CN103709230A - 一种三肽类低共熔离子液体及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种三肽类低共熔离子液体及其制备方法与合成手性醇的应用，所述三肽类低共熔离子液体由氯化胆碱和三肽化合物混合制成，所述三肽化合物由3个天然氨基酸脱水缩合而成；本发明提供的三肽类低共熔离子液体具有毒性低、绿色环保等优点，符合绿色化学发展策略，制备方法简单，产品纯度高，将其应用于生物催化反应过程可有效集成氯化胆碱和三肽化合物的生物学特性和离子液体的优良性能；与水相转化相比，在反应体系中加入此类低共熔离子液体，可有效提高催化效率，尤其是加入氯化胆碱/谷胱甘肽后，可使反应的底物浓度由80mM提高到100mM，产率也相应地从53.4%提高到92.8%。
Description
（一）技术领域
本发明涉及一种短肽类离子液体及制备与应用，特别涉及一种氯化胆碱三肽类低共熔离子液体及其制备方法，以及利用含此类低共熔离子液体的反应体系以提高微生物催化不对称还原制备阿瑞吡坦药物重要手性中间体(R)-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇反应效率的方法。
(二）背景技术
1999年，Abbott教授首次提出了低共熔溶剂(Eutectic solvents)的概念。从结构上看，传统的离子液体是完全由离子组成的单一液体，而低共熔溶剂是由两种或多种成分组成的低共熔混合物，其中既含有阴、阳离子，又含有有机分子，由于它们在导电性，密度，溶解性等方面都具有典型的离子液体的性质，因而以低共熔离子液体描述这类溶剂的性质特点。
由于不同化学组成的离子液体可以表现出不同的化学特性，目前，已有关于新型低共熔溶剂制备方法的报道。中国专利CN101985435介绍了已内酰胺羧酸类低共熔溶剂的制备方法；中国专利CN101935849,CN103173788介绍了新型镁低共熔溶剂的合成方法及其应用；中国专利CN103193711介绍了一种三组分低共熔离子液体的合成方法。目前报道的低共熔溶剂主要应用于有机合成，纳米技术和化工分离等领域，很少有应用于生物催化领域的报道。
本申请人的在先申请中国专利200910155775.5（公开号CN101724568A）提供了一株新菌种棘孢木霉及其作为催化剂不对称还原制备(R)-3,5-双三氟甲基苯乙醇的方法，该方法在水相体系中进行，产率较低（53.4%）。为有效解决上述困难，本发明首先合成了氯化胆碱三肽类低共熔离子液体，并将其加入到生物催化反应体系中，通过低共熔离子液体的底物增溶作用，使得生物还原反应在保持较高产率和较短反应时间的前提下，提高了底物浓度。因此，合成新型低共熔离子液体不仅可以丰富离子液体种类，还可将其应用于生物催化过程中以提高反应效率，符合当前绿色化学的发展要求。
生物催化3,5-双三氟甲基苯乙酮制备(R)-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇反应式如下所示：
（三）发明内容
本发明所要解决的技术问题是公开一种氯化胆碱三肽类低共熔型离子液体及其制备方法，该方法制备工艺简单、原料易得，环境友好，而且在反应过程中不使用有机溶剂，没有有毒物质排放，无副产物；本发明尤其要提供一种将氯化胆碱三肽类低共熔型离子液体作为共溶剂应用于生物催化不对称还原制备(R)-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的方法。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种三肽类低共熔离子液体，所述三肽类低共熔离子液体以氯化胆碱为阳离子，以三肽化合物为阴离子，所述三肽化合物由3个天然氨基酸脱水缩合而成，结构式为[氯化胆碱]+[三肽]-。
进一步，所述天然氨基酸分别选自：苯丙氨酸(Phe)、丙氨酸(Ala)、半胱氨酸(Cys)、天冬氨酸(Asp)、色氨酸(Trp)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、缬氨酸(Val)、赖氨酸(Lys)、酪氨酸(Tyr)、精氨酸(Arg)或组氨酸(His)，任意3种氨基酸残基以任意顺序脱水缩合而成三肽化合物。
本发明优选的三肽化合物为下列之一（由下列天然氨基酸以下列顺序脱水缩合而成）：Glu-Cys-Gly、Arg-Lys-Asp、Ala-Val-Glu、Lys-His-Tyr或Lys-Lys-Glu。
本发明所用三肽化合物可以按照Merrifield发明的固相化学合成方法合成(Merrifield,R.B.,J.Am.Chem.Soc.1963,85,2149.)。以氯甲基聚苯乙烯树脂为肽合成的固相基质，依照本发明短肽的氨基酸序列从C端开始依次进行。随后对树脂上的合成肽在避光条件下，采用裂解液(三氟乙酸、苯甲醚、乙二硫醇)进行裂解，最后溶解在冰乙醚中，冷冻干燥后获得肽粗制品。肽粗制品用C18反向柱分离纯化，分离流动相为三氟乙酸、乙腈和水(乙腈：水：三氟乙酸=70:30:0.5，v/v)，经洗脱后获得三肽化合物纯品。
本发明还提供一种三肽类低共熔离子液体制备方法，所述方法为：将氯化胆碱与三肽化合物水溶液混合，室温搅拌12～30h，然后再在45℃～90℃条件下减压浓缩至原体积的1/3～1/4，以除去溶液中的大部分水，然后在70～120℃、-0.05～-0.09MPa条件下真空旋转蒸发48～72小时，获得所述三肽类低共熔离子液体；所述三肽化合物水溶液的用量以三肽化合物的物质的量计，所述氯化胆碱与三肽化合物的物质的量之比为1:1～3，所述三肽化合物水溶液质量浓度为9～45%。
进一步，优选所述三肽类低共熔离子液体为下列之一（氯化胆碱与三肽化合物的物质的量之比均为1:1～3）：[氯化胆碱]＋[Arg-Lys-Asp]-、[氯化胆碱]＋[Glu-Cys-Gly]-、[氯化胆碱]＋[Lys-Lys-Glu]-、[氯化胆碱]＋[Ala-Val-Glu]-或[氯化胆碱]＋[Lys-His-Tyr]-。
本发明还提供一种三肽类低共熔离子液体制备(R)-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的方法，所述方法为：以棘孢木霉ZJPH0810发酵培养获得的湿菌丝体（制备参见CN101724568A，具体参见实施例1）作为催化剂，以3,5-双三氟甲基苯乙酮作为底物，在三肽类低共熔离子液体与pH为5.5～8.0的缓冲液或pH为6.0的蒸馏水构成的反应体系中，于25～45℃、100～300r/min条件下反应6～50小时，反应液用等体积的正己烷萃取，取萃取层获得含有(R)-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的产物；所述反应体系中湿菌丝体的加入量以菌丝体干重计为10～50g/L，所述反应体系中底物初始浓度为50～300mM，所述反应体系中三肽类低共熔离子液体质量终浓度为0.1～30%。
进一步，所述三肽类低共熔离子液体构成的反应体系中还添加有辅助底物，所述辅助底物为下列一种或两种及以上任意比例的混合：①甲醇、②乙醇、③异丙醇、④甘油、⑤葡萄糖、⑥果糖、⑦鼠李糖或⑧麦芽糖，所述反应体系中辅助底物质量终浓度为0.1～20%；更优选所述辅助底物为反应体系中体积终浓度6%无水乙醇和体积终浓度6%异丙醇的混合液。
进一步，所述反应于30℃、200r/min条件下反应24小时。
进一步，本发明所述pH为5.5～8.0的缓冲液为Na2HPO4-柠檬酸缓冲液、Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液、K2HPO4-KH2PO4缓冲液、Na2HPO4-KH2PO4缓冲液或K2HPO4-NaOH缓冲液。
本发明所述三肽类低共熔离子液体制备(R)-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的方法推荐按如下步骤进行：以棘孢木霉ZJPH0810发酵培养获得的湿菌丝体（制备参见CN101724568A，具体参见实施例1）作为催化剂，以3,5-双三氟甲基苯乙酮作为底物，添加辅助底物，在三肽类低共熔离子液体与pH为5.5～8.0的缓冲液或pH为6.0的蒸馏水（优选pH为6.0的蒸馏水）构成的反应体系中，于30℃、200r/min条件下反应24小时，反应液用等体积的正己烷萃取，取萃取层获得含有(R)-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的产物；所述反应体系中湿菌丝体的加入量以菌丝体干重计为30g/L，所述反应体系中底物初始浓度为70～120mM，所述反应体系中三肽类低共熔离子液体质量终浓度为2.5～15%，所述辅助底物为反应体系中体积终浓度6%无水乙醇和体积终浓度6%异丙醇的混合液。
生物转化反应结束后，反应液用等体积的正己烷萃取，取正己烷层液体，经旋转蒸发器蒸馏浓缩5倍体积，然后加入柱体积1～5%的硅胶混匀后，转移至含有硅胶的层析柱中，表面再添加柱体积1～5%的硅胶，然后以石油醚︰乙酸乙酯=8︰1（v/v）为洗脱剂进行洗脱分离，收集合并含有目标产物的洗脱液，将含有目标产物的洗脱液经旋转蒸发器蒸干，即得(R)-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇纯品。(R)-[3,5-双(三氟甲基基)苯基]乙醇1H NMR(600MHz,CDCl3):7.85(s,2H),7.79(s,1H),5.06-5.03(q,1H,J=6.48Hz),1.54(d,3H,J=6.48Hz)。
萃取液中的产物和未反应底物的浓度采用气相色谱分析，用内标法定量。内标物为十二烷。取1ml萃取液加入2μl十二烷进行分析。气相色谱的操作条件为：进样器温度250℃，检测器温度250℃，柱温80℃保留2min，以4℃/min升温至180℃，维持10min，载气为氮气，流量为1.5ml/min，分流比为1:20，进样量为1μl。根据气相色谱检测谱图，用相对校正因子法计算出反应液中产物的浓度和ee值。
产率计算方法为：
内标法：以十二烷为内标物，测得产物浓度标准曲线。测定时在样品中加入一定量的十二烷为内标物，根据内标物浓度计算得出产物浓度。
标准曲线制备方法：准确称取一系列不同浓度的底物或产物标准品，溶于正己烷，配制成一系列混合溶液，分别用气相色谱检测。将所得色谱图积分得到峰面积，以底物或产物与正十二烷的峰面积比(S底物/S十二烷或S产物/S十二烷)为横坐标，浓度比(C底物/C十二烷或C产物/C十二烷)为纵坐标，作出标准曲线，从而得到3，5-双三氟甲基苯乙酮与内标物的相对校正因子为1.31，3,5-双三氟甲基苯乙醇与内标物的相对校正因子为1.69。
产率计算公式如下：
式（1）中Cp为(R)-3,5-双三氟甲基苯乙醇浓度，C0为3,5-双三氟甲基苯乙酮初始浓度。
产物的光学纯度由对映体过量值(enantiomeric excess,ee)来表征。计算公式为：
式（2）中CR和CS分别为R型和S型3,5-双三氟甲基苯乙醇的摩尔浓度。
本发明与现有技术相比，有如下优点：
本发明提供的三肽类低共熔离子液体制备方法简单，产品纯度高，将其应用于生物催化反应过程可有效集成氯化胆碱和三肽化合物的生物学特性和离子液体的优良性能。此三肽类低共熔离子液体具有毒性低、绿色环保等优点，符合绿色化学发展策略，同时也克服了传统离子液体存在的环境不友好等缺陷。与水相转化相比，在反应体系中加入此类低共熔离子液体，可有效提高催化效率，尤其是加入[氯化胆碱]＋[谷胱甘肽]-后，可使反应的底物浓度由80mM（水相转化，参见CN101724568A，具体参见实施例5）提高到100mM（含三肽类低共熔离子液体体系，具体参见本发明实施例54），产率也相应地从53.4%（水相转化，参见CN101724568A，具体参见实施例5）提高到92.8%（含三肽类低共熔离子液体体系，具体参见本发明实施例54）。
(四)附图说明
图1为3,5-双三氟甲基苯乙酮底物和[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇产物的标准品气相检测图谱。
图2为棘孢木霉生物还原反应萃取液气相色谱图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1三肽Glu-Cys-Gly的合成
三肽的合成采用固相化学合成方法，以氯甲基聚苯乙烯树脂作为不溶性的固相载体，首先将Glu的一个氨基被封闭基团（环烷醇酯）保护并共价连接在固相载体上。在TMSOTF(三氟甲磺酸三甲硅烷酯)的作用下，脱掉氨基的保护基，这样第一个氨基酸就接到了固相载体上。然后第二个氨基酸Cys的氨基被三苯甲基保护，Cys的羧基通过N,Nˊ-二环己基碳二亚胺（DCC）活化后，与已连在固相载体的第一个氨基酸的氨基反应形成肽键，这样在固相载体上就生成了一个带有保护基的二肽，在TFA(三氟乙酸)的作用下，脱掉氨基的保护基，这样二肽就接到了固相载体上。然后第三个氨基酸Gly的氨基被三苯甲基保护，Gly的羧基通过DCC活化后，与已接在固相载体的第二个氨基酸的氨基反应形成肽键，这样在固相载体上就生成了一个带有保护基的三肽，在TFA(三氟乙酸)的作用下，脱掉氨基的保护基，这样三肽就接到了固相载体上。随后对树脂上的合成肽在避光条件下，采用裂解液(三氟乙酸、苯甲醚、乙二硫醇)进行裂解，最后溶解在冰乙醚中，冷冻干燥后获得肽粗制品。肽粗制品用C18反向柱分离纯化，分离流动相为三氟乙酸、乙腈和水(乙腈：水：三氟乙酸=70:30:0.5，v/v)，经洗脱后获得三肽Glu-Cys-Gly纯品。
实施例2三肽的合成
三肽的合成采用固相化学合成方法，其具体步骤参照实施例1，氨基酸序列从C端开始依次进行。
分别按下列氨基酸序列合成三肽化合物：Arg-Lys-Asp，Ala-Val-Glu，Lys-His-Tyr，Lys-Lys-Glu。
特别的，精氨酸(Arg)侧链用金刚烷氧羰基（Adoc）保护，用冷三氟乙酸脱去；组氨酸(His)的咪唑环用2,2,2-三氟-1-苄氧羰基保护，用冷三氟乙酸脱去；天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)侧链羧基用金刚烷醇酯保护，用三氟甲磺酸三甲硅烷酯除去；酪氨酸(Tyr)的酚羟基通常用叔丁基保护，用冷三氟乙酸脱去；赖氨酸(Lys)的氨基用酰基保护，待三肽链合成后用冷三氟乙酸脱去除去；丙氨酸(Ala)和缬氨酸(Val)用叔丁氧羰基（BOC）保护，用冷三氟乙酸和氢氟酸脱去。
实施例3[氯化胆碱]＋[谷胱甘肽]-（氯化胆碱与谷胱甘肽摩尔比为1:1）的合成
实验装置为带有机械搅拌的三口烧瓶。
将实施例1方法合成的谷胱甘肽化合物9.21g(0.03mol)溶于100ml蒸馏水中，再加入4.19g氯化胆碱(0.03mol)，室温搅拌24小时，然后于60℃下旋蒸浓缩至原体积的约1/3，以除去溶液中的大部分水，再升温至70℃，在-0.09MPa条件下真空旋转蒸发48小时，得到氯化胆碱与谷胱甘肽摩尔比为1:1的[氯化胆碱]＋[谷胱甘肽]-低共熔离子液体。制备得到的离子液体1HNMR(400M.D2O，DMSO):δ=4.45(t,1H),3.96-3.91(m,2H),3.86(s,2H),3.72(t,1H),3.40(t,2H),3.08(s,9H),2.83(t,2H),2.45(q,2H),2.06(q,2H)。13CNMR(100M,D2O,DMSO-d6):δ=174.1,174.0,173.1,68.7,56.8(2C),55.2(3C),53.9,42.9,40.3,32.7,27.4。
实施例4[氯化胆碱]＋[谷胱甘肽]-（氯化胆碱与谷胱甘肽摩尔比为1:2）的合成
实验装置为带有机械搅拌的三口烧瓶。
将实施例1方法制备的谷胱甘肽18.42g（0.06mol)溶于100ml蒸馏水中，再加入4.19g氯化胆碱(0.03mol)，其他操作同实施例3，得到氯化胆碱与谷胱甘肽摩尔比为1:2的[氯化胆碱]＋[谷胱甘肽]-低共熔离子液体。
实施例5[氯化胆碱]＋[谷胱甘肽]-（氯化胆碱与谷胱甘肽摩尔比为1:3）的合成
实验装置为带有机械搅拌的三口烧瓶。
将实施例1方法制备的谷胱甘肽27.63g(0.09mol)溶于100ml蒸馏水中，再加入4.19g氯化胆碱(0.03mol)，其他操作同实施例3，得到氯化胆碱与谷胱甘肽摩尔比为1:3的[氯化胆碱]＋[谷胱甘肽]-低共熔离子液体。
实施例6[氯化胆碱]＋[Arg-Lys-Asp]-（氯化胆碱与三肽Arg-Lys-Asp摩尔比为1:1）的合成
实验装置为带有机械搅拌的三口烧瓶。
将实施例2方法制备的三肽(Arg-Lys-Asp)12.5g(0.03mol)溶于100ml蒸馏水中，再加入4.19g氯化胆碱(0.03mol)，室温搅拌24小时，再于60℃下旋蒸浓缩至原体积的约1/3，以除去溶液中的大部分水。然后升温至70℃，在-0.09MPa条件下继续真空旋转蒸发48小时，得到氯化胆碱与三肽(Arg-Lys-Asp)摩尔比为1:1的[氯化胆碱]＋[Arg-Lys-Asp]-低共熔离子液体。制备得到的离子液体1HNMR(400M.D2O，DMSO):δ=4.46(t,1H),3.87(s,2H),3.75(t,1H),3.42(t,2H),3.03(s,9H),2.83(t,2H),2.40(q,2H),1.78(q,4H),1.55(m,4H)。
实施例7[氯化胆碱]＋[Arg-Lys-Asp]-（氯化胆碱与三肽Arg-Lys-Asp摩尔比为1:2）的合成
实验装置为带有机械搅拌的三口烧瓶。
将实施例2方法制备的三肽(Arg-Lys-Asp)25.0g(0.06mol)溶于100ml蒸馏水中，再加入4.19g氯化胆碱(0.03mol)，其他操作同实施例6，得到氯化胆碱与三肽(Arg-Lys-Asp)摩尔比为1:2的[氯化胆碱]＋[Arg-Lys-Asp]-低共熔离子液体。
实施例8[氯化胆碱]＋[Arg-Lys-Asp]-（氯化胆碱与三肽Arg-Lys-Asp摩尔比为1:3）的合成
实验装置为带有机械搅拌的三口烧瓶。
将实施例2方法制备的三肽(Arg-Lys-Asp)37.5g(0.09mol)溶于100ml蒸馏水中，再加入4.19g氯化胆碱(0.03mol)，其他操作同实施例6，得到氯化胆碱与三肽(Arg-Lys-Asp)摩尔比为1:3的[氯化胆碱]＋[Arg-Lys-Asp]-低共熔离子液体。
实施例9[氯化胆碱]＋[Ala-Val-Glu]-的合成（氯化胆碱与三肽Ala-Val-Glu摩尔比为1:1）
实验装置为带有机械搅拌的三口烧瓶。
将三肽(Ala-Val-Glu)10.6g(0.03mol)溶于100ml蒸馏水中，再加入4.19g氯化胆碱(0.03mol)，室温搅拌24小时，再于60℃旋蒸浓缩至原体积的约1/3，以除去溶液中的大部分水。然后升温至70℃，在-0.09MPa条件下继续真空旋转蒸发48小时，得到氯化胆碱与三肽(Ala-Val-Glu)摩尔比为1:1的[氯化胆碱]＋[Ala-Val-Glu]-低共熔离子液体。制备得到的离子液体1HNMR(400M.D2O，DMSO):δ=4.52(t,4H),3.86(s,2H),3.08(s,9H),2.68(t,2H),2.43(q,2H),2.23(t,2H),2.05(q,2H),1.43(s,3H),1.01(m,6H)。
实施例10[氯化胆碱]＋[Ala-Val-Glu]-（氯化胆碱与三肽Ala-Val-Glu摩尔比为1:2）的合成
实验装置为带有机械搅拌的三口烧瓶。
将实施例2方法制备的三肽(Ala-Val-Glu)21.2g(0.06mol)溶于100ml蒸馏水中，再加入4.19g氯化胆碱(0.03mol)，其他操作同实施例9，得到氯化胆碱与三肽(Ala-Val-Glu)摩尔比为1:2的[氯化胆碱]＋[Ala-Val-Glu]-低共熔离子液体。
实施例11[氯化胆碱]＋[Ala-Val-Glu]-（氯化胆碱与三肽Arg-Lys-Asp摩尔比为1:3）的合成
实验装置为带有机械搅拌的三口烧瓶。
将实施例2方法制备的三肽(Ala-Val-Glu)37.5g(0.09mol)溶于100ml蒸馏水中，再加入4.19g氯化胆碱(0.03mol)，其他操作同实施例9，得到氯化胆碱与三肽(Ala-Val-Glu)摩尔比为1:3的[氯化胆碱]＋[Ala-Val-Glu]-低共熔离子液体。
实施例12[氯化胆碱]＋[Lys-His-Tyr]-的合成（氯化胆碱与三肽Lys-His-Tyr摩尔比为1:1）
实验装置为带有机械搅拌的三口烧瓶。
将实施例2方法制备的三肽(Lys-His-Tyr)14.4g(0.03mol)溶于100ml蒸馏水中，再加入4.19g氯化胆碱(0.03mol)，室温搅拌24小时，再于60℃旋蒸浓缩至原体积的约1/3，以除去溶液中的大部分水。然后升温至70℃，在-0.09MPa条件下继续真空旋转蒸发48小时，得到氯化胆碱与三肽(Lys-His-Tyr)摩尔比为1:1的[氯化胆碱]＋[Lys-His-Tyr]-低共熔离子液体。制备得到的离子液体1HNMR(400M.D2O，DMSO):δ=6.91(s,2H),6.86(d,2H),4.46(t,1H),3.85(s,9H),3.04(t,6H),2.43(q,2H),1.55(t,4H),1.29(q,2H)。
实施例13[氯化胆碱]＋[Lys-His-Tyr]-的合成（氯化胆碱与三肽Lys-His-Tyr摩尔比为1:2）
实验装置为带有机械搅拌的三口烧瓶。
将实施例2方法制备的三肽(Lys-His-Tyr)28.8g(0.06mol)溶于100ml蒸馏水中，再加入4.19g氯化胆碱(0.03mol)，其他操作同实施例12，得到氯化胆碱与三肽(Lys-His-Tyr)摩尔比为1:2的[氯化胆碱]＋[Lys-His-Tyr]-低共熔离子液体。
实施例14[氯化胆碱]＋[Lys-His-Tyr]-的合成（氯化胆碱与三肽Lys-His-Tyr摩尔比为1:3）
实验装置为带有机械搅拌的三口烧瓶。
将实施例2方法制备的三肽(Lys-His-Tyr)43.2g(0.09mol)溶于100ml蒸馏水中，再加入4.19g氯化胆碱(0.03mol)，其他操作同实施例12，得到氯化胆碱与三肽(Lys-His-Tyr)摩尔比为1:3的[氯化胆碱]＋[Lys-His-Tyr]-低共熔离子液体。
实施例15[氯化胆碱]＋[Lys-Lys-Glu]-的合成（氯化胆碱与三肽Lys-Lys-Glu摩尔比为1:1）
实验装置为带有机械搅拌的三口烧瓶。
将实施例2方法制备的三肽(Lys-Lys-Glu)13.2g(0.03mol)溶于100ml蒸馏水中，再加入4.19g氯化胆碱(0.03mol)，室温搅拌24小时，再于60℃旋蒸浓缩至原体积的约1/3，以除去溶液中的大部分水。然后升温至70℃，在-0.09MPa条件下继续真空旋转蒸发48小时，得到氯化胆碱与三肽(Lys-Lys-Glu)摩尔比为1:1的[氯化胆碱]＋[Lys-Lys-Glu]-低共熔离子液体。制备得到的离子液体1HNMR(400M.D2O，DMSO):δ=3.84(s,2H),3.49(t,3H),3.20(t,2H),3.08(s,9H),2.65(t,2H),2.45(t,2H),2.23(q,2H),2.08(t,2H),1.62(q,8H),1.32(t,2H)。
实施例16[氯化胆碱]＋[Lys-Lys-Glu]-的合成（氯化胆碱与三肽Lys-Lys-Glu摩尔比为1:2）
实验装置为带有机械搅拌的三口烧瓶。
将实施例2方法制备的三肽(Lys-Lys-Glu)26.4g(0.06mol)溶于100ml蒸馏水中，再加入4.19g氯化胆碱(0.03mol)，其他操作同实施例15，得到氯化胆碱与三肽(Lys-Lys-Glu)摩尔比为1:2的[氯化胆碱]＋[Lys-Lys-Glu]-低共熔离子液体。
实施例17[氯化胆碱]＋[Lys-Lys-Glu]-的合成（氯化胆碱与三肽Lys-Lys-Glu摩尔比为1:3）
实验装置为带有机械搅拌的三口烧瓶。
将实施例2方法制备的三肽(Lys-Lys-Glu)39.6g(0.09mol)溶于100ml蒸馏水中，再加入4.19g氯化胆碱(0.03mol)，其他操作同实施例15，得到氯化胆碱与三肽(Lys-Lys-Glu)摩尔比为1:3的[氯化胆碱]＋[Lys-Lys-Glu]-低共熔离子液体。
实施例18～20
将发酵所得湿菌丝体（湿菌丝体的制备参见CN101724568A，具体参见实施例1）悬浮于20ml蒸馏水（pH值为6.0）中，湿菌丝体以干重计浓度为30g/L反应体系（反应体系总体积20ml），分别加入实施例3～5制备的终浓度5wt%[氯化胆碱]＋[谷胱甘肽]-，初始终浓度70mM的3,5-双三氟甲基苯乙酮作为底物，无水乙醇(终浓度6%，v/v)和异丙醇(终浓度6%，v/v)为辅助底物，置于30℃，200r/min摇床中反应24h。反应结束后，反应液用等体积的正己烷萃取，取正己烷层进行气相色谱分析，所得产物(R)-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的浓度和ee值见表1。萃取液中的产物和未反应底物的浓度采用气相色谱分析，用内标法定量。内标物为十二烷。取1ml萃取液加入2μl十二烷进行分析。气相色谱的操作条件为：进样器温度250℃，检测器温度250℃，柱温80℃保留2min，以4℃/min升温至180℃，维持10min，载气为氮气，流量为1.5ml/min，分流比为1:20，进样量为1μl。根据气相色谱检测谱图，用相对校正因子法计算出反应液中产物的浓度和ee值。
产率计算方法为：
内标法：以十二烷为内标物，测得产物浓度标准曲线。测定时在样品中加入一定量的十二烷为内标物，根据内标物浓度计算得出产物浓度。
标准曲线制备方法：准确称取一系列不同浓度的底物或产物标准品，溶于正己烷，配制成一系列混合溶液，分别用气相色谱检测。将所得色谱图积分得到峰面积，以底物或产物与正十二烷的峰面积比(S底物/S十二烷或S产物/S十二烷)为横坐标，浓度比(C底物/C十二烷或C产物/C十二烷)为纵坐标，作出标准曲线，从而得到3，5-双三氟甲基苯乙酮与内标物的相对校正因子为1.31，3,5-双三氟甲基苯乙醇与内标物的相对校正因子为1.69。
产率计算公式如下：
式（1）中Cp为(R)-3,5-双三氟甲基苯乙醇浓度，C0为3,5-双三氟甲基苯乙酮初始浓度。
产物的光学纯度由对映体过量值(enantiomeric excess,ee)来表征。计算公式为：
式（2）中CR和CS分别为R型和S型3,5-双三氟甲基苯乙醇的摩尔浓度。
表1产物浓度和ee值
| 实施例 | 氯化胆碱：谷胱甘肽（摩尔比） | 产物浓度(mM) | ee值(%) |
| 18 | 1:1 | 55.5 | >98 |
| 19 | 1:2 | 62.8 | >98 |
| 20 | 1:3 | 43.2 | >98 |
实施例21～23
将发酵所得湿菌丝体（湿菌丝体的制备参见CN101724568A，具体参见实施例1）悬浮于20ml蒸馏水（pH值为6.0）中，湿菌丝体以干重计浓度为30g/L反应体系（反应体系总体积20ml），分别加入实施例6～8制备的终浓度5wt%[氯化胆碱]＋[Arg-Lys-Asp]-，终浓度70mM的3,5-双三氟甲基苯乙酮作为底物，无水乙醇(终浓度6%，v/v)和异丙醇(终浓度6%，v/v)为辅助底物，置于30℃，200r/min摇床中反应24h。反应结束后，反应液用等体积的正己烷萃取，取正己烷层进行气相色谱分析，所得产物(R)-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的浓度和ee值见表2所示。
表2产物浓度和ee值
| 实施例 | 氯化胆碱：Arg-Lys-Asp（摩尔比） | 产物浓度(mM) | ee值(%) |
| 21 | 1:1 | 60.8 | >98 |
| 22 | 1:2 | 55.7 | >98 |
| 23 | 1:3 | 38.6 | >98 |
实施例24～26
将发酵所得湿菌丝体（湿菌丝体的制备参见CN101724568A，具体参见实施例1）悬浮于20ml蒸馏水（pH值为6.0）中，湿菌丝体以干重计浓度为30g/L反应体系（反应体系总体积20ml），分别加入实施例9～11制备的终浓度5wt%[氯化胆碱][Ala-Val-Glu]，初始终浓度70mM的3,5-双三氟甲基苯乙酮作为底物，无水乙醇(终浓度6%，v/v)和异丙醇(终浓度6%，v/v)为辅助底物，置于30℃，200r/min摇床中反应24h。反应结束后，反应液用等体积的正己烷萃取，取正己烷层进行气相色谱分析，所得产物(R)-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的浓度和ee值见表3。
表3产物浓度和ee值
| 实施例 | 氯化胆碱：Ala-Val-Glu（摩尔比） | 产物浓度(mM) | ee值(%) |
| 24 | 1:1 | 54.7 | >98 |
| 25 | 1:2 | 61.1 | >98 |
| 26 | 1:3 | 57.6 | >98 |
实施例27～29
将发酵所得湿菌丝体（湿菌丝体的制备参见CN101724568A，具体参见实施例1）悬浮于20ml蒸馏水（pH值为6.0）中，湿菌丝体以干重计浓度为30g/L反应体系（反应体系总体积20ml），分别加入实施例12～14制备的终浓度5wt%[氯化胆碱]＋[Lys-His-Tyr]-，初始终浓度70mM的3,5-双三氟甲基苯乙酮作为底物，无水乙醇(终浓度6%，v/v)和异丙醇(终浓度6%，v/v)为辅助底物，置于30℃，200r/min摇床中反应24h。反应结束后，反应液用等体积的正己烷萃取，取正己烷层进行气相色谱分析，所得产物(R)-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的浓度和ee值见表4。
表4产物浓度和ee值
| 实施例 | 氯化胆碱：Lys-His-Tyr（摩尔比） | 产物浓度(mM) | ee值(%) |
| 27 | 1:1 | 59.3 | >98 |
| 28 | 1:2 | 60.4 | >98 |
| 29 | 1:3 | 56.9 | >98 |
实施例30～32
将发酵所得湿菌丝体（湿菌丝体的制备参见CN101724568A，具体参见实施例1）悬浮于20ml蒸馏水（pH值为6.0）中，湿菌丝体以干重计浓度为30g/L反应体系（反应体系总体积20ml），分别加入实施例15～17制备的终浓度5wt%[氯化胆碱]＋[Lys-Lys-Glu]-，初始终浓度70mM的3,5-双三氟甲基苯乙酮作为底物，无水乙醇(终浓度6%，v/v)和异丙醇(终浓度6%，v/v)为辅助底物，置于30℃，200r/min摇床中反应24h。反应结束后，反应液用等体积的正己烷萃取，取正己烷层进行气相色谱分析，所得产物(R)-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的浓度和ee值见表5。
表5产物浓度和ee值
| 实施例 | 氯化胆碱：Lys-Lys-Glu（摩尔比） | 产物浓度(mM) | ee值(%) |
| 30 | 1:1 | 56.8 | >98 |
| 31 | 1:2 | 59.9 | >98 |
| 32 | 1:3 | 60.7 | >98 |
实施例33～38
将发酵所得湿菌丝体（湿菌丝体的制备参见CN101724568A，具体参见实施例1）悬浮于20ml不同反应体系（反应体系总体积20ml）中，湿菌丝体以干重计浓度为30g/L反应体系，加入实施例4制备的终浓度5wt%的[氯化胆碱]＋[谷胱甘肽]-(氯化胆碱与谷胱甘肽的摩尔比为1:2)，初始终浓度70mM的3,5-双三氟甲基苯乙酮作为底物，无水乙醇(终浓度6%，v/v)为辅助底物，置于30℃，200r/min摇床中反应24h。反应结束后，反应液用等体积的正己烷萃取，取正己烷层进行气相色谱分析，所得产物(R)-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的浓度和ee值见表6。由表6可知，当以pH为6.0的蒸馏水作为反应介质时，(R)-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的浓度最高，达到62.7mM，产率为89.6%。
表6产物浓度和ee值
实施例38～47
将发酵所得湿菌丝体（湿菌丝体的制备参见CN101724568A，具体参见实施例1）悬浮于20ml蒸馏水（pH值为6.0）中，湿菌丝体以干重计浓度为30g/L反应体系，加入实施例4制备的终浓度5wt%的[氯化胆碱]＋[谷胱甘肽]-(氯化胆碱与谷胱甘肽的摩尔比为1:2)，初始终浓度70mM的3,5-双三氟甲基苯乙酮作为底物，加入不同种类的醇或者糖作为辅助底物(以不加辅助底物为空白对照)，置于30℃，200r/min摇床中反应24h。反应结束后，反应液用等体积的正己烷萃取，取正己烷层进行气相色谱分析，所得产物(R)-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的浓度和ee值见表7。由表7可知，当不加辅助底物时，(R)-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的浓度仅为8.6mM，产率为12.2%；当以无水乙醇(终浓度6%，v/v)和异丙醇(终浓度6%，v/v)为双辅助底物时，(R)-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的浓度最高，达到62.8mM，产率为89.7%。
表7产物浓度和ee值
实施例48～51
将发酵所得湿菌丝体（湿菌丝体的制备参见CN101724568A，具体参见实施例1）悬浮于20ml蒸馏水（pH值为6.0）中，湿菌丝体以干重计浓度为30g/L反应体系，加入实施例4制备的终浓度不同的[氯化胆碱]＋[谷胱甘肽]-(氯化胆碱与谷胱甘肽的摩尔比为1:2)，初始终浓度70mM的3,5-双三氟甲基苯乙酮作为底物，无水乙醇(终浓度6%，v/v)和异丙醇(终浓度6%，v/v)为辅助底物，置于30℃，200r/min摇床中反应24h。反应结束后，反应液用等体积的正己烷萃取，取正己烷层进行气相色谱分析，所得产物(R)-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的浓度和ee值见表8。由表8可知，当[氯化胆碱]＋[谷胱甘肽]-(氯化胆碱与谷胱甘肽的摩尔比为1:2)的质量浓度为10%时，(R)-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的浓度最高，达到64.5mM，产率为92.1%。
表8产物浓度和ee值
| 实施例 | [氯化胆碱][谷胱甘肽]含量（wt,%） | 产物浓度(mM) | ee值(%) |
| 48 | 2.5 | 57.7 | >98 |
| 49 | 5 | 62.8 | >98 |
| 50 | 10 | 64.5 | >98 |
| 51 | 15 | 43.2 | >98 |
实施例52～55
将发酵所得湿菌丝体（湿菌丝体的制备参见CN101724568A，具体参见实施例1）悬浮于20ml蒸馏水中，湿菌丝体以干重计浓度为30g/L反应体系，加入实施例4制备的终浓度10wt%的[氯化胆碱]＋[谷胱甘肽]-(氯化胆碱与谷胱甘肽的摩尔比为1:2)，初始终浓度不同的3,5-双三氟甲基苯乙酮作为底物，无水乙醇(终浓度6%，v/v)和异丙醇(终浓度6%，v/v)为辅助底物，置于30℃，200r/min摇床中反应24h。反应结束后，反应液用等体积的正己烷萃取，取正己烷层进行气相色谱分析，所得产物(R)-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的浓度和ee值见表9。由表9可知，当底物浓度为100mM时，(R)-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的浓度最高，达到92.8mM，产率为92.8%。
表9产物浓度和ee值
| 实施例 | 底物浓度(Mm) | 产物浓度(mM) | ee值(%) |
| 52 | 70 | 64.5 | >98 |
| 53 | 80 | 72.4 | >98 |
| 54 | 100 | 92.8 | >98 |
| 55 | 120 | 83.6 | >98 |
Claims (10)
1.一种三肽类低共熔离子液体，其特征在于：所述三肽类低共熔离子液体以氯化胆碱为阳离子，以三肽化合物为阴离子，所述三肽化合物由3个天然氨基酸脱水缩合而成。
2.如权利要求1所述三肽类低共熔离子液体，其特征在于所述天然氨基酸分别选自：苯丙氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、色氨酸、谷氨酸、甘氨酸、缬氨酸、赖氨酸、酪氨酸、精氨酸或组氨酸。
3.如权利要求1所述三肽类低共熔离子液体，其特征在于所述三肽化合物为下列之一：Glu-Cys-Gly、Arg-Lys-Asp、Ala-Val-Glu、Lys-His-Tyr或Lys-Lys-Glu。
4.一种制备权利要求1所述三肽类低共熔离子液体的方法，其特征在于所述方法为：将氯化胆碱与三肽化合物水溶液混合，室温搅拌12～30h，然后再在45℃～90℃条件下减压浓缩至原体积的1/3～1/4，取浓缩物在70～120℃、-0.05～-0.09MPa条件下真空旋转蒸发48～72小时，获得所述三肽类低共熔离子液体；所述三肽化合物水溶液的用量以三肽化合物的物质的量计，所述氯化胆碱与三肽化合物的物质的量之比为1:1～3。
5.如权利要求4所述三肽类低共熔离子液体的制备方法，其特征在于所述三肽化合物水溶液质量浓度为9～45%。
6.一种利用权利要求1所述三肽类低共熔离子液体制备(R)-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的方法，其特征在于所述方法为：以棘孢木霉ZJPH0810发酵培养获得的湿菌丝体作为催化剂，以3,5-双三氟甲基苯乙酮作为底物，在三肽类低共熔离子液体与pH为5.5～8.0的缓冲液或pH为6.0的蒸馏水构成的反应体系中，于25～45℃、100～300r/min条件下反应6～50小时，反应液用等体积的正己烷萃取，取萃取层获得含有(R)-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的产物；所述反应体系中湿菌丝体的加入量以菌丝体干重计为10～50g/L，所述反应体系中底物初始浓度为50～300mM，所述反应体系中三肽类低共熔离子液体质量终浓度为0.1～30%。
7.如权利要求6所述利用三肽类低共熔离子液体制备(R)-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的方法，其特征在于所述三肽类低共熔离子液体构成的反应体系中还添加有辅助底物，所述辅助底物为下列一种或两种及以上任意比例的混合：①甲醇、②乙醇、③异丙醇、④甘油、⑤葡萄糖、⑥果糖、⑦鼠李糖或⑧麦芽糖，所述反应体系中辅助底物质量终浓度为0.1～20%。
8.如权利要求7所述利用三肽类低共熔离子液体制备(R)-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的方法，其特征在于所述辅助底物为无水乙醇和异丙醇的混合液，所述反应体系中无水乙醇体积终浓度6%，异丙醇体积终浓度6%。
9.如权利要求7所述利用三肽类低共熔离子液体制备(R)-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的方法，其特征在于所述反应于30℃、200r/min条件下反应24小时。
10.如权利要求6所述利用三肽类低共熔离子液体制备(R)-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的方法，其特征在于所述方法按如下步骤进行：以棘孢木霉ZJPH0810发酵培养获得的湿菌丝体作为催化剂，以3,5-双三氟甲基苯乙酮作为底物，添加辅助底物，在三肽类低共熔离子液体与pH为6.0的蒸馏水构成的反应体系中，于30℃、200r/min条件下反应24小时，反应液用等体积的正己烷萃取，取萃取层获得含有(R)-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的产物；所述反应体系中湿菌丝体的加入量以菌丝体干重计为30g/L，所述反应体系中底物初始浓度为70～120mM，所述反应体系中三肽类低共熔离子液体质量终浓度为2.5～15%，所述辅助底物为反应体系中体积终浓度6%无水乙醇和体积终浓度6%异丙醇的混合液。
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