CN103718964A - 一种峨眉双蝴蝶的种子繁殖技术 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种组织培养式峨眉双蝴蝶的种子繁殖方法，该方法包括（1）幼苗的获得和培养；（2）生根培养；（3）炼苗移栽。本发明采用组培的方式进行峨眉双蝴蝶的人工育苗更有利于苗种的规模化、标准化和工厂化生产，同时提高了出芽的整齐度和成活率；本发明采用种子连同胎座一起进行培养的新技术，种子发芽率在99%以上，并且出芽非常整齐和一致，从接种到苗高5厘米，4-5片叶只要4-5个月，成苗率可达90%以上。

Description

一种峨眉双蝴蝶的种子繁殖技术

技术领域

本发明涉及一种采用组织培养的器材和方法进行峨眉双蝴蝶种子繁殖的方法。

背景技术

龙胆科植物峨眉双蝴蝶，喜阴暗潮湿，常生于海拔500～600米的山坡茶树林下和灌丛中，其叶、茎、根均可入药，具清肺止咳、止血、解毒、散结的功效，用于肺结核、咯血、肺脓疡、疗疖疮毒、支气管炎、败毒抗癌等都有很好的效果。

峨眉双蝴蝶属大宗常用中药材，是百余种中药的主要原料，《本草纲目》中的正品。但因多年来土地开垦，畜牧业发展，及过度采伐等原因，使其资源遭到严重破坏，其产量由过去的26.7万公斤下降到10.75万公斤，市场价也由每公斤1.7元上升到每公斤28-35元，89年已被国家医药部门列入重点发展和保护品种，多年来因峨眉双蝴蝶繁殖难度大和生长条件的限制一直未发展成大规模人工生产。近几年来随着医药需求量增加，也只能少部分地方小面积栽培。

峨眉黄蝴蝶的种子微小，近黑色，椭圆形，长约2mm，宽1.2-0.3mm，每年国庆节前后开始开花，果实至元月底前后成熟，果实长，种子千粒重0.95g ，自然条件下发芽时间长，极不整齐，发芽率很低，发芽率约1%，发芽后6个月长不出完全的真叶。我们用河沙、珍珠岩、加原产地土壤做了3年种子繁殖试验，最后没有得到一株苗，说明自然条件下峨眉双蝴蝶的种子繁殖很难，它有一个非常明显的无效幼苗期，制约着峨眉双蝴蝶大规模人工生产。

因此，为了保护和发展双蝴蝶属的野生资源，为其人工栽培提供足量的苗木，开发高效、实用的峨眉双蝴蝶种子繁殖技术是十分必要的。

发明内容

本发明要解决的技术问题就是针对峨眉双蝴蝶在自然条件下发芽率低、发芽后生长周期长、成苗率低的缺陷，建立一种高效、实用的峨眉双蝴蝶种子繁殖方法，为峨眉双蝴蝶人工栽培提供大量苗木。

本发明包括以下几个步骤：

（1）幼苗的获得和培养：每年12月至次年2月采集峨眉双蝴蝶茎上饱满无病虫危害的紫红色果实，先用自来水洗净，后用饱和洗衣粉溶液漂洗5-6分钟，再用自来水流水冲洗20-30分钟，滤干水，放在干净组培瓶中带入无菌室，在超净工作台上用75%的乙醇浸50-60秒后，转入0.1%的升汞溶液中浸泡16-20分钟，其间不断地摇动，以便充分杀菌。

升汞溶液灭菌后，用无菌水反复冲洗，打开干燥的无菌滤纸本，夹于滤纸本中。打开滤纸本用无菌解剖刀和镊子，剥除紫红色外果皮，露出白色棒状的胎座，用刀轻轻将胎座纵向切开，露出芝麻大小紫黑色的种子，种子在胎座内纵向排列成4行，用刀沿种子排列的纵缝，将胎座连同种子切成4条，每条胎座都有一定数量的种子。用镊子将胎座放在萌发培养基上，盖上瓶盖，并用封口膜加强，防止瓶内水分挥发和杂菌感染。

所述萌发培养基的优选配方为：1/2MS+20%香蕉提取液+6-BA2.0mg.L^-1+NAA0.2mg. L^-1+2%蔗糖+琼脂6g. L^-1。

22-28℃条件下，暗培养至种子萌发，萌发后每天给予1500-2500LX光照，直至分化长出幼小真叶。一般情况下，种子约20天发芽，约30天子叶完全展开，形成有两片子叶的无菌峨眉双蝴蝶幼苗，发芽率99%以上，约50天分化出两片幼小真叶。    

（2）生根培养：当有幼小真叶分化出来时，将小苗连同胎座整块取出，放在打开的无菌滤纸本中，用镊子和小刀把小苗互相分开，接种于生根壮苗培养基上，盖上瓶盖，并用封口膜加强，防止瓶内水分挥发和杂菌感染。22-28℃，每天1500-2500LX光强照射10-20小时，培养至苗高4-5厘米并有4-5片真叶。

所述生根壮苗培养基的优选配方为：花宝3号3g. L^-1+20%香蕉提取液+IBA0.2mg. L^-1+活性碳2g. L^-1+2%蔗糖+琼脂6g. L^-1，花宝3号是指美国进口速效复合肥，氮、磷、钾三要素含量比例分别为10∶30∶20。

培养过程中，10-15天可见根系大量发生，50-70天可长出4-5片真叶，苗高4.5-5.5厘米。

（3）炼苗移栽：当苗高4-5厘米、有4-5片真叶时进行练苗移栽，先在荫蔽度70-80%的塑料大棚内闭瓶炼苗4-5天，再将瓶盖完全旋松，但不拿开，炼苗两天，再开瓶炼苗两天，然后将苗从瓶中取出，用水将根部培养基洗干净，栽于装有蛭石：红壤土：细河沙的塑料袋中，每袋栽一株，其中蛭石、红壤土和细河沙的比例为1:2:2，并事先用高锰酸钾水溶液处理。

栽好后用0.2%-0.3%的花宝3号水溶液喷雾，洗净植株表面，并使基质下沉，紧密与根接触，基质含水量达到55-60%，再放在表面铺有粗砂的塑料大棚内，大棚内做40-50公分高的支架，上面覆盖农膜，使植株置于农膜的下面。覆盖农膜48小时内，膜内空气相对湿度控制在90%，温度25-30℃，过高时揭膜调温调湿，以后逐渐降低空气相对湿度，15天后降低到70%，此时去掉农膜继续炼苗20-40天，即可起苗定植。

本发明的特点是采用组织培养的方式对峨眉双蝴蝶进行种子繁殖育苗，特别是将种子连同胎座共同置于培养基上进行出苗的方式，克服了峨眉双蝴蝶种子出芽非常不整齐，成活率低的缺陷，使得本发明在峨眉双蝴蝶的育苗过程中具有十分重要的实用价值，本发明同时也有利于发展和保护峨眉双蝴蝶这一重要中草药植物。

采用组培的方法，将种子连同胎座共同置于培养基上进行出苗可以克服峨眉双蝴蝶自然繁殖状态下种子出芽非常不整齐，成活率低的缺陷的原因，我们经研究和分析，原因很可能是：在自然状态下，由于胎座很快坏死和脱落，并且无法吸收培养基中的养分，因而无法产生某种植物激素，这种植物激素能够使峨眉双蝴蝶种子出芽整齐，成活率提高；而在本发明的人工条件下，其胎座可以吸收培养基中的养分，从而向种子分离植物激素，使种子出芽整齐，成活率提高。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：采用组培的方式进行峨眉双蝴蝶的人工育苗更有利于苗种的规模化、标准化和工厂化生产，同时提高了出芽的整齐度和成活率。采用本技术，种子发芽率在99%以上，并且出芽非常整齐和一致，从接种到苗高5厘米，4-5片叶只要4-5个月，成苗率可达90%以上。

具体实施方式

以下对峨眉双蝴蝶的种子繁殖方法进行详细说明。

实施例1：

（1）幼苗的获得和培养：12月22日采集峨眉双蝴蝶茎上饱满无病虫危害的紫红色果实，先用自来水洗净，后用饱和洗衣粉溶液漂洗5.8分钟，再用自来水流水冲洗22分钟，滤干水，放在干净组培瓶中带入无菌室，在超净工作台上用75%的乙醇浸52秒后，转入0.1%的升汞溶液中浸泡17分钟，其间不断地摇动，以便充分杀菌；

升汞溶液灭菌后，用无菌水反复冲洗，打开干燥的无菌滤纸本，夹于滤纸本中，打开滤纸本用无菌解剖刀和镊子，剥除紫红色外果皮，露出白色棒状的胎座，用刀轻轻将胎座纵向切开，露出芝麻大小紫黑色的种子，种子在胎座内纵向排列成4行，用刀沿种子排列的纵缝，将胎座连同种子切成4条，每条胎座都有一定数量的种子；用镊子将胎座放在萌发培养基上，盖上瓶盖，并用封口膜加强，25℃条件下，暗培养至种子萌发，萌发后每天给予1600LX光照，直至分化长出幼小真叶；   

（2）生根培养：当有幼小真叶分化出来时，将小苗连同胎座整块取出，放在打开的无菌滤纸本中，用镊子和小刀把小苗互相分开，接种于生根壮苗培养基上，盖上瓶盖，并用封口膜加强，23℃，每天1800LX光强照射12小时，培养至苗高4-5厘米并有4-5片真叶；

（3）炼苗移栽：先在荫蔽度72%的塑料大棚内闭瓶炼苗4.5天，再将瓶盖完全旋松，但不拿开，炼苗两天，再开瓶炼苗两天，然后将苗从瓶中取出，用水将根部培养基洗干净，栽于装有蛭石：红壤土：细河沙的塑料袋中，每袋栽一株，其中蛭石、红壤土和细河沙的比例为1:2:2，并事先用高锰酸钾水溶液处理；

栽好后用0.21%的花宝3号水溶液喷雾，洗净植株表面，并使基质下沉，紧密与根接触，基质含水量达到57%，再放在表面铺有粗砂的塑料大棚内，大棚内做43公分高的支架，上面覆盖农膜，使植株置于农膜的下面，覆盖农膜48小时内，膜内空气相对湿度控制在90%，温度26℃，过高时揭膜调温调湿，以后逐渐降低空气相对湿度，15天后降低到70%，此时去掉农膜继续炼苗25天，即可起苗定植。

本实施例中生根壮苗培养基的配方为花宝3号3g. L^-1+20%香蕉提取液+IBA0.2mg. L^-1+活性碳2g. L^-1+2%蔗糖+琼脂6g. L^-1；萌发培养基配方为1/2MS+20%香蕉提取液+6-BA2.0mg.L^-1+NAA0.2mg. L^-1+2%蔗糖+琼脂6g. L^-1。

实施例2：

（1）幼苗的获得和培养：1月16日采集峨眉双蝴蝶茎上饱满无病虫危害的紫红色果实，先用自来水洗净，后用饱和洗衣粉溶液漂洗5.2分钟，再用自来水流水冲洗27分钟，滤干水，放在干净组培瓶中带入无菌室，在超净工作台上用75%的乙醇浸59秒后，转入0.1%的升汞溶液中浸泡19分钟，其间不断地摇动，以便充分杀菌；

升汞溶液灭菌后，用无菌水反复冲洗，打开干燥的无菌滤纸本，夹于滤纸本中，打开滤纸本用无菌解剖刀和镊子，剥除紫红色外果皮，露出白色棒状的胎座，用刀轻轻将胎座纵向切开，露出芝麻大小紫黑色的种子，种子在胎座内纵向排列成4行，用刀沿种子排列的纵缝，将胎座连同种子切成4条，每条胎座都有一定数量的种子；用镊子将胎座放在萌发培养基上，盖上瓶盖，并用封口膜加强，27℃条件下，暗培养至种子萌发，萌发后每天给予2300LX光照，直至分化长出幼小真叶；    

（2）生根培养：当有幼小真叶分化出来时，将小苗连同胎座整块取出，放在打开的无菌滤纸本中，用镊子和小刀把小苗互相分开，接种于生根壮苗培养基上，盖上瓶盖，并用封口膜加强，26℃，每天2400LX光强照射17小时，培养至苗高4-5厘米并有4-5片真叶；

（3）炼苗移栽：先在荫蔽度79%的塑料大棚内闭瓶炼苗4.8天，再将瓶盖完全旋松，但不拿开，炼苗两天，再开瓶炼苗两天，然后将苗从瓶中取出，用水将根部培养基洗干净，栽于装有蛭石：红壤土：细河沙的塑料袋中，每袋栽一株，其中蛭石、红壤土和细河沙的比例为1:2:2，并事先用高锰酸钾水溶液处理；

栽好后用0.27%的花宝3号水溶液喷雾，洗净植株表面，并使基质下沉，紧密与根接触，基质含水量达到59%，再放在表面铺有粗砂的塑料大棚内，大棚内做48公分高的支架，上面覆盖农膜，使植株置于农膜的下面，覆盖农膜48小时内，膜内空气相对湿度控制在90%，温度28℃，过高时揭膜调温调湿，以后逐渐降低空气相对湿度，15天后降低到70%，此时去掉农膜继续炼苗34天，即可起苗定植。

Claims (3)

1.一种峨眉双蝴蝶的种子繁殖方法，其特征在于包含以下几个步骤：

（1）幼苗的获得和培养：每年12月至次年2月采集峨眉双蝴蝶茎上饱满无病虫危害的紫红色果实，先用自来水洗净，后用饱和洗衣粉溶液漂洗5-6分钟，再用自来水流水冲洗20-30分钟，滤干水，放在干净组培瓶中带入无菌室，在超净工作台上用75%的乙醇浸50-60秒后，转入0.1%的升汞溶液中浸泡16-20分钟，其间不断地摇动，以便充分杀菌；

升汞溶液灭菌后，用无菌水反复冲洗，打开干燥的无菌滤纸本，夹于滤纸本中，打开滤纸本用无菌解剖刀和镊子，剥除紫红色外果皮，露出白色棒状的胎座，用刀轻轻将胎座纵向切开，露出芝麻大小紫黑色的种子，种子在胎座内纵向排列成4行，用刀沿种子排列的纵缝，将胎座连同种子切成4条，每条胎座都有一定数量的种子；用镊子将胎座放在萌发培养基上，盖上瓶盖，并用封口膜加强，22-28℃条件下，暗培养至种子萌发，萌发后每天给予1500-2500LX光照，直至分化长出幼小真叶；    

（2）生根培养：当有幼小真叶分化出来时，将小苗连同胎座整块取出，放在打开的无菌滤纸本中，用镊子和小刀把小苗互相分开，接种于生根壮苗培养基上，盖上瓶盖，并用封口膜加强，22-28℃，每天1500-2500LX光强照射10-20小时，培养至苗高4-5厘米并有4-5片真叶；

（3）炼苗移栽：先在荫蔽度70-80%的塑料大棚内闭瓶炼苗4-5天，再将瓶盖完全旋松，但不拿开，炼苗两天，再开瓶炼苗两天，然后将苗从瓶中取出，用水将根部培养基洗干净，栽于装有蛭石：红壤土：细河沙的塑料袋中，每袋栽一株，其中蛭石、红壤土和细河沙的比例为1:2:2，并事先用高锰酸钾水溶液处理；

栽好后用0.2%-0.3%的花宝3号水溶液喷雾，洗净植株表面，并使基质下沉，紧密与根接触，基质含水量达到55-60%，再放在表面铺有粗砂的塑料大棚内，大棚内做40-50公分高的支架，上面覆盖农膜，使植株置于农膜的下面，覆盖农膜48小时内，膜内空气相对湿度控制在90%，温度25-30℃，过高时揭膜调温调湿，以后逐渐降低空气相对湿度，15天后降低到70%，此时去掉农膜继续炼苗20-40天，即可起苗定植。

2.根据权利要求1所述峨眉双蝴蝶种子繁殖方法所述的萌发培养基，其特征在于：萌发培养基配方为1/2MS+20%香蕉提取液+6-BA2.0mg.L^-1+NAA0.2mg. L^-1+2%蔗糖+琼脂6g. L^-1。

3.根据权利要求1所述峨眉双蝴蝶种子繁殖方法所述的生根壮苗培养基，其特征在于：生根壮苗培养基的配方为花宝3号3g. L^-1+20%香蕉提取液+IBA0.2mg. L^-1+活性碳2g. L^-1+2%蔗糖+琼脂6g. L^-1，花宝3号是指美国进口速效复合肥，氮、磷、钾三要素含量比例分别为10∶30∶20。