和大鼠等脊椎动物。蜈蚣通过向猎物注入毒液，直接杀死或麻痹猎物而捕食之。与蜘蛛、蝎等捕食性节肢动物一样，在长期的进化过程中，蜈蚣毒液系统发展出了一系列结构独特、性能高效且特异的毒素。然而，与对蜘蛛和蝎各近百种抗昆虫毒素的深入研究相比，人们对蜈蚣抗昆虫毒素的研究相当薄弱(E.F.Schwartz等，Pept Sci. 2012. 98(4):385–405.)，迄今仅见一例蜈蚣抗昆虫毒素基因的重组表达(中国专利 CN 103088030A)。

最新的研究揭示，蜈蚣毒液中不仅含有高丰度的新型高分子量毒液蛋白/酶类，也含有分子骨架显著不同于已知毒素的多肽类毒素（E.A.B.Undheim等，Toxicon. 57 (2011) 512–524），包括多种离子通道毒素（Yang等，Mol Cell Proteomics. 2012;11(9):640-50.；Liu等，J Proteome Res. 2012;11(12):6197-212.），因而被学界视作“新型生物活性分子的丰富来源”。从蜈蚣毒腺中分离获得新的高效、特异的昆虫神经毒素基因及其多肽，进而重组表达或通过转基因技术进入相应的受体，在开发新的神经生物学研究试剂和农业与环境害虫的生物防治中，具有广阔的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种全新的一种抗昆虫毒素及其编码序列以及重组毒素的制备与应用

，并进一步得到可以应用于神经毒性类制剂，特别是杀虫剂的多肽产物重组蜈蚣抗昆虫毒素rScolotoxin-Ssm2b。在这一过程中，我们还同时得到了一种重组表达载体pSUMO-M-Scolotoxin-Ssm2.2。

本发明通过构建cDNA文库和测序的方法，从中国江苏少棘蜈蚣毒腺中分离获得了新的蜈蚣抗昆虫毒素基因Scolotoxin-Ssm2.2及其编码的抗昆虫毒肽Scolotoxin-Ssm2.2b。通过密码子优化合成了重组蜈蚣抗昆虫毒素基因rScolotoxin-Ssm2.2，在大肠杆菌中表达、纯化得到重组蜈蚣抗昆虫毒素rScolotoxin-Ssm2b。进而检测验证了该重组蜈蚣抗昆虫毒素的昆虫神经毒性及其在制备神经毒性类制剂与杀虫剂中的应用可能，从而达到了本发明的发明目的。

本发明所选择的蜈蚣属于少棘蜈蚣(S. subspinipes mutilans)，采自江苏省南京市。

本发明包括以下技术方案：

一种蜈蚣抗昆虫毒素多肽，具有SEQ ID NO1的氨基酸序列的多肽、或者其保守性变异多肽、或其活性衍生物。

该抗昆虫毒素多肽选自以下组之一：

（a）由SEQ ID NO1所示的氨基酸序列组成的多肽；

（b）将（a）中的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失、添加或修饰而形成的具有相同功能的由（a）衍生的多肽。

一种多核苷酸，该多核苷酸包含有选自以下组之一的核苷酸序列：

（a）编码2中的多肽的多核苷酸；也就是说编码SEQ ID NO1中的氨基酸序列的核苷酸序列，以及编码与SEQ ID NO1所示的氨基酸序列具有相同功能的由SEQ ID NO1衍生的多肽；

（b）与多核苷酸（a）互补的多核苷酸。

所述多核苷酸具有如SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。

一种重组蜈蚣抗昆虫毒素基因rScolotoxin-Ssm2.2，具有如SEQ ID NO3所示的核苷酸序列。

一种重组蜈蚣抗昆虫毒素基因 rScolotoxin-Ssm2.2的表达纯化方法，包括如下步骤：

A，构建含有重组蜈蚣抗昆虫毒素基因 rScolotoxin-Ssm2.2或含有重组蜈蚣抗昆虫毒素基因rScolotoxin-Ssm2.2突变体基因的重组质粒pSUMO-M-Scolotoxin-Ssm2.2;

B，将重组质粒pSUMO-M-Scolotoxin-Ssm2.2转化至宿主细胞中，得到含有重组质粒的工程菌株；

C，上述工程菌株经IPTG诱导，获得含有重组蜈蚣抗昆虫毒素的菌体；

D，将上述菌体清洗、离心、超声破碎，收集上清液；

D，将上清液反复通过Ni²⁺-IDA亲和层析柱纯化，得到融合蛋白；

E，上述融合蛋白经过SUMO蛋白酶酶切，得到重组蜈蚣抗昆虫毒素多肽rScolotoxin- Ssm2b。

本发明还特别公开了重组表达载体pSUMO-M-Scolotoxin-Ssm2.2的具体合成方法：

首先，按照大肠杆菌的密码子偏好将蜈蚣毒素基因Scolotoxin-Ssm2.2的cDNA序列优化，在该基因的5’端和3’端分别加入限制性内切酶Stu I和Xho I的酶切位点，采用化学合成法合成了全长的Scolotoxin-Ssm2.2成熟肽结构基因，经DNA测序证实合成的基因与设计的完全一致。

其次，通过限制性内切酶Stu I和Xho I双酶切法对载体pSUMO-Mutant进行酶切后得到线性化的载体pSUMO-Mutant。

最后，利用DNA连接酶连接上述优化改造过的蜈蚣抗昆虫毒素基因Scolotoxin-Ssm2.2和线性化的载体pSUMO-Mutant，得到重组表达载体pSUMO-M-Scolotoxin-Ssm2.2。

本发明同时还公开了上述步骤C的具体步骤为：将含重组质粒的工程菌株接种到LB培养液中，当工程菌培养液浓度OD₆₀₀达到0.6~1.0时，加入IPTG至终浓度0.5mol/L，于18℃表达6小时，获得含有重组蜈蚣抗昆虫毒素的菌体。

本发明进一步公开了步骤B中所述的宿主细胞是大肠杆菌BL21(DE3)。

采用这一宿主细胞后，本发明所公开的多肽的表达方法可以描述为：

(1) 将重组表达质粒pSUMO-M-Scolotoxin-Ssm2.2转化大肠杆菌BL21(DE3) ；

(2) 培养转化后的大肠杆菌BL21(DE3) ；

(3) 对培养后的大肠杆菌BL21(DE3) 进行超声裂解，收集上清；上清液经Ni²⁺-IDA亲和层析柱层析纯化，得到重组融合蛋白；

(4) 重组融合蛋白经SUMO蛋白酶酶切，得到目的多肽rScolotoxin-Ssm2b与标签SUMO蛋白的混合物；

(5) 目的多肽rScolotoxin-Ssm2b与标签SUMO蛋白的混合物再次经Ni²⁺-IDA亲和柱层析纯化，得到重组毒肽rScolotoxin-Ssm2b。

上述多肽的表达方法使用重组表达载体pSUMO-M-Scolotoxin-Ssm2.2作为表达质粒，表达效率较高，且优化了培养条件和纯化分离方式，有效提高了多肽rScolotoxin-Ssm2b的表达量。

本发明通过鳞翅目、直翅目和蜚蠊目昆虫注射实验发现，一定浓度的多肽rScolotoxin- Ssm2b具有明显的昆虫神经毒性和杀虫效果。因此，多肽rScolotoxin-Ssm2b可应用于制备神经生物学研究的工具试剂和生物杀虫剂。

具体说：重组蜈蚣抗昆虫毒素rScolotoxin-Ssm2b在制备神经毒性类制剂中的应用；特别是重组蜈蚣抗昆虫毒素rScolotoxin-Ssm2b在制备杀虫剂中的应用。

进一步地，本发明限定了所述重组蜈蚣抗昆虫毒素rScolotoxin-Ssm2b中优选含有两对正确连接的共价二硫键。

在本发明中，“重组蜈蚣抗昆虫毒素rScolotoxin-Ssm2b”与“重组蜈蚣抗昆虫毒素”或者“重组蜈蚣抗昆虫多肽”可以互相替换使用。

在本发明中，所用的多肽片段、衍生物或者是类似物等属于是指基本保持本发明重组蜈蚣抗昆虫毒素生物学功能或者活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是（1）有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基( 优选保守性氨基酸残基) 被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或（2）在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或（3）成熟多肽与另一个化合物融合所形成的多肽，或（4）附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽（如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列）。根据本文所述，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

本发明多核苷酸可以是DNA形式或者是RNA形式。

“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括你附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明所公开的抗昆虫毒素是一个全新的多肽，同时其在杀虫剂以及神经毒性制剂中的用途具有极大的应用前景，可以用于制备神经生物学研究的工具试剂或生物杀虫剂，也可用于蜈蚣神经毒素空间结构及药理学活性等研究。

附图说明

图1 少棘蜈蚣抗昆虫毒素基因Scolotoxin-Ssm2.2的DNA序列测定图谱。

图2 重组蜈蚣抗昆虫毒素合成基因Scolotoxin-Ssm2.2与天然Scolotoxin-Ssm2.2基因及其编码的氨基酸序列比对图；其中

第一行为少棘蜈蚣天然毒素基因Scolotoxin-Ssm2.2的DNA序列，为了方便标示，仅给出与人工设计序列不同的碱基，其余未标出部分与第二行中的碱基相同；第二行为重组蜈蚣抗昆虫毒素合成基因rScolotoxin-Ssm2.2的DNA序列；第三行为对应的重组蜈蚣抗昆虫毒素rScolotoxin-Ssm2b的多肽序列。

图3 重组蜈蚣抗昆虫毒素合成基因rScolotoxin-Ssm2.2的DNA序列测定图谱。

图4 表达载体pSUMO-Mutant的物理图谱和多克隆位点示意图。

图5 重组表达载体pSUMO-M-Scolotoxin-Ssm2.2的构建流程。

图6 重组表达载体pSUMO-M-Scolotoxin-Ssm2.2的质粒DNA琼脂糖凝胶电泳图。

图中M: 分子量标记；1: 重组质粒XhoI/XbaI酶切结果。

图7 经过IPTG诱导的工程菌表达融合蛋白的SDS-PAGE分析图谱

图中M：分子量标记；1：未诱导菌总蛋白；2、3：诱导菌总蛋白；4：诱导菌超声沉淀；5：诱导菌超声上清。

图8 重组融合蛋白与目标多肽rScolotoxin-Ssm2b分离的SDS-PAGE分析图谱

图中M：分子量标记；1：超声上清；2：镍柱纯化上样流出液；3：镍柱纯化洗脱液；4：酶切混合液；5：酶切液再过柱的流出液（目标肽）；6：酶切液再过柱的洗脱液（标签蛋白）。

具体实施方式

以下结合具体实施例，进一步说明本发明的技术方案。应理解，以下实施例只用于说明本发明而不以任何形式限制本发明。

实施例1 ：蜈蚣毒腺总RNA的提取与毒素cDNA克隆及序列测定

活体解剖分离蜈蚣毒腺并立即投入液氮中。于液氮中磨碎毒腺后，用Trizol Reagent (Invitrogen)试剂盒提取总RNA，按SMART^TM cDNA Library Construction Kit 说明书操作进行cDNA第一链合成，LD- PCR扩增合成第二链，蛋白酶K消化、SfiI酶切和柱回收cDNA，与载体λTriplEx2连接、包装。带有插入片断的载体通过电转化导入E.coli DH10B感受态细胞，SOC培养基37℃ lh100rpm恢复，涂于带有诱导剂IPTG和X-Gal显色剂的琼脂培养基上培养过夜。挑取白斑，PCR快速鉴定插入片断大小。检验合格的cDNA文库大规模培养，标准碱裂解法提取模板，ABI 3730测序仪测序，获得中国江苏少棘蜈蚣毒素基因Scolotoxin-Ssm2.2cDNA序列，测序结果参见附图1。

实施例组2

实施例2-1 重组表达载体pSUMO-M-Scolotoxin-Ssm2.2的构建

（1）Scolotoxin-Ssm2.2基因的优化与合成

按照大肠杆菌的密码子偏好将蜈蚣毒素基因Scolotoxin-Ssm2.2的cDNA序列优化，并在该基因的5’端和3’端分别加上限制性内切酶Stu I和Xho I的酶切位点，合成出全长的Scolotoxin-Ssm2.2成熟肽结构基因，其核苷酸序列与天然毒素的核苷酸序列比对参见附图2。

（2）重组表达载体pSUMO-M-Scolotoxin-Ssm2.2的构建：

将合成的Scolotoxin-Ssm2.2DNA经限制酶Stu I、XhoI双酶切后连接到表达载体pSUMO- Mutant中，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，测序。结果正确，说明克隆成功，得到重组表达载体pSUMO-M-Scolotoxin-Ssm2.2，重组基因序列参见附图3。

实施例2-2 重组蜈蚣抗昆虫毒素rScolotoxin-Ssm2b的高效原核表达

（1）重组蜈蚣抗昆虫毒素融合蛋白的表达

制备大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，将测序正确的重组表达载体pSUMO-M- Scolotoxin-Ssm2.2 利用热休克法（42℃热激45秒）转化至大肠杆菌BL21 (DE3)中，得到含有重组质粒的工程菌株，其构建基础及构建流程参考图4与图5，构建结果检测参见图6。

挑取工程菌株单菌落接种于Kan + LB液体丰富培养基中，37℃振荡培养过夜。次日取该过夜菌按1∶100 体积比接种于新鲜的Kan+LB丰富培养基中，37℃剧烈振荡放大培养至OD₆₀₀约为0.6，加入IPTG 至终浓度为0.5mmol/L，于18℃诱导表达6h。诱导结束后，4℃、10,000rpm离心10min，收菌。

所得菌体用预冷的PBS缓冲液(pH7.4) 洗涤菌体一次，离心，再用预冷的Lysis Buffer (50mmol/L NaH₂PO4，300mmol/LNaCl，10mmol/L咪唑，pH 8.0) 以1∶10的比例重悬。以200W功率在冰浴中超声20 min破碎细菌细胞。超声结束后，用4℃、12，000g离心20 min，收集含重组融合蛋白的上清。含空载质粒pSUMO-M的对照菌株BL21(DE3) 同样处理，收集含标签蛋白的上清。SDS-PAGE电泳检测到该基因的表达产物占全菌蛋白的27.66%，电泳结果见附图7。

（2) 重组蜈蚣抗昆虫毒素rScolotoxin-Ssm2b的制备

(2.1) 重组蜈蚣抗昆虫毒素融合蛋白的亲和层析

采用Biologic LP 层析系统将上清液以0.5 ml/min 流速上样至Ni²⁺-IDA Binding Buffer (20 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 5 mM imidazole, 6 M guanidine-HCl, pH8.0)预平衡的Ni²⁺-IDA Sepharose CL-6B亲和层析柱(0.8 cm×2 cm)；用Ni²⁺-IDA Binding Buffer以0.5 ml/min 流速冲洗，至流出液OD₂₈₀值到达基线，收样留以电泳，参看附图8中的第一泳道；用Ni²⁺-IDA Washing Buffer(20 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 20 mM imidazole, pH8.0)以0.5 ml/min 流速冲洗，至流出液OD₂₈₀值到达基线，收样留以电泳，参看附图8中的第二泳道；用Ni²⁺-IDA Elution Buffer(20 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 250 mM imidazole, pH8.0)以0.5 ml/min 流速冲洗，至流出液OD₂₈₀值到达基线，收样。通过上述亲和层析步骤对上述重组融合蛋白作进一步纯化，收集，多次纯化后产品参看附图8中的第三泳道。对照样品同样处理获得纯化后的标签蛋白——SUMO蛋白。

(2.2) 重组蜈蚣抗昆虫毒素rScolotoxin-Ssm2b的制备

取上述收集的重组融合蛋白按20：1（V/V）比例加入SUMO蛋白酶，30℃切割半小时，混合液参看附图8中第四泳道，获得目标多肽——重组蜈蚣抗昆虫毒素rScolotoxin- Ssm2b多肽（附图8中的第五泳道）及SUMO标签蛋白的混合物（见附图8中的第六泳道）。对照样品同样处理，仅含标签SUMO蛋白。

实施例3 重组蜈蚣抗昆虫毒素rScolotoxin-Ssm2b对鳞翅目模式昆虫家蚕的毒性鉴定

基本方案：体腔注射法。本实施例中通过对鳞翅目模式昆虫家蚕幼虫的体腔注射实验鉴定由蜈蚣抗昆虫毒素基因Scolotoxin-Ssm2.2编码的多肽rScolotoxin-Ssm2b的昆虫神经毒性。

实验步骤：实验对象为鳞翅目模式昆虫家蚕多化性品种大造（由中国农业科学院蚕业研究所张国政研究员提供）的五龄幼虫,每组30头,重复3次。待测药品为过滤除菌的rScolotoxin-Ssm2b多肽与SUMO标签蛋白的混合物，其中的多肽rScolotoxin-Ssm2b的工作浓度为10 ug/ml，对照试剂为同样处理的SUMO标签蛋白。从蚕体第8和第9腹节右侧的节间膜处注入试药10μl后，观察并记载虫体的活动状况，统计死亡数量，计算死亡率。

结果分析：注入毒液后10秒内, 蚕体即剧烈扭转、痉挛，迅速吐液，持续数分钟后，家蚕头胸伸出、躯体收缩、肛门拖粪、腹足失去抓握力而侧翻倒地、软瘫至死。其中的多数个体于2小时内中毒死亡；24小时3个给药组的死亡率皆达100%（表1）。而注射SUMO标签蛋白的对照组家蚕仅在注射后数分钟内静伏，1小时后全部恢复正常爬动，无任何中毒症状；24小时内也无一死亡。由此可得，多肽rScolotoxin-Ssm2b对鳞翅目模式昆虫家蚕具有显著的神经毒性及致死作用，可用于制备神经生物学研究的工具试剂及生物杀虫剂。

表1 rScolotoxin-Ssm2b对家蚕幼虫的神经毒性与致死性

实施例4 重组蜈蚣抗昆虫毒素rScolotoxin-Ssm2b对棉花主要害虫棉铃虫幼虫的毒性鉴定

基本方案：体腔注射法。本实施例中通过对棉花主要害虫棉铃虫幼虫的体腔注射实验来鉴定由重组蜈蚣抗昆虫毒素基因Scolotoxin-Ssm2.2编码的多肽rScolotoxin-Ssm2b的昆虫神经毒性。

实验步骤：实验对象为棉铃虫五龄幼虫（由南京农业大学植保学院的武淑文博士提供），每组30头,重复3次。待测药品为经过滤除菌的rScolotoxin-Ssm2b多肽与SUMO标签蛋白的混合物，其中的多肽rScolotoxin-Ssm2b的工作浓度为10 ug/ml，对照试剂为同样处理的SUMO标签蛋白。从虫体第6和第7腹节右侧的节间膜处注入试药10μl后，观察并记载虫体的活动状况，统计死亡的数量，计算死亡率。

结果分析：注入毒液后2-10秒, 虫体即剧烈扭转、痉挛，迅速吐液，持续数分钟后，棉铃虫头胸伸出、肛门拖粪、腹足失去抓握力而侧翻倒地、软瘫至死。其中的多数个体于1小时内中毒死亡，48小时3个给药组的死亡率皆达100%（表2）。而注射SUMO标签蛋白的对照组棉铃虫仅在注射后数分钟内静伏，1小时后全部恢复正常爬动，没有任何中毒症状；48小时内也无一死亡。由此可得，多肽rScolotoxin-Ssm2b对棉铃虫幼虫具有显著的神经毒性及致死作用，可用于制备神经生物学研究的工具试剂及生物杀虫剂。

表2 rScolotoxin-Ssm2b对棉铃虫幼虫的神经毒性与致死性

实施例5 重组蜈蚣抗昆虫毒素rScolotoxin-Ssm2b对重要农林害虫东亚飞蝗的毒性鉴定

基本方案：体腔注射法。本实施例中通过对重要农林害虫东亚飞蝗的体腔注射实验鉴定由蜈蚣毒素基因Scolotoxin-Ssm2.2编码的多肽rScolotoxin-Ssm2b的昆虫神经毒性。

实验步骤：实验对象为东亚飞蝗四龄若虫（购自南京市溧水县专业养殖户），每组30头,重复3次。待测药品为经过滤除菌的rScolotoxin-Ssm2b多肽与SUMO蛋白的混合物，其中的多肽rScolotoxin-Ssm2b的工作浓度为10 ug/ml，对照试剂为同样处理的SUMO标签蛋白。从虫体第4和第5腹节右侧的节间膜处注入试药10μl后，观察并记载虫体的活动状况，统计死亡的数量，计算死亡率。

结果分析：注入毒液后5分钟左右, 虫体即出现吐液、胸足和虫体的抖动痉挛、行走不稳、拉稀排便，持续数分钟后，蝗虫胸足失去抓握力而侧翻或翻转倒地、软瘫至死。最快的个体于注射后20分钟中毒死亡，24小时内3个给药组的死亡率皆达100%（表3）。而注射SUMO标签蛋白的对照组蝗虫仅在注射后数分钟内静伏，1小时后全部恢复正常的爬动，没有任何中毒症状；48小时内也无一死亡。由此可得，rScolotoxin-Ssm2b对东亚飞蝗具有显著的神经毒性及致死作用，可用于制备神经生物学研究的工具试剂及生物杀虫剂。

表3 rScolotoxin-Ssm2b对东亚飞蝗的神经毒性与致死性

实施例6 重组蜈蚣抗昆虫毒素rScolotoxin-Ssm2b对环境害虫美洲大蠊的毒性鉴定

基本方案：体腔注射法。本实施例中通过对环境害虫美洲大蠊的体腔注射实验鉴定由蜈蚣毒素基因Scolotoxin-Ssm2.2编码的多肽rScolotoxin-Ssm2b的昆虫神经毒性。

实验步骤：实验对象为美洲大蠊五龄若虫（由南京师范大学生命科学学院的蒋国芳教授提供），每组30头,重复3次。待测药品为经过滤除菌的rScolotoxin-Ssm2b多肽与SUMO蛋白的混合物，其中的多肽rScolotoxin-Ssm2b的工作浓度为10 ug/ml，对照试剂为同样处理的SUMO标签蛋白。从虫体第4和第5腹节间膜处注入试药10μl后，观察并记载虫体的活动状况，统计死亡的数量，计算死亡率。

结果分析：注入毒液后10秒左右, 虫体即出现触角和胸足的抖动痉挛、行走不稳、拉稀排便，持续数分钟后，蜚蠊胸足失去抓握力而侧翻或翻转倒地、软瘫至死。最快的个体于1小时内中毒死亡，48小时3个给药组的死亡率皆达100%（表4）。而注射SUMO标签蛋白的对照组蜚蠊仅在注射后数分钟内静伏，1小时后全部恢复正常的爬动，没有任何中毒症状；48小时内也无一死亡。由此可得，rScolotoxin-Ssm2b对环境害虫美洲大蠊具有显著的神经毒性及致死作用，可用于制备神经生物学研究的工具试剂及生物杀虫剂。

表4 rScolotoxin-Ssm2b对美洲大蠊的神经毒性与致死性

<110> 江苏教育学院

<120> 一种抗昆虫毒素及其编码序列以及重组毒素的制备与应用

<130> 20130614

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 57

<212> PRT

<213> 中国江苏少棘蜈蚣(S. subspinipes mutilans)

<400> 1

Gln Leu Leu Val Lys Asp Asp Val Pro Tyr Lys Glu Lys Arg Phe

1 5 10 15

Pro Asp Arg Gly Glu Cys Ile Lys Ala Cys Ala Ala Lys Phe Thr

20 25 30

Asp Gly Asp Glu Gly Leu Ile Lys Asp Val Glu Pro Ser Phe Tyr

35 40 45

Lys Cys Ile Cys Ser Tyr Tyr Val Ile Val Phe Tyr

50 55

<210> 2

<211> 174

<212> DNA

<213> 中国江苏少棘蜈蚣(S. subspinipes mutilans)

<400> 2

caacttctcg taaaagatga cgttccgtat aaagaaaaaa gatttcctga tagaggtgaa 60

tgtattaagg cttgtgcagc caaatttacg gatggagatg aaggcctaat aaaagatgta 120

gaaccgagtt tttataagtg tatttgctcg tattatgtga tagtattcta ctag 174

<210> 3

<211> 174

<212> DNA

<213> 中国江苏少棘蜈蚣(S. subspinipes mutilans)

<400> 3

cagctgctgg ttaaagacga cgttccgtac aaagaaaaac gtttcccgga ccgtggtgaa 60

tgcatcaaag cttgcgctgc taaattcacc gacggtgacg aaggtctgat caaagacgtt 120

gagccaagct tctacaaatg catatgctct tactacgtta tcgttttcta ctaa 174

Claims

1.一种抗昆虫毒素多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种多核苷酸，该多核苷酸选自以下组之一的核苷酸序列：

（a）编码权利要求1的多肽的多核苷酸；

（b）与多核苷酸（a）互补的多核苷酸。

3.一种多核苷酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

4.一种重组蜈蚣抗昆虫毒素基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

5.一种重组蜈蚣抗昆虫毒素的制备方法，其特征是包括如下步骤：

A，构建含有权利要求4中所述的重组蜈蚣抗昆虫毒素基因的重组质粒；

B，将重组质粒转化至宿主细胞中，得到含有重组质粒的工程菌株；

C，上述工程菌株经IPTG诱导，获得含有重组蜈蚣抗昆虫毒素多肽的菌体；

D，将上述菌体清洗、离心、超声破碎，收集上清液；

E，将上清液反复通过Ni2+-IDA亲和层析柱纯化，得到融合蛋白；

F，上述融合蛋白经过SUMO蛋白酶酶切，得到重组蜈蚣抗昆虫毒素多肽。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征是：所述步骤C 的具体步骤为：将重组质粒的工程菌株接种到LB培养液中，当工程菌培养液浓度OD600达到0.6~1.0时，加入IPTG至终浓度0.5mol/L，于18℃表达6小时，获得含有重组蜈蚣抗昆虫毒素多肽的菌体。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征是：步骤B中所述的宿主细胞是大肠杆菌BL21(DE3)。

8.根据权利要求5至7中任意一项所述的重组蜈蚣抗昆虫毒素的制备方法得到的重组蜈蚣抗昆虫毒素。

9.如权利要求8所得到的重组蜈蚣抗昆虫毒素在制备神经毒性类制剂中的应用。

10.如权利要求8所得到的重组蜈蚣抗昆虫毒素在制备杀虫剂中的应用。

11.根据权利要求9或10所述的重组蜈蚣抗昆虫毒素的应用，其特征是所述重组蜈蚣抗昆虫毒素多肽中含有两对正确连接的共价二硫键。