CN103705464B - 一种微酸环境控制开启的肿瘤主动靶向纳米给药系统及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属生物技术领域，涉及一种微酸环境控制开启的肿瘤主动靶向纳米给药系统及其制备方法。本发明采用屏蔽分子以pH敏感键连接靶向多肽修饰表面富氨基的树状高分子材料包封基因自组装制成微酸环境控制开启的肿瘤主动靶向纳米给药系统。本发明所述纳米给药系统由于系统中屏蔽分子的改装作用，完善了主动靶向纳米给药系统，其靶向和治疗效率高、制备简捷，可用于制备靶向人体来源或动物来源的肿瘤细胞药物。
Description
技术领域
本发明属生物技术领域，涉及药物递送系统，具体涉及一种微酸环境控制开启的肿瘤主动靶向纳米给药系统及其制备方法。
背景技术
近年来，肿瘤靶向给药系统成为在抗肿瘤药物递送领域的研究热点。靶向给药系统的构建主要有两种策略：被动靶向和主动靶向；所述被动靶向主要是基于肿瘤组织对大分子特有的EPR效应，而主动靶向则是利用可以特异性结合肿瘤细胞表面过度表达受体的配体，对给药系统进行修饰，将特异性结合的性质转移到给药系统上，达到靶向输送的作用。基于主动靶向策略的配体修饰纳米给药系统已被证实可高效靶向肿瘤细胞，增加多种药物向肿瘤细胞的递送。目前，研究集中在利用肿瘤细胞上高度表达的特异性受体，使用相应的蛋白或单克隆抗体等作为靶向配体修饰纳米给药系统，介导药物进入瘤内；然而，配体修饰的纳米给药系统由于受体在正常组织细胞的表达仍然会在正常组织蓄积。
所述转铁蛋白受体被用作肿瘤靶点用于肿瘤靶向递送已有大量研究报道，并取得了突破性的成果；当前，许多上述受体特异性的配体包括转铁蛋白和多肽等被用于修饰纳米给药系统，实现药物的肿瘤靶向递送；然而，转铁蛋白受体在正常组织细胞如肝、脾、肺、肾、脑细胞以及血管内皮细胞等的表达，使得以转铁蛋白受体作为靶点的肿瘤靶向给药系统在在正常组织蓄积增加，导致毒副作用提高。
有研究指出，综合考虑肿瘤组织和正常组织的病理、生理差异，肿瘤细胞外微酸环境成为解决问题的关键；由于旺盛的生理活动及无氧代谢使得肿瘤细胞产生大量酸性代谢产物，自身调节使得肿瘤细胞可适应酸性微环境。
因此，选用采用亲水负电的屏蔽分子通过pH敏感腙键改装转铁蛋白受体特异性配体末端，实现pH敏感和主动靶向相结合，有望在主动靶向的基础上屏蔽在正常组织的蓄积，进一步提高肿瘤靶向性；但迄今为止，尚未见有关报道。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的缺陷和不足，提供一种微酸环境控制开启的肿瘤主动靶向纳米给药系统。
本发明采用屏蔽分子以pH敏感键连接靶向多肽，以改装的靶向配体修饰表面富氨基的树状高分子材料来包封基因自组装制成微酸环境控制开启的肿瘤主动靶向纳米给药系统；
所述肿瘤主动靶向纳米给药系统，利用正常组织和肿瘤组织细胞外间隙环境pH的差异，采用屏蔽分子以pH敏感键改装通过噬菌体展示技术筛选出靶向多肽，靶向多肽在正常组织被屏蔽，在肿瘤组织暴露出来，以pH敏感的内吞方式进入细胞，提高肿瘤细胞对药物的摄取，在主动靶向的基础上进一步降低正常细胞对药物的摄取；所述肿瘤主动靶向纳米给药系统既具有转铁蛋白受体作为肿瘤靶点靶向效率高的优点，还具有可解决“靶点受体在正常组织细胞表达导致肿瘤主动靶向多肽修饰的纳米给药系统在正常组织细胞蓄积”问题的优点，可更好地应用于肿瘤靶向药物的递送。
具体而言，本发明采用屏蔽分子以pH敏感键连接靶向多肽修饰表面富氨基的树状高分子材料包封基因自组装制成微酸环境控制开启的肿瘤主动靶向纳米给药系统，其特征在于，由高分子材料聚赖氨酸型树状分枝物、聚乙二醇马来酰亚胺－聚乙二醇3500－琥珀酰亚胺、多肽HAIYPRH、屏蔽分子DTPA和基因组成，其中，所述微酸环境控制开启的肿瘤主动靶向通过屏蔽分子DTPA以pH敏感键改装可特异性结合转铁蛋白受体的靶向多肽；所述屏蔽分子改装多肽修饰高分子材料聚赖氨酸型树状分枝物包封基因自组装形成纳米粒；
所述高分子材料聚赖氨酸型树状分枝物与聚乙二醇马来酰亚胺－聚乙二醇3500－琥珀酰亚胺的摩尔比为1:10；所述的高分子材料聚赖氨酸型树状分枝物与靶向多肽HAIYPRH的摩尔比为1:5；所述的高分子材料聚赖氨酸型树状分枝物与屏蔽分子DTPA的摩尔比为1:5～1:70；所述的高分子材料聚赖氨酸型树状分枝物与基因的质量比为6:1；
所述的微酸环境控制开启的肿瘤主动靶向为通过pH敏感键改装靶向多肽；
所述的靶向多肽通过噬菌体展示技术筛选得到，序列为HAIYPRH；
所述的靶向多肽带半胱氨酸和羰基末端，为CHAIYPRH-NH-NH2；
所述的通过pH敏感键改装靶向多肽为在靶向多肽末端以腙键连接屏蔽分子；
所述的屏蔽分子DTPA选自水溶性的负电的DTPA；所述的屏蔽分子DTPA带有羰基末端；
所述的高分子材料为表面富氨基的高分子材料聚赖氨酸型树状分枝物。
本发明的微酸环境控制开启的肿瘤主动靶向纳米给药系统的制备方法，其特征在于，步骤为：
将高分子材料聚赖氨酸型树状分枝物溶于甲醇中配制成储备液，取适量于西林瓶中吹干；称取适量聚乙二醇马来酰亚胺－聚乙二醇3500－琥珀酰亚胺溶解到pH 8.0磷酸盐缓冲液中配制成适宜浓度，加入到西林瓶中，与高分子材料聚酰胺－胺型树状分枝物摩尔比为1:10，一定温度下搅拌反应2h，将多肽HAIYPRH溶于适量pH 7.0磷酸盐缓冲液里，配制成适当浓度的多肽HAIYPRH溶液，加入到高分子材料聚酰胺－胺型树状分枝物—聚乙二醇马来酰亚胺－聚乙二醇3500－琥珀酰亚胺溶液中，与高分子材料聚酰胺－胺型树状分枝物摩尔比1:5，一定温度下反应24h，转移到MWCO 5000超滤离心管中以12000rpm超滤30min去除未反应的聚乙二醇3500和多肽HAIYPRH，纯水复溶，冷冻干燥，制得肿瘤主动靶向载体DGL-PEG-T7，溶解于甲醇中。称取适量屏蔽分子DTPA和氨基丙酮，分别溶解到pH 9.0磷酸盐缓冲液中，摩尔比为1:1混合，室温条件下搅拌反应48h，冷冻干燥，甲醇提取得到含羰基的屏蔽分子DTPA，加入到肿瘤主动靶向载体DGL-PEG-T7的甲醇溶液中，加入乙酸，乙酸与基础载体DGL的摩尔比为226:1，氩气下反应48h，MWCO 5000透析纯化，制得微酸环境控制开启的肿瘤主动靶向载体DGL-PEG-T7-hydrazone-DTPA；再与基因以质量比6:1涡旋反应30s，即得微酸环境控制开启的肿瘤主动靶向纳米给药系统。
本发明克服了现有技术中以主动靶向策略为基础的靶向配体修饰纳米给药系统存在的不足（即靶点受体在正常组织细胞表达导致肿瘤主动靶向多肽修饰的纳米给药系统在正常组织细胞蓄积），具有以下优点：
（1）在微酸环境下断裂的pH敏感键在靶向多肽末端连接屏蔽分子；所述的改装多肽修饰的纳米给药系统（即微酸环境控制开启的肿瘤主动靶向纳米给药系统），基于正常组织中性环境和肿瘤组织微酸环境的差异，解决靶点受体在正常组织细胞表达导致肿瘤主动靶向多肽修饰的纳米给药系统在正常组织细胞蓄积；
（2）所述改装多肽修饰的纳米给药系统在正常组织靶向多肽被屏蔽，不结合转铁蛋白受体；在肿瘤组织靶向多肽暴露，可结合转铁蛋白受体；
（3）所述改装多肽修饰的纳米给药系统以pH敏感的内吞方式进入细胞，屏蔽正常组织的蓄积，使纳米给药系统在肿瘤主动靶向的基础上，屏蔽正常组织的摄取；
（4）本发明制备方法简单，不需特殊的处理，可直接用于细胞和动物试验。
本发明的微酸环境控制开启的肿瘤主动靶向纳米给药系统由于系统中屏蔽分子的改装作用，完善了主动靶向纳米给药系统；其中，所述屏蔽分子的改装使肿瘤主动靶向纳米给药系统避免了其他正常细胞的摄取，提高纳米给药系统对肿瘤的靶向效率；本发明靶向和治疗效率高、制备简捷，可用于制备靶向人体来源或动物来源的肿瘤细胞药物。
附图说明
图1纳米药物载体设计及分组。本技术方案设计的微酸环境控制开启的肿瘤主动靶向载体DGL-PEG-T7-hydrazone-DTPA，屏蔽分子靶向多肽酰胺键连接的载体DGL-PEG-T7-DTPA，靶向多肽修饰的载体DGL-PEG-T7，未修饰的载体DGL-PEG。
图2载体DGL-PEG（上）和DGL-PEG-T7（下）在400MHz氢谱。
图3DTPA氢谱。
图4DGL-PEG-T7-DTPA（上）及其在酸性条件下透析后（下）的氢谱。
图5DTPA（左）与DGL-PEG-T7-DTPA（右）的紫外光谱。
图6DTPA与氨基丙酮反应液（上）及甲醇提取物（下）质谱。
图7氨基丙酮（上）及带羰基的DTPA（下）氢谱。
图8DGL-PEG-T7-hydrazone-DTPA（上）及其在酸性条件下透析产物（下）的氢谱（DGL与带羰基的DTPA摩尔比1:5）。
图9DGL-PEG-T7-hydrazone-DTPA（上）及其在酸性条件下透析产物（下）的氢谱（DGL与带羰基的DTPA摩尔比1:10）。
图10DGL-PEG-T7-hydrazone-DTPA（上）及其在酸性条件下透析产物（下）的氢谱（DGL与带羰基的DTPA摩尔比1:20）。
图11DGL-PEG-T7-hydrazone-DTPA（上）及其在酸性条件下透析产物（下）的氢谱（DGL与带羰基的DTPA摩尔比1:70）。
图12DGL-PEG-T7-hydrazone-DTPA及其在酸性条件下透析产物的紫外光谱（DGL与带羰基的DTPA摩尔比1:20）。
图13纳米给药系统设计分组以及体内行为模拟。
图14琼脂糖凝胶电泳表征载体对DNA的包封情况。M：分子量；A：DNA；B：DGL-PEG/DNA；C：DGL-PEG-T7/DNA；D：DGL-PEG-T7-DTPA/DNA；E：DGL-PEG-T7-hydrazone-DTPA/DNA。
图15透射电镜表征外观形态——微酸环境控制开启的肿瘤主动靶向纳米载药系统DGL-PEG-T7-hydrazone-DTPA/DNA。
图16动态光散射法表征纳米给药系统的粒径和表面电位。
图17萤光显微镜下定性表征各载体在“中性条件正常细胞”和“酸性条件肿瘤细胞”上的摄取。载体用绿色BODIPY标记，标尺：400μm。
图18萤光显微镜下定性表征各给药系统在“中性条件正常细胞”和“酸性条件肿瘤细胞”上的摄取。基因用绿色YOYO-1标记，标尺：200μm。
图19萤光显微镜下定性表征载报告基因纳米给药系统在“中性条件正常细胞”和“酸性条件肿瘤细胞”上绿色萤光蛋白的表达，标尺：400μm。
图20荧光活体成像表征荷皮下肿瘤裸鼠给予纳米给药系统不同时间后的分布情况。
图21放射性标记纳米给药系统静脉注射荷皮下肿瘤裸鼠4h后各器官分布。
图22荧光标记纳米给药系统在荷皮下肿瘤裸鼠体内24h各器官围观分布，标尺：200μm。
图23裸鼠原位移植肝肿瘤45d后外形变化（左上）及肝内肿瘤结节形成（左下）；荧光活体成像表征裸鼠原位移植肝肿瘤50d后静脉注射近红外萤光标记纳米载药系统24h后在肝脏及肿瘤内的分布情况。
具体实施方式
实施例1
将聚赖氨酸溶于适量甲醇中配制成10mg/ml的溶液，取100μl于西林瓶中吹干；将聚乙二醇马来酰亚胺－聚乙二醇3500－琥珀酰亚胺溶于适量的0.035MpH 8.0磷酸盐缓冲溶液中配制成5mg/ml工作溶液，取318μl聚乙二醇工作液加入到西林瓶中，于室温搅拌反应2h，将聚赖氨酸-聚乙二醇DGL-PEG加入到MWCO 5000超滤离心管中，12000rpm超滤30min纯化，制得未修饰的载体聚赖氨酸-聚乙二醇DGL-PEG。
实施例2
将聚赖氨酸溶于适量甲醇中配制成10mg/ml的溶液，取100μl于西林瓶中吹干；将聚乙二醇马来酰亚胺－聚乙二醇3500－琥珀酰亚胺溶于适量的0.035MpH 8.0磷酸盐缓冲溶液中配制成5mg/ml工作溶液，取318μl聚乙二醇工作液加入到西林瓶中，于室温搅拌反应2h；再将T7溶于适量pH 7.0磷酸盐缓冲溶液，配制成1mg/ml的多肽溶液，取226μl加入到聚赖氨酸-聚乙二醇溶液中，于室温搅拌反应24h，加入到MWCO 5000超滤离心管中，12000rpm超滤30min纯化，制得靶向多肽T7修饰的载体聚赖氨酸-聚乙二醇-多肽DGL-PEG-T7。
实施例3
称取28.2mg DGL-PEG-T7（0.454μmol）与5.9mg p-SCN-Bn-DTPA（9.08μmol）在12mL PBS 9.0中室温发应48h。载体上多肽T7末端的酰肼可先与DTPA上的异硫氰根发生加成反应，将DTPA通过酰胺键连接到载体上多肽T7的末端，得到DPTD；通过MWCO 3000的超滤管除去未反应的p-SCN-Bn-DTPA。
实施例4
称取1mg氨基丙酮，与5.9mg p-SCN-Bn-DTPA（9.08μmol）在12mL PBS9.0中室温发应48h，得到含羰基的DTPA，反应产物甲醇提取纯化。取微量上述48h后反应液以及甲醇提取液，进行质谱鉴定；取微量上述48h后甲醇提取液，旋转蒸发，溶于D2O，进行氢谱鉴定。
实施例5
称取28.2mg DGL-PEG-T7（0.454μmol）复溶于甲醇中，取带羰基的DTPA，使与载体DGL摩尔比为5:1、10:1、20:1和70:1；加入5.9μL乙酸，与载体摩尔比226:1；氩气下室温发应，使DTPA上羰基特异性与多肽T7末端酰肼发生反应，形成腙键，48h后旋转蒸发去除有机溶剂，溶于三蒸水，通过MWCO 3000的透析袋在PBS 7.4中除去载体表面的DTPA；其与载体表面氨基反应形成的西佛碱不稳定，而带羰基的DTPA与多肽T7末端酰肼发生反应形成的腙键在同样条件下稳定性要高。
实施例6.
按上述方法合成各载体DGL-PEG、DGL-PEG-T7、DGL-PEG-T7-DTPA和DGL-PEG-T7-hydrazone-DTPA，纯化后冻干，溶于0.5ml氘代重水（D2O），400MHz进行1H-NMR分析。
实施例7
为了考察DGL-PEG-T7-DTPA和DGL-PEG-T7-hydrazone-DTPA在不同pH条件下DTPA的解离情况，两种载体分别在pH 7.4和6.0中透析，再换三蒸水，冻干，溶于0.5ml氘代重水（D2O），400MHz进行1H-NMR分析；最终选定带羰基的DTPA与载体DGL摩尔比为20:1来合成DGL-PEG-T7-hydrazone-DTPA。
实施例8
采用UV-Vis法评价DGL衍生物的合成。样品DTPA、DGL-PEG-T7、DGL-PEG-T7-DTPA和DGL-PEG-T7-hydrazone-DTPA分别于200-400nm范围内扫描吸收光谱；超纯水作为本底。
实施例9
以50mM Na2SO4溶液稀释到质粒DNA到100μg/ml，合成各载体DGL-PEG、DGL-PEG-T7、DGL-PEG-T7-DTPA和DGL-PEG-T7-hydrazone-DTPA，以PBS 7.4稀释到100μgDGL/ml，加入基因溶液，并使得DGL与DNA的质量比为6:1，漩涡30s。
实施例10
采用透射电镜技术对DGL-PEG-T7-hydrazone-DTPA/DNA微酸环境控制开启的肿瘤主动把向纳米给药系统表面形态性质进行表征。
实施例11
采用马尔文纳米粒度-电位分析仪，测DGL-PEG-T7-hydrazone-DTPA/DNA微酸环境控制开启的肿瘤主动把向纳米给药系统以及其他纳米给药系统的光散射粒径和表面电位。
实施例12
称取0.14g琼脂糖于三角烧瓶中，加入电泳液1×TAE，加入10μl 500μg/ml溴乙啶，微波加热至沸，使琼脂糖完全溶解，室温放置约50℃，倒入电泳槽中，置入梳子，冷凝成凝胶。新鲜制备DGL-PEG、DGL-PEG-T7、DGL-PEG-TT-DTPA、DGL-PEG-T7-hydrazone-DTPA分别包封DNA的纳米给药系统。将各组样品加入至凝胶中，并以游离基因作为对照，加入基因分子量标记物，开启电源，电压为100V，约25min停止，紫外灯下观察基因的迁移。
实施例13
为了评价载体在体外靶向进入中性条件正常细胞和酸性条件肿瘤细胞内的能力，将各载体用绿色荧光探针BODIPY标记；定量称取BODIPY，溶于100mMNaHCO3溶液中配制成200μg/ml储备液，避光保存，3d之内使用；按照BODIPY:DGL 10:1（mol/mol）的比例，与各载体4°C避光搅拌反应12h，制得BODIPY标记载体。将Bel-7402细胞以5×104细胞/孔的密度培养在24孔板中，48h后，在显微镜下观察细胞的密度及形态；以酸性条件下为肿瘤细胞，中性条件下为正常细胞；当细胞密度达到70-80%左右后且形态良好时，分别加入萤光标记的各载体，剂量以DGL计，每孔15μg，200μL，37°C孵育30min。
实施例14
为了评价纳米给药系统在体外介导正常细胞和肿瘤细胞内基因转运的能力，基因用绿色荧光探针YOYO-1标记；基因用0.05M pH 8.0Tris缓冲液稀释到2mg/ml，取200μl加入到60μl 0.1mM的YOYO-1水溶液，基因与荧光探针体积比为10:3混合，室温避光孵育60min。将Bel-7402细胞以5×104细胞/孔的密度培养在24孔板中，48h后，在显微镜下观察细胞的密度及形态。以酸性条件下为肿瘤细胞，中性条件下为正常细胞；当细胞密度达到70-80%左右后且形态良好时，分别加入萤光标记的纳米给药系统，剂量以DGL计，每孔15μg，200μL，37°C孵育30min。
实施例15
采用绿色荧光蛋白报告基因pEGFP-N2，制备报告基因纳米给药系统；将Bel-7402细胞以5×104细胞/孔的密度培养在24孔板中，48h后，在显微镜下观察细胞的密度及形态；以酸性条件下为肿瘤细胞，中性条件下为正常细胞；当细胞密度达到70-80%左右后且形态良好时，分别加入上述各组纳米给药系统，剂量以DGL计，每孔15μg，200μL，孵育2h，用新鲜完全培养基替换掉药液，继续孵育，48h后荧光显微镜下观察各组基因表达出的绿色荧光蛋白的情况。
实施例16
皮下移植肿瘤裸鼠模型的建立，Balb/c裸鼠腹腔注射10%水合氯醛（5ml/kg）麻醉，Bel-7402细胞经胰酶消化，离心后将其悬浮于Hank’s液中，计数调节浓度至2-4×107/mL；将人肿瘤细胞株以包含2-8×106个处于对数生长期的瘤细胞的0.1-0.2mL细胞悬液接种于裸鼠背侧部近腋下部皮下。
实施例17
原位移植肝肿瘤裸鼠模型的建立，皮下的Bel-7402肿瘤直径达到1cm时，动物腹腔注射10%水合氯醛（5ml/kg）麻醉，取新鲜的肿瘤，去除坏死部分组织，切成1～2mm3的小块。正常4～6周雄性裸鼠，麻醉，并卧置于手术台上，左上腹横切，用粗注射器针头取一块肿瘤，与肝脏下叶表面呈20度，插入3mm，缝合，动物自由进食。
实施例18
萤光活体成像表征纳米给药系统在皮下移植肿瘤裸鼠上的体内分布。为了评价纳米给药系统在荷皮下肿瘤裸鼠体内的分布，采用近红外萤光探针NIR 783标记载体DGL-PEG-T7和DGL-PEG-T7-hydrazone-DTPA，DGL-PEG或DGL-PEG-T7-hydrazone-DTPA（2mg DGL/ml溶于100mM HEPES 8.3）与近红外萤光探针NIR 783（5mg/ml二甲基甲酰胺溶液）摩尔比为1:5，室温下反应2h，MWCO 3000超滤纯化，12000rpm离心30min×3次以除去未反应的探针。以此荧光探针标记的载体制备纳米给药系统；将基因先用萤光探针EMA标记，具体地，1份1mg/mL的基因溶液（0.05M Tris 8.0）与9份0.1mg/mL的EMA水溶液混合，室温避光孵育30min并不时涡旋混匀。将该复合溶液以小滴铺展于塑料膜上，暗房内UV照射1h，收集，加入乙醇，使与水溶液比例为7:3(v/v)。离心收集下层红色沉淀物，复溶于50mM Na2SO4溶液中。之后再将此萤光标记的基因与萤光标记载体复合，制备纳米载药系统；裸鼠皮下移植瘤直径不小于0.5cm时，尾静脉注射荧光标记的纳米载药系统，剂量以DNA计，50μgDNA每鼠，给药后4、12和24h，麻醉动物，活体成像系统下观察DNA和载体在体内的分布情况。
实施例19
放射性标记示踪纳米给药系统的体内分布，在BH试剂（3μg）中加入125I约1mCi和适量氯胺T溶液，振荡反应10s到20s，迅速加入偏重亚硫酸钠溶液、NaI溶液、DMF溶液和苯适量，振摇，苯层合并，氮气吹干，测定放射性强度，BH试剂的125I标记率约为81.5％。适量载体分别溶于硼酸盐缓冲液（0.1M，pH 8.5），与125I标记的BH试剂周期性漩涡混合，冰上孵育15min，PBS（pH8.0）透析除去未反应的125I，4°C贮存待用；用125I标记载体制备纳米给药系统，尾静脉注射，每组6只荷皮下肿瘤裸鼠，每鼠注射DNA 50μg，放射性剂量均为1.48×106Bq；4h后处死，取组织于γ计数器测定125I的放射性计数，结果用单位组织质量的总剂量百分数（%ID·g-1）表示。
实施例20
荧光标记示踪纳米给药系统的体内微观分布，为了评价纳米给药系统在荷瘤裸鼠体内的微观分布，采用红色萤光探针BODIPY标记载体，定量称取BODIPY，溶于DMSO溶液中配制成200μg/ml储备液，避光保存，3d之内使用；按照BODIPY:DGL 10:1（mol/mol）的比例，室温避光搅拌反应1h，制得BODIPY标记的载体。与基因复合制备纳米载药系统；裸鼠皮下移植瘤直径不小于0.5cm时，尾静脉注射荧光标记的纳米载药系统，剂量以DNA计，50μgDNA每鼠，给药后12h，麻醉动物，冰冻切片，DAPI复染，荧光显微镜下观察纳米载药系统在各器官的分布情况。
实施例21
萤光活体成像表征纳米给药系统在荷原位肿瘤裸鼠体内分布，为了评价纳米给药药系统在荷原位肝肿瘤裸鼠体内的分布，采用近红外萤光探针NIR 783标记载体与基因复合，制备纳米给药系统；在裸鼠原位移植肝肿瘤50d后，尾静脉注射荧光标记的纳米载药系统，剂量以DNA计，50μgDNA每鼠，给药后24h，麻醉动物，活体成像系统下观察纳米载药系统在体内的分布情况。
SEQUENCE LISTING
<110> 复旦大学
<120> 一种微酸环境控制开启的肿瘤主动靶向纳米给药系统及其制备方法
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 7
<212> PRT
<213> 多肽
<400> 1
His Ala Ile Tyr Pro Arg His
1 5
Claims (8)
1.一种微酸环境控制开启的肿瘤主动靶向纳米给药系统，其特征在于，由高分子材料聚赖氨酸型树状分枝物、聚乙二醇马来酰亚胺－聚乙二醇3500－琥珀酰亚胺、多肽HAIYPRH、屏蔽分子DTPA和基因组成，其中，所述微酸环境控制开启的肿瘤主动靶向通过屏蔽分子DTPA以pH敏感键改装可特异性结合转铁蛋白受体的靶向多肽，所述屏蔽分子改装多肽修饰高分子材料聚赖氨酸型树状分枝物包封基因自组装形成纳米粒；
所述高分子材料聚赖氨酸型树状分枝物与聚乙二醇马来酰亚胺－聚乙二醇3500－琥珀酰亚胺的摩尔比为1:10；
所述的高分子材料聚赖氨酸型树状分枝物与靶向多肽HAIYPRH的摩尔比为1:5；
所述的高分子材料聚赖氨酸型树状分枝物与屏蔽分子DTPA的摩尔比为1:5～1:70；
所述的高分子材料聚赖氨酸型树状分枝物与基因的质量比为6:1。
2.按权利要求1所述的微酸环境控制开启的肿瘤主动靶向纳米给药系统，其特征在于，所述的靶向多肽带半胱氨酸和羰基末端，为
3.按权利要求1所述的微酸环境控制开启的肿瘤主动靶向纳米给药系统，其特征在于，所述的通过pH敏感键改装靶向多肽为在靶向多肽末端以腙键连接屏蔽分子
4.按权利要求1所述的微酸环境控制开启的肿瘤主动靶向纳米给药系统，其特征在于，所述的屏蔽分子DTPA选自水溶性的负电的DTPA。
5.按权利要求4所述的微酸环境控制开启的肿瘤主动靶向纳米给药系统，其特征在于，所述的屏蔽分子DTPA带有羰基末端。
6.按权利要求1所述的微酸环境控制开启的肿瘤主动靶向纳米给药系统，其特征在于，所述的高分子材料聚赖氨酸型树状分枝物为表面富氨基的高分子材料聚赖氨酸型树状分枝物。
7.权利要求1所述的微酸环境控制开启的肿瘤主动靶向纳米给药系统的制备方法，其特在于，步骤为：
将高分子材料聚赖氨酸型树状分枝物溶于甲醇中配制成储备液，取适量于西林瓶中吹干；称取适量聚乙二醇马来酰亚胺－聚乙二醇3500－琥珀酰亚胺溶解到pH 8.0磷酸盐缓冲液中配制成适宜浓度，加入到西林瓶中，与高分子材料聚酰胺－胺型树状分枝物摩尔比为1:10，一定温度下搅拌反应2h，将多肽HAIYPRH溶于适量pH 7.0磷酸盐缓 冲液里，配制成适当浓度的多肽HAIYPRH溶液，加入到高分子材料聚酰胺－胺型树状分枝物—聚乙二醇马来酰亚胺－聚乙二醇3500－琥珀酰亚胺溶液中，与高分子材料聚酰胺－胺型树状分枝物摩尔比1:5，一定温度下反应24h，转移到MWCO 5000超滤离心管中以12000rpm超滤30min去除未反应的聚乙二醇3500和多肽HAIYPRH，纯水复溶，冷冻干燥，制得肿瘤主动靶向载体DGL-PEG-T7，溶解于甲醇中；称取适量屏蔽分子DTPA和氨基丙酮，分别溶解到pH 9.0磷酸盐缓冲液中，摩尔比为1:1混合，室温条件下搅拌反应48h，冷冻干燥，甲醇提取得到含羰基的屏蔽分子DTPA，加入到肿瘤主动靶向载体DGL-PEG-T7的甲醇溶液中，加入乙酸，氩气下反应48h，MWCO 5000透析纯化，制得微酸环境控制开启的肿瘤主动靶向载体DGL-PEG-T7-hydrazone-DTPA；再与基因以质量比6:1涡旋反应30s，即得微酸环境控制开启的肿瘤主动靶向纳米给药系统。
8.权利要求1的微酸环境控制开启的肿瘤主动靶向纳米给药系统在制备靶向人体来源或动物来源的肿瘤细胞药物中的用途。
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