CN103724243A - 4-甲氧基苯甲醛l-半胱氨酸席夫碱及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

4-甲氧基苯甲醛L-半胱氨酸席夫碱及其制备方法与应用，涉及4-甲氧基苯甲醛L-半胱氨酸席夫碱。4-甲氧基苯甲醛L-半胱氨酸席夫碱相对分子量为239。将99.90%的L-半胱氨酸加入水中溶解，制成L-半胱氨酸水溶液，再加入无水乙醇，得L-半胱氨酸乙醇溶液，然后加入4-甲氧基苯甲醛和无水乙醇后油浴加热，再抽滤，沉淀冲洗后，用石油醚水溶液重结晶纯化，得白色固体产物。能在试管中有效抑制蘑菇酪氨酸酶、人酪氨酸酶的活力，能在人黑色素瘤A375、A875细胞中有效下调酪氨酸酶表达量，对人类正常肝脏细胞L02和KM小鼠无毒性。可在制备用于美白化妆品的增白剂中应用，也可在制备用于治疗色素紊乱症的药物中应用。

Description

4-甲氧基苯甲醛L-半胱氨酸席夫碱及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及4-甲氧基苯甲醛L-半胱氨酸席夫碱，尤其是涉及4-甲氧基苯甲醛L-半胱氨酸席夫碱及其制备方法与应用。

背景技术

酪氨酸酶是生物体黑素生物合成的关键酶。酪氨酸酶的活性与黑素合成量相关，可通过调控其活力而调控黑素的生成量（Friedman M.Food browning and its prevention∶anoverview[J].J.Agric.Food Chem.,1996,44(3)∶631-653）。黑色素(Melanin)是决定人类皮肤、眼睛和头发颜色的重要因素。

黑色素的合成是黑色素细胞的一种应激反应，反应过强，酪氨酸酶过量表达，可引起黑色素过多，如雀斑、褐斑、老年斑甚至黑色素细胞瘤等；反应过弱或缺乏反应，酪氨酸酶不表达或活性受到抑制，则可引发白发病、白癜风等病。为治疗和预防黑色素过多而引发的皮肤病，应运而生很多黑色素合成抑制剂目前主要为酪氨酸酶抑制剂，如曲酸、熊果甙、一些中草药的提取物，它们已被应用到美白化妆品中，并已被人们广泛接受。但是，现有的美白剂功效及治疗效果不是十分理想，而且有些还具有一定的毒副作用，因此，迫切需要研究高效无毒副作用的黑色素合成抑制剂。

L-半胱氨酸及其盐等均有很好的美白效果，尤其是L-半胱氨酸二羧酸盐，其美白效果更为突出。最近研究表明，半胱氨酸中的巯基具有较强的还原能力和化学反应活性，存在于色素细胞中的半胱氨酸，可以调节黑色素的生成。紫外线照射后皮肤变黑与表皮中半胱氨酸量减少有关。同时半胱氨酸还具有还原黑色素、祛除已有色斑的效果。根据以上研究,提高表皮底层部分半胱氨酸的含量可达到美白、祛斑的目的。日本一家公司曾于2003年开发出一种含有半胱氨酸和色氨酸的二肽化合物，是一种黑色素抑制剂，体外实验表明该化合物可以分解角鲨烯的过氧化物，抑制在紫外光下角鲨烯的光氧化，抑制酪氨酸酶活性。为更好地设计和开发新型黑色素合成抑制剂，有必要探讨抑制剂对酪氨酸酶的抑制作用机理。目前，市场上主要的美白化妆品的增白剂一般采用天然提取物，但是天然提取物成分复杂造成提取和加工工艺困难。而化学合成的增白剂利于大批量生产，制作工艺简单，增白效果快速而显著，但容易存在安全性的问题。

至今未见有关对4-甲氧基苯甲醛L-半胱氨酸席夫碱在化妆品及药物应用的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供4-甲氧基苯甲醛L-半胱氨酸席夫碱及其制备方法与应用。

所述4-甲氧基苯甲醛L-半胱氨酸席夫碱(MOBCS)相对分子量为239，绝对分子量为239.2908，结构式如下：

其旋光性为左旋，用“L-”表示，为白色粉末。

所述4-甲氧基苯甲醛L-半胱氨酸席夫碱的制备方法，包括以下步骤：

1）将99.90%的L-半胱氨酸加入水中溶解，制成L-半胱氨酸水溶液；

2）在L-半胱氨酸水溶液中加入无水乙醇，得L-半胱氨酸乙醇溶液；

3）在L-半胱氨酸乙醇溶液中加入4-甲氧基苯甲醛和无水乙醇后油浴加热，再抽滤，沉淀冲洗后，用石油醚水溶液重结晶纯化，得白色固体产物。

在步骤1）中，所述L-半胱氨酸与水的质量比可为1∶（0.6～1.5），优选1∶（1.2～1.4）；所述水可采用去离子双蒸水。

在步骤2）中，所述L-半胱氨酸水溶液与无水乙醇的质量比可为1∶（4.0～6.0），优选1∶（4.4～5.5）。

在步骤3）中，所述L-半胱氨酸乙醇溶液、4-甲氧基苯甲醛和无水乙醇的质量比可为1∶（0.1～0.2）∶（0.4～0.75）；所述加热的温度可为105～131℃，加热的时间可为3～3.4h，优选加热的温度为115～125℃；所述沉淀冲洗可采用无水乙醇冲洗沉淀2～6次；所述石油醚水溶液中的石油醚与水的质量比可为（8～9）∶1；产率为70.1%～72.3%。

本发明所制备的4-甲氧基苯甲醛L-半胱氨酸席夫碱能在试管中有效抑制蘑菇酪氨酸酶、人酪氨酸酶的活力，能在人黑色素瘤A375、A875细胞中有效下调酪氨酸酶表达量，对人类正常肝脏细胞L02和KM小鼠无毒性。因此，所述4-甲氧基苯甲醛L-半胱氨酸席夫碱可在制备用于美白化妆品的增白剂中应用，也可在制备用于治疗色素紊乱症的药物中应用。

4-甲氧基苯甲醛L-半胱氨酸席夫碱在室温下能很好溶解于甲醇、二甲亚砜（DMSO）和三氟乙酸（TFA）中，但在水、无水乙醇、乙酸乙酯中溶解程度很低。其溶解性有碍于其在化妆品中的应用，所以本发明解决了其在甘油中的溶解问题。首先按一定比例把4-甲氧基苯甲醛L-半胱氨酸席夫碱与甘油混和，形成乳浊液。然后加入约100℃的热水，室温搅拌1～2h，4-甲氧基苯甲醛L-半胱氨酸席夫碱逐渐溶解。

本发明提出了一种新型低毒的化学结构，具有良好的美白功能和基因调控功能，具有潜在的化妆品和药物成分开发价值，能够带来良好的经济价值和社会价值。

附图说明

图1为本发明中4-甲氧基苯甲醛L-半胱氨酸席夫碱使用Esquire3000plus低分辨率电喷雾质谱质谱仪测试得到的质谱结果，4-甲氧基苯甲醛L-半胱氨酸席夫碱分子量为239，加一个电子显示质量为240.6。

图2为本发明中4-甲氧基苯甲醛L-半胱氨酸席夫碱使用Bruker Apex ultra7.0T FT-MS高分标率质谱仪检测的质谱结果，4-甲氧基苯甲醛L-半胱氨酸席夫碱分子量为239，加一个电子质量为240.06926。

图3为本发明中4-甲氧基苯甲醛L-半胱氨酸席夫碱使用核磁共仪Bruker600M对物质结构的鉴定，利用NMR-H谱对合成4-甲氧基苯甲醛L-半胱氨酸席夫碱进行结构鉴定。1H NMR(CD3OD-d6，TMS，600MHz)：δ(ppm)7.52、6.95(C6H4，4H)，5.71(CH=N)，4.85(CH)，3.79(OCH3，3H)，3.31(CH2，2H)。

图4为本发明中4-甲氧基苯甲醛缩氨基L-半胱氨酸席夫碱在试管中对蘑菇酪氨酸酶的抑制曲线。

图5为本发明中4-甲氧基苯甲醛缩氨基L-半胱氨酸席夫碱在试管中对蘑菇酪氨酸酶的抑制类型。直线0～4的抑制剂浓度分别为0,1.2,1.6,3.2和4.8μM。右二图为斜率和截距进行作图处理，采用双倒数作图法。

图6为本发明中4-甲氧基苯甲醛缩氨基苯甲醛半胱氨酸席夫碱作用于L-DOPA被酪氨酸酶催化氧化后的紫外光谱随时间的变化曲线（20μM）。

图7为本发明中4-甲氧基苯甲醛缩氨基苯甲醛半胱氨酸席夫碱作用于L-DOPA被酪氨酸酶催化氧化后的紫外光谱随时间的变化曲线（100μM）。

在图6和7中，L-DOPA浓度为0.5mM；曲线1～10对应的时间分别为:1,2,3,4,5,6,7,8,9和10min。

图8为本发明的4-甲氧基苯甲醛缩氨基L-半胱氨酸席夫碱20μM的浓度下随作用时间对人A375黑色素瘤细胞内酪氨酸酶表达量下调的western结果。

图9为本发明的4-甲氧基苯甲醛缩氨基L-半胱氨酸席夫碱20μM的浓度下随作用时间对人A875黑色素瘤细胞内酪氨酸酶表达量下调的western结果。

图10为本发明的4-甲氧基苯甲醛缩氨基L-半胱氨酸席夫碱对人A375、A875黑色素瘤细胞内酪氨酸酶mRNA表达量的影响。图中各不同柱形依次表示不同浓度4-甲氧基苯甲醛缩氨基L-半胱氨酸席夫碱的实验组相对于0μM的对照组的作用效果图。4-甲氧基苯甲醛缩氨基L-半胱氨酸席夫碱的浓度依次为0.50、10、50和75μM。图中对照组mRNA表达量设为1，图中未给出。

图11为本发明的4-甲氧基苯甲醛缩氨基L-半胱氨酸席夫碱作用于KM小鼠皮肤透皮率的结果。图中不同柱形图代表涂抹药物后不同时间药物透过KM小鼠皮肤表皮的速率。

具体实施方式

下面实施例将结合附图对本发明作进一步的详细描述，以使本领域技术人员能够实践本发明。应当理解，可以采用其他实施方式，并且可以做出适当的改变而不偏离本发明的精神或范围。为了避免对于使本领域技术人员能够实践本发明来说不必要的细节，说明书可能省略了对于本领域技术人员来说已知的某些信息。因此，以下详细描述不应以限制性的意义来理解，且本发明的范围仅由所附权利要求界定。

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不用来限制本发明的范围。

下述实施例中所使用的各原料，除特别指出的以外，均可由市售获得。

实施例1：

本发明中4-甲氧基苯甲醛L-半胱氨酸席夫碱的制备方法实施例如下：

L-半胱氨酸100g先加入140mL去离子双蒸水搅拌使L-半胱氨酸最大程度的溶解，加入1500mL无水乙醇，搅拌。加入215mL4-甲氧基苯甲醛，再加入900mL无水乙醇，搅拌，加热121℃。3h后，停止反应。直接抽滤，用无水乙醇冲洗3次，90%石油醚水溶液重结晶，得白色固体产物。

实施例2：

本发明本发明4-甲氧基苯甲醛缩氨基L-半胱氨酸席夫碱对人黑色素瘤A375、A875细胞中酪氨酸酶的蛋白表达量研究

用DMEM HighGlucose培养基（含有10%胎生小牛血清、青霉素100U/mL、链霉素100μg/mL），在CO2孵箱中37℃、CO₂=5%和饱和湿度的条件下培养细胞。待细胞生长至近融合状态，吸去培养基，加入用含血清培养基配置而成的20μM的4-甲氧基苯甲醛缩氨基L-半胱氨酸席夫碱作为培养基加入细胞培养皿，分别培养12、24和48h后，经0.25%胰蛋白酶消化后，收集细胞，5000rpm离心取出上清，加入200μL的RIPA裂解液（含有50mM pH7.4Tris，150mM NaCl，1%NP-40，0.5%sodium deoxycholate，0.1%SDS，以及sodium orthovanadate，sodium fluoride，EDTA，leupeptin），冰上裂解1h后，10000rpm离心后取上清液，测定蛋白浓度，分装，按照10×20μg浓度配置加入4×loading缓冲液，100℃热变性30min。将所得样品SDS-PAGE电泳后转膜，孵育一抗二抗，显影，如图9所示，20μM的本发明所述4-甲氧基苯甲醛缩氨基L-半胱氨酸席夫碱在处理人黑色素瘤A375、A875细胞伴随时间增长，能有效下调酪氨酸酶的表达量。

实施例3：

本发明4-甲氧基苯甲醛缩氨基L-半胱氨酸席夫碱对酪氨酸酶的紫外可见光谱学研究

通过紫外可见光谱研究该类化合物对酪氨酸酶的抑制机理。在图6中，曲线1为L-DOPA的紫外可见光谱，由图可见L-DOPA在280nm处有最大吸收峰。曲线2～11则是L-DOPA在未加效应物的情况下，酪氨酸酶催化氧化作用不同时间后的紫外可见光谱，由图可知，L-DOPA被酪氨酸酶催化氧化后紫外光谱又产生两个特征峰（最大吸收峰），分别位于315nm（紫外区）和475nm（可见区）处。315nm的特征吸收峰为肩峰，吸收值随着催化反应时间的延长不断增大，说明是产物的特征峰。475nm是测定酪氨酸酶活性时所采用，吸收值随着催化反应时间的延长不断增大，是产物在可见区的特征峰。

在图7中，曲线2～4是L-DOPA在未加效应物的情况下，NaIO4催化氧化作用不同时间后的紫外可见光谱，由图可知，L-DOPA被NaIO4氧化（非酶催化）产生的紫外可见光谱和L-DOPA被酪氨酸酶氧化（酶催化）产生的紫外可见光谱峰型一致，说明产生了相同的产物。并且由图7的曲线2～4可以看出，100μM L-DOPA已完全被100μM NaIO4完全氧化，曲线吸光值不再随着反应时间的改变而增大。由图6可见，4-甲氧基苯甲醛缩氨基L-半胱氨酸席夫碱对280nm处特征峰的吸光值没有影响，而导致315nm和475nm处的特征吸收峰的吸光值随时间增长的趋势降低相对于图6。说明4-甲氧基苯甲醛缩氨基L-半胱氨酸席夫碱对酪氨酸酶催化活力有抑制作用。图7中的曲线2～4是L-DOPA被NaIO₄催化氧化后，分别在10、50、100μM4-甲氧基苯甲醛缩氨基L-半胱氨酸席夫碱的作用下，产物的紫外可见光谱变化。由图7中曲线1～4可知，随着4-甲氧基苯甲醛缩氨基L-半胱氨酸席夫碱浓度的增大，产物的特征吸收峰位置315nm和475nm处吸光值均不断下降，但315nm处吸光值下降较为明显。

实施例4：

本发明4-甲氧基苯甲醛缩氨基L-半胱氨酸席夫碱的对人A375、A875黑色素瘤细胞的美白功效

1、4-甲氧基苯甲醛缩氨基L-半胱氨酸席夫碱对人A375、A875黑色素瘤细胞以及人正常肝脏细胞L02增殖的影响

用DMEM HighGlucose培养基（含有10%胎生小牛血清、青霉素100U/mL、链霉素100μg/mL），在CO₂孵箱中37℃、CO₂=5%和饱和湿度的条件下培养细胞。待细胞生长至近融合状态，经0.25%胰蛋白酶消化后，收集并调整细胞浓度为10⁴/mL到96孔细胞培养板中。每孔加入200μL的人A375、A875黑色素瘤细胞以及人正常肝脏细胞L02单细胞悬液，过夜。待细胞贴壁后弃去原培养基，分别加入含0.50、10、20、30、50和100μM的本发明实施例2得到的4-甲氧基苯甲醛缩氨基L-半胱氨酸席夫碱的DMEM HighGlucose培养基200μL。继续培养48h后弃培养液。于结束前4h，用pH7.4的PBS缓冲液（137mM NaCl、2.7mM KCl、10mM Na₂HPO₄、2mM KH₂PO₄）洗涤2次，每孔加入20μL的0.5mg/mL MTT和180μL新鲜的DMEM HighGlucose培养液，在CO2孵箱中在37℃、CO2=5%和饱和湿度的条件下培养细胞4h后，弃上清液。每孔加入200μL DMSO，在37℃条件下，震荡10min，使蓝紫色结晶甲臜完全溶解，立即用酶标仪测定570nm光吸收值。每一浓度处理设3个重复，取平均值。每次实验均取同一传代细胞。结果如图6和7所示。

由图8可知：0.50、10、20、30、50和100μM的4-甲氧基苯甲醛缩氨基L-半胱氨酸席夫碱对人A375、A875黑色素瘤细胞以及人正常肝脏细胞L02的增殖没有明显影响，说明无细胞毒性。

2、4-甲氧基苯甲醛缩氨基L-半胱氨酸席夫碱对人A375、A875黑色素瘤细胞内黑色素含量的影响

细胞培养方法同上。待细胞生长至近融合状态，经0.25%胰蛋白酶消化收集并调整细胞浓度，2×10⁴接种于6孔板中，过夜，待贴壁后换液，分别加入含0.50、10、20、30、50和100μM的4-甲氧基苯甲醛缩氨基L-半胱氨酸席夫碱的培养基2mL。继续培养48h后弃培养液。用pH7.4的PBS缓冲液洗涤2次，加入1.0mL10%DMSO的1.0M NaOH溶液，80℃培养2h，1000g离心10min，取上清液于405nm处测定吸光度值。每一浓度处理设3个重复，取平均值。每次实验均取同一传代细胞。结果如图8所示。

由图8可知：在浓度范围为0.50、10、20、30、50和100μM的4-甲氧基苯甲醛缩氨基L-半胱氨酸席夫碱的作用下，人A375、A875黑色素瘤细胞内黑色素含量受到抑制，并且抑制作用呈现出浓度依赖性。

3、4-甲氧基苯甲醛缩氨基L-半胱氨酸席夫碱对人A375、A875黑色素瘤细胞内酪氨酸活性的影响

细胞培养方法同上。待细胞生长至近融合状态，经0.25%胰蛋白酶消化收集并调整细胞浓度，2×10⁴接种于6孔板中，过夜，待贴壁后换液，分别加入含0.50、10、20、30、50和100μM的4-甲氧基苯甲醛缩氨基L-半胱氨酸席夫碱的培养基2mL。继续培养48h后弃培养液。用pH7.4的PBS缓冲液洗涤2次，每孔加入体积分数为1%TritonX-100的PBS缓冲液900μL，然后加入100μL1.0mg/mL L-DOPA，超声2min，随后在30℃培养30min，测定475nm处的吸光度值。每一浓度处理设3个重复，取平均值。每次实验均取同一传代细胞。结果如图9所示。

由图8和9可知：在浓度范围为0.50、10、20、30、50和100μM的4-甲氧基苯甲醛缩氨基L-半胱氨酸席夫碱的作用下，人A375、A875黑色素瘤细胞内的酪氨酸活性受到抑制，并且抑制作用呈现出浓度依赖性。

4、4-甲氧基苯甲醛缩氨基L-半胱氨酸席夫碱对人A375、A875黑色素瘤细胞内酪氨酸酶基因水平表达的影响

细胞培养方法同上。待细胞生长至近融合状态，经0.25%胰蛋白酶消化收集并调整细胞浓度，2×10⁴接种于6孔板中，过夜，待贴壁后换液，分别加入含0.50、10、50、75μM的4-甲氧基苯甲醛缩氨基L-半胱氨酸席夫碱的培养基2mL。继续培养48h后弃培养液。用pH7.4的PBS缓冲液洗涤2次，加入200μL Trizol，提取总RNA，使用MMPLV逆转录病毒逆转录，合成cDNA,加入TYR、Actin对应引物，SYBR荧光染料，进行QPCR实时采集荧光进行检测，结果如图10所示。

以上结果说明，本发明的4-甲氧基苯甲醛缩氨基L-半胱氨酸席夫碱对人A375、A875黑色素瘤细胞以及正常肝脏细胞L02细胞无细胞毒性，可以有效抑制人A375、A875黑色素瘤细胞内黑色素的含量，而且可以有效下调酪氨酸酶的基因表达，抑制作用可能主要通过抑制酪氨酸酶活性及下调酪氨酸酶表达来实现。因此，本发明的4-甲氧基苯甲醛缩氨基L-半胱氨酸席夫碱具有很好的美白功效，可以作为化妆品的美白添加剂以及治疗色素紊乱症的药物有效成分。

实施例5：

本发明中4-甲氧基苯甲醛L-半胱氨酸席夫碱的对于KM小鼠皮肤渗透性及毒理试验方法实施例如下：

1、4-甲氧基苯甲醛缩氨基L-半胱氨酸席夫碱对KM小鼠皮肤渗透率的影响

选取5周龄体重15g左右KM小鼠作为实验对象，正常喂养，试验前1天对小鼠背部皮肤进行脱毛备皮，24h后颈椎脱臼法处死小鼠，取背面皮肤大小为3cm²左右大小，平行去三只老鼠同一部位皮肤，安装到SCK-1智能透皮仪上，使用生理盐水配置本发明说述4-甲氧基苯甲醛缩氨基L-半胱氨酸席夫碱1mM溶液，加入外表皮一侧，0、2、4、6、8、10h分别从下部取样，10h后统一使用自动纯化系统对样本中所含4-甲氧基苯甲醛缩氨基L-半胱氨酸席夫碱含量，结果如图11所示。

2、4-甲氧基苯甲醛缩氨基L-半胱氨酸席夫碱对KM小鼠急性毒理学的影响

选取5周龄体重15g左右KM小鼠作为实验对象，第一周按照3g/kg灌胃处理，连续灌胃3天，观察小鼠2周，详细记录小鼠的行动力、活跃程度等各项生理指标。2周后未看到任何异常。

综上所述，4-甲氧基苯甲醛缩氨基L-半胱氨酸席夫碱能够良好的透过小鼠皮肤，并且对于KM小鼠基本没有毒性。因此，本发明的4-甲氧基苯甲醛缩氨基L-半胱氨酸席夫碱具有很好的皮肤渗透性，安全无毒，可以作为化妆品的美白添加剂以及治疗色素紊乱症的药物有效成分。

4-甲氧基苯甲醛是一种具有茴清香气的无色或淡黄色液体。4-甲氧基苯甲醛近年来主要用于醛类合成香料，主要用作山楂、葵花、紫丁香等香精的香基，也是新刈草、银白金合欢花、金合欢、香水草等香精的调合香料，同时是铃兰香精的助香剂，桂花香精的修饰剂，但是被认为具有一定的毒性及刺激性，其使用受到限制。本发明表明4-甲氧基苯甲醛也是酪氨酸酶的抑制剂。但是考虑该物质的毒性和刺激性，不能够得到普遍应用。但是根据研究表明，醛类化合物中的醛基在抑制微生物生长、产生毒理的过程中起关键作用，所以本发明把半胱氨酸与4-甲氧基苯甲醛的醛基缩合，形成酰氨键，降低醛基带来的毒性。因半胱氨酸抑制酪氨酸酶的关键基团是巯基，在合成中保留了该基团，并加以保护。通过对体外蘑菇酪氨酸酶的抑制动力学模型进行抑制效果研究表明，4-甲氧基苯甲醛L-半胱氨酸席夫碱、半胱氨酸和4-甲氧基苯甲醛对酪氨酸酶活性的半抑制率分别为10μM，15.0μM，8mM（见表1）。半抑制率体现了抑制剂对酶的抑制强度，越小说明抑制强度越强。目前，检测化合物对酪氨酸酶的抑制活性成为衡量该类化合物作为化妆品增白剂的增白效果的指标。化合物对酪氨酸酶的抑制强度越大，表明其增白效果越好。由实验结果可以得到4-甲氧基苯甲醛L-半胱氨酸席夫碱对酪氨酸酶的抑制强度相对于它的两个原料大大增强。

表1显示了4-甲氧基苯甲醛缩氨基L-半胱氨酸席夫碱、半胱氨酸、4-甲氧基苯甲醛（MOBCS）、曲酸、间苯二酚细胞外酪氨酸酶单体研究模型的抑制作用研究。

表14-甲氧基苯甲醛缩氨基L-半胱氨酸席夫碱对酪氨酸酶的抑制作用及机理

从基因调控水平研究表明，4-甲氧基苯甲醛L-半胱氨酸席夫碱能有在人黑色素瘤A375、A875中有效下调，通过Western、RealtimePCR进行检测表明（如图8和9所示），4-甲氧基苯甲醛L-半胱氨酸席夫碱以相同浓度不同时间和不同浓度相同时间作用与人黑色素瘤A375以及A875后，能在基因水平和蛋白表达水平上有效抑制人细胞内酪氨酸酶Tyrosinase的表达下调。

表24-甲氧基苯甲醛L-半胱氨酸席夫碱和曲酸对人的细胞学效应

表2显示为本发明中所述4-甲氧基苯甲醛缩氨基L-半胱氨酸席夫碱对于人黑色素瘤A375、A875的生长抑制率及酪氨酸酶抑制率，以及对于人正常肝脏细胞L02的生长抑制率。

合成化合物的安全性和高效性：由表2可以看到，相对于目前市场上应用比较多的化妆品增白剂曲酸以及常用于治疗色素紊乱疾病的药物间苯二酚，以正常人类肝脏细胞L02、人恶性黑色素瘤细胞A375和A875作为研究对象，从细胞毒性来看，4-甲氧基苯甲醛L-半胱氨酸席夫碱明显优于曲酸和间苯二酚，它的毒性非常小；同时4-甲氧基苯甲醛L-半胱氨酸席夫碱对细胞内酪氨酸酶活性的抑制效果略强于曲酸以及间苯二酚。本申请研究了4-甲氧基苯甲醛L-半胱氨酸席夫碱对正常肝脏细胞L02的作用，结果表明，其对肝脏细胞生长没有影响，没有肝毒性。表明4-甲氧基苯甲醛L-半胱氨酸席夫碱的毒性非常小，可用于化妆品增白剂以及治疗色素紊乱疾病的药物成分。对KM小鼠透皮性试验表明，4-甲氧基苯甲醛缩氨基L-半胱氨酸席夫碱能够很好地透过小鼠皮肤（见图11），具有成为高效的化妆品成分和皮肤色素紊乱症的潜在治疗药物。本申请还研究了药物对活体KM小鼠的浅表皮涂抹及灌胃的急性毒理试验，研究表明，20mM4-甲氧基苯甲醛L-半胱氨酸席夫碱对人腹部、背部皮肤进行涂抹后，观察4周，未对人皮肤造成刺激性影响；使用3g/kg给药量对6周龄KM小鼠进行灌胃，观察4周，未见老鼠有明显不适反应。

Claims (10)

1.4-甲氧基苯甲醛L-半胱氨酸席夫碱，其特征在于其相对分子量为239，绝对分子量为239.2908，结构式如下：

其旋光性为左旋，用“L-”表示，为白色粉末。

2.如权利要求1所述4-甲氧基苯甲醛L-半胱氨酸席夫碱的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）将99.90%的L-半胱氨酸加入水中溶解，制成L-半胱氨酸水溶液；

2）在L-半胱氨酸水溶液中加入无水乙醇，得L-半胱氨酸乙醇溶液；

3）在L-半胱氨酸乙醇溶液中加入4-甲氧基苯甲醛和无水乙醇后油浴加热，再抽滤，沉淀冲洗后，用石油醚水溶液重结晶纯化，得白色固体产物4-甲氧基苯甲醛L-半胱氨酸席夫碱。

3.如权利要求2所述4-甲氧基苯甲醛L-半胱氨酸席夫碱的制备方法，其特征在于在步骤1）中，所述L-半胱氨酸与水的质量比为1∶（0.6～1.5），优选1∶（1.2～1.4）。

4.如权利要求2所述4-甲氧基苯甲醛L-半胱氨酸席夫碱的制备方法，其特征在于在步骤1）中，所述水可采用去离子双蒸水。

5.如权利要求2所述4-甲氧基苯甲醛L-半胱氨酸席夫碱的制备方法，其特征在于在步骤2）中，所述L-半胱氨酸水溶液与无水乙醇的质量比为1∶（4.0～6.0），优选1∶（4.4～5.5）。

6.如权利要求2所述4-甲氧基苯甲醛L-半胱氨酸席夫碱的制备方法，其特征在于在步骤3）中，所述L-半胱氨酸乙醇溶液、4-甲氧基苯甲醛和无水乙醇的质量比为1∶（0.1～0.2）∶（0.4～0.75）。

7.如权利要求2所述4-甲氧基苯甲醛L-半胱氨酸席夫碱的制备方法，其特征在于在步骤3）中，所述加热的温度为105～131℃，加热的时间为3～3.4h，优选加热的温度为115～125℃。

8.如权利要求2所述4-甲氧基苯甲醛L-半胱氨酸席夫碱的制备方法，其特征在于在步骤3）中，所述沉淀冲洗是采用无水乙醇冲洗沉淀2～6次。

9.如权利要求2所述4-甲氧基苯甲醛L-半胱氨酸席夫碱的制备方法，其特征在于在步骤3）中，所述石油醚水溶液中的石油醚与水的质量比为（8～9）∶1。

10.如权利要求1所述4-甲氧基苯甲醛L-半胱氨酸席夫碱在制备用于美白化妆品的增白剂中应用，也可在制备用于治疗色素紊乱症的药物中应用。

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