CN103703136A - 采用真菌过氧化酶的脂族烃的区域选择性氧化 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及在取代或未取代的、直链或支链的脂族烃的两端的2或3位进行羟基化的酶法。

Description

采用真菌过氧化酶的脂族烃的区域选择性氧化
序列表的参考
本申请包含计算机可读形式的序列表。该计算机可读形式并入本文以供参考。
技术领域
本发明涉及具有过氧化酶（peroxygenase）活性的多肽在脂族烃的位点特异性氧化中的用途。
背景技术
发现来自伞菌类担子菌菌株茶树菇（Agrocybe aegerita）（菌株TM-A1）的表示为AaP的过氧化酶使芳基醇和醛氧化。通过数个步骤的离子色谱和SDS-PAGE从茶树菇TM Al中纯化AaP过氧化酶，在2D电泳之后确定分子量和N端14氨基酸序列，但未分离编码基因（Ullrich等人,2004,Appl.Env.Microbiol.70（8）:4575-4581）。
WO2006/034702公开使用茶树菇TM Al的AaP过氧化酶对未活化的烃诸如萘、甲苯和环己烷进行酶羟化的方法。这也描述于Ullrich和Hofrichter,2005,FEBS Letters579:6247-6250。
WO2008/119780公开来自茶树菇、灰盖鬼伞（Coprinopsiscinerea）、双色蜡蘑（Laccaria bicolor）和辅毛鬼伞（Coprinus radians）的八种不同的过氧化酶；在本申请中还示为SEQ ID NOs:1-8。
DE10332065Al公开通过使用茶树菇TM Al的AaP过氧化酶由醇通过中间形成醛而酶法制备酸的方法。
报道了迅速且选择性分光光度法直接检测经AaP过氧化酶的芳族羟化的方法（Kluge等人，2007，Appl Microbiol Biotechnol75:1473-1478）。
众所周知将氧官能团直接区域选择性引入有机分子（氧合）在化学合成中构成问题。特别难以催化脂族烃的选择性羟化。产物可在各种不同合成中用作重要的中间体。
具体而言，烷烃的化学羟化相对较复杂，需要强力的/毒性的化学品/催化剂，并导致一系列不期望的副产物。
已知一种胞内酶甲烷单加氧酶（ΜΜO，EC14.13.25），使一些烃的末端碳氧合/羟化。MMO酶由数个蛋白质组分组成，并由甲基营养菌（例如荚膜甲基球菌（Methylococcus capsulatus））形成；其需要复合电子供体诸如NADH或NADPH、辅助蛋白（黄素还原酶、调节蛋白）和分子氧（O2）。MMO的天然底物是甲烷，其被氧化为甲醇。作为特别非特异性的生物催化剂，除甲烷之外，MMO还氧合/羟化一系列进一步的底物诸如正烷烃及其衍生物、环烷烃、芳族化合物、一氧化碳和杂环化合物。该酶在生物技术中的应用目前尚不可能，因为其像大部分胞内酶一样难以分离，其具有低稳定性，且所需的共底物相对昂贵。
发明内容
在第一方面，本发明的发明人提供在取代或未取代的、直链或支链的脂族烃的至少两端的第二或第三碳处引入羟基或桥氧（oxo）基的酶法，该脂族烃具有至少5个碳并具有连接于所述第二或第三碳的氢，该方法包括使脂族烃与过氧化氢和具有过氧化酶活性的多肽接触，其中多肽包括：
a）与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29具有至少30%同一性的氨基酸序列；以及
b）由一种或多种以下基序所表示的氨基酸序列：
基序I：[FL]XX[YF]S[AN]X[FHY]G[GN]GX[YF]N  （SEQ IDNO:9）；
基序II：G[GN]GX[YF]NXX[VA]AX[EH][LF]R    （SEQ ID NO:10）；
基序III：RXXRI[QE][DEQ]S[IM]ATN          （SEQ ID NO:11）；
基序IV：S[IM]ATN[PG][EQN][FM][SDN][FL]   （SEQ ID NO:12）；
基序V：P[PDK][DG]F[HFW]R[AP]             （SEQ ID NO:13）；
基序VI：[TI]XXXLYPNP[TK][GV]             （SEQ ID NO:14）；
基序VII：E[HG]DXSX[ST]RXD                （SEQ ID NO:15）。
在其它方面，本发明提供具有过氧化酶活性的多肽用于从衣物中去除含脂质的污迹的用途；以及用于从衣物中减少不愉快气味的用途。
附图说明
图1示出用灰盖鬼伞过氧化酶（0.5mM H2O2）孵育的十四烷的色谱图；来自实施例3。
图2示出用茶树菇过氧化酶（2.5mM H2O2）孵育的十四烷的色谱图；来自实施例3。
图3示出用灰盖鬼伞过氧化酶（0.5mM H2O2）孵育的十四醇的色谱图；来自实施例4。
图4示出用茶树菇过氧化酶（2.5mM H2O2）孵育的十四醇的色谱图；来自实施例4。
具体实施方式
定义
过氧化酶活性：术语“过氧化酶活性”根据EC1.11.2.1在本文中定义为“非特异性过氧化酶”。这是血红素硫醇盐蛋白质（heme-thiolateprotein）。该类型的酶包括由伞菌类担子菌分泌的糖蛋白。它们催化氧原子从H2O2插入广泛种类的底物，诸如萘、4-硝基苯并二氧杂环戊烯（4-nitrobenzodioxole）；和烷烃诸如丙烷、己烷和环己烷。它们对于氯几乎无或无活性。
为了本发明的目的，根据Kluge等人（2007,Appl MicrobiolBiotechnol75:1473-1478）描述的分光光度步骤确定过氧化酶活性。
分离的多肽：本文使用的术语“分离的多肽”是指从来源分离的多肽。在优选的方面，通过SDS-PAGE确定，多肽为至少1%纯，优选至少5%纯，更优选至少10%纯，更优选至少20%纯，更优选至少40%纯，更优选至少60%纯，甚至更优选至少80%纯，并且最优选至少90%纯。
基本上纯的多肽：术语“基本上纯的多肽”在本文表示多肽制品，其含有按重量计至多10%，优选至多8%，更优选至多6%，更优选至多5%，更优选至多4%，更优选至多3%，甚至更优选至多2%，最优选至多1%，并且甚至最优选至多0.5%的与其天然或重组相关的（associated）其它多肽材料。因此，优选基本上纯的多肽是按存在于制品中的全部多肽材料的重量计至少92%纯，优选至少94%纯，更优选至少95%纯，更优选至少96%纯，更优选至少96%纯，更优选至少97%纯，更优选至少98%纯，甚至更优选至少99%，最优选至少99.5%纯，并且甚至最优选100%纯。本发明的多肽优选是基本上纯的形式，即，该多肽制品基本上不含与其天然或重组相关的其它多肽材料。例如，这能够通过众所周知的重组方法或通过经典的纯化方法制备多肽来实现。
成熟多肽：术语“成熟多肽”在本文中定义为具有过氧化酶活性的多肽，该多肽处于其在翻译和任何诸如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等的翻译后修饰之后的最终形式。在优选方面，成熟多肽具有基于N端肽测序数据（Ullrich等人,2004,Appl.Env.Microbiol.70(8)::4575-4581）（其阐明AaP过氧化酶的成熟蛋白质的开始）的SEQ ID NO:1的位置1至330中所示的氨基酸序列。在另一优选方面，成熟多肽具有SEQ ID NO:2中位置1至328中所示的氨基酸序列。
同一性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性由参数“同一性”描述。
为了本发明的目的，使用如EMBOSS软件包（EMBOSS:TheEuropean Molecular Biology Open Software Suite,Rice等人,2000,Trendsin Genetics16:276-277；http://emboss.org）（优选3.0.0版或更新版本）的Needle程序中执行的Needleman-Wunsch算法（Needleman和Wunsch,1970,J Mol.Biol.48:443-453）来确定两个氨基酸序列之间的同一性程度。使用的任选参数为缺口开放罚分（gap open penalty）10、缺口延伸罚分（gap extension penalty）0.5、和EBLOSUM62（BLOSUM62的EMBOSS版）取代矩阵。标记为“最长同一性（longest identity）”的Needle的输出（使用-nobrief选项获得）被用作百分比同一性，并如下计算：
（相同的残基×100）/（比对长度-比对中缺口的总数）。
为了本发明的目的，使用如EMBOSS程序包（EMBOSS:TheEuropean Molecular Biology Open Software Suite,Rice等人，2000，见上文；http://emboss.org）（优选3.0.0或更新版本）的Needle程序中执行的Needleman-Wunsch算法（Needleman和Wunsch,1970，见上文）来确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的同一性程度。使用的任选参数是缺口产生罚分10、缺口延伸罚分0.5、和EDNAFULL（NCBI NUC4.4的EMBOSS版本）取代矩阵。标记为“最长同一性”的Needle的输出（使用-nobrief选项获得）被用作百分比同一性，并如下计算：
（相同的脱氧核糖核苷酸×100）/（比对长度-比对中缺口的总数）。
修饰：术语“修饰”在本文中意指由SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29或其同源序列的成熟多肽组成的多肽的任何化学修饰，以及编码此种多肽的DNA的遗传操作。修饰可为取代、缺失和/或插入一个或多个（数个）氨基酸，以及替换一个或多个（数个）氨基酸侧链。
具有过氧化酶活性的多肽（过氧化酶）
本发明涉及具有过氧化酶活性的分离多肽的用途，该多肽优选为重组产生的，其包括与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29的多肽，优选与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的多肽，具有至少30%同一性，优选至少35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、或98%同一性的氨基酸序列。
在优选实施方式中，多肽包括由一种或多种下述基序表示的氨基酸序列，优选包括两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或六种下述基序：
基序I：[FL]XX[YF]S[AN]X[FHY]G[GN]GX[YF]N  （SEQ IDNO:9）；
基序II：G[GN]GX[YF]NXX[VA]AX[EH][LF]R     （SEQ ID NO:10）；
基序III：RXXRI[QE][DEQ]S[IM]ATN           （SEQ ID NO:11）；
基序IV：S[IM]ATN[PG][EQN][FM][SDN][FL]    （SEQ ID NO:12）；
基序V：P[PDK][DG]F[HFW]R[AP]              （SEQ ID NO:13）；
基序VI：[TI]XXXLYPNP[TK][GV]              （SEQ ID NO:14）；
基序VII：E[HG]DXSX[ST]RXD        （SEQ ID NO:15）。
在更优选的实施方式中，过氧化酶包括由基序E[HG]DXSX[ST]RXD表示的氨基酸序列。
在另一个实施方式中，多肽包括如下氨基酸序列，该氨基酸序列具有SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29，优选SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的一个或数个氨基酸的取代、缺失和/或插入。
在又一个实施方式中，第一方面的多肽包括以下或由以下组成：SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29的氨基酸序列，优选SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的氨基酸序列，或其具有过氧化酶活性的片段；优选地，多肽包括以下或由以下组成：SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29的成熟多肽，优选SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽。
优选地，氨基酸变化为性质小的变化，即不显著影响蛋白质的折叠和/或活性的保守性氨基酸取代或插入；小缺失，通常为1到约30个氨基酸的缺失；小的氨基或羧基末端延伸，诸如氨基末端甲硫氨酸残基；多达约20-25个残基的小连接肽；或者通过改变净电荷或其它功能而促进纯化的小延伸，诸如多组氨酸束（polyhistidine tract)、抗原表位、或结合结构域。
保守性取代的实例是碱性氨基酸（精氨酸、赖氨酸和组氨酸）、酸性氨基酸（谷氨酸和天冬氨酸）、极性氨基酸（谷氨酰胺和天冬酰胺）、疏水氨基酸（亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸）、芳香族氨基酸（苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸）和小氨基酸（甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、和甲硫氨酸）各组内的取代。通常不改变比活的氨基酸取代在本领域是已知的，并且例如由H.Neurath和R.L.Hill,1979,于TheProteins,Academic Press,New York中描述。最常出现的交换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。
除了20个标准氨基酸，非标准氨基酸（诸如4-羟脯氨酸、6-N-甲基赖氨酸、2-氨基异丁酸、异缬氨酸、和α-甲基丝氨酸）可以取代野生型多肽的氨基酸残基。有限数量的非保守氨基酸、不由遗传密码编码的氨基酸、和非天然氨基酸可以取代氨基酸残基。“非天然氨基酸”在蛋白质合成后经过修饰，且/或在其侧链具有不同于标准氨基酸的化学结构。非天然氨基酸能够以化学方法合成，并且优选是市售的，且包括哌啶酸（pipecolic acid）、噻唑烷羧酸（thiazolidine carboxylic acid）、脱氢脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸、和3,3-二甲基脯氨酸。
或者，氨基酸改变有如下性质，即多肽的理化性质改变。例如，氨基酸改变可以提高多肽的热稳定性，改变底物特异性，和改变最适pH等。
可以根据本领域已知的步骤，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变（Cunningham和Wells,1989,Science244:1081-1085）来识别亲本多肽中的必需氨基酸。在后一技术中，在分子中的每个残基处引入单一丙氨酸突变，且测试所得突变分子的生物活性（即，过氧化酶活性）以识别对于该分子的活性关键的氨基酸残基。同样参见Hilton等人,1996,J.Biol.Chem.271:4699-4708。酶的活性位点或其他生物相互作用同样可以通过结构的物理分析确定，如通过例如核磁共振、晶体学、电子衍射、或光亲和标记等技术，结合推定的接触位点氨基酸的突变来确定。例如，参见de Vos等人,1992,Science255:306-312；Smith等人,1992,J.Mol.Biol.224:899-904；Wlodaver等人,1992,FEBS Lett.309:59-64。必需氨基酸的同一性还能够从与多肽的同一性分析来推断，该多肽与根据本发明的多肽相关。
可使用已知的诱变、重组、和/或改组（shuffling）方法，后接相关的筛选步骤，诸如Reidhaar-Olson和Sauer,1988,Science241:53-57；Bowie和Sauer,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:2152-2156；WO95/17413；或WO95/22625所公开的那些，来制作和测试单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入。可以使用的其他方法包括易于出错的PCR、噬菌体展示（例如，Lowman等人,1991,Biochem.30:10832-10837；U.S.专利第5,223,409号；WO92/06204）和区域定向的诱变（Derbyshire等人,1986,Gene46:145；Ner等人,1988,DNA7:127）。
诱变/改组方法可以与高通量、自动筛选方法结合，以检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性（Ness等人,1999,NatureBiotechnology17:893-896）。编码活性多肽的诱变的DNA分子能够从宿主细胞回收，并且使用本领域内标准方法快速测序。这些方法允许快速确定感兴趣的多肽中单个氨基酸残基的重要性，并且能够应用于未知结构的多肽。
SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29，优选SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的氨基酸取代、缺失和/或插入的总数是10，优选9，更优选8，更优选7，更优选至多6，更优选5，更优选4，甚至更优选3，最优选2，并且甚至最优选1。
另一个优选实施方式涉及本发明第一方面的具有过氧化酶活性的多肽，其中成熟多肽是SEQ ID NO:1的氨基酸1至330。
又一个优选实施方式涉及本发明第一方面的具有过氧化酶活性的多肽，其中成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸1至328。
又一个优选实施方式涉及本发明第一方面的具有过氧化酶活性的多肽，其中成熟多肽是SEQ ID NO:4的氨基酸1至344。
又一个优选实施方式涉及本发明第一方面的具有过氧化酶活性的多肽，其中成熟多肽是SEQ ID NO:23的氨基酸1至261。
过氧化氢
过氧化酶所需的过氧化氢可提供为过氧化氢的水溶液，或用于原位产生过氧化氢的过氧化氢前体。任何在溶解时释放可由过氧化酶使用的过氧化物的固体实体均可用作过氧化氢的来源。当溶解于水或合适的水类介质时产生过氧化氢的化合物包括但不限于金属过氧化物、过碳酸盐、过硫酸盐、过磷酸盐、过氧酸、烷基过氧化物、酰基过氧化物、过氧酯（peroxyesters）、尿素过氧化物、过硼酸盐和过氧羧酸或它们的盐。
过氧化氢的另一种来源是生成过氧化氢的酶体系，诸如氧化酶和氧化酶的底物。氧化酶和底物的组合的实例包括但不限于：氨基酸氧化酶（参见例如US6,248,575）和合适的氨基酸，葡糖氧化酶（参见例如WO95/29996）和葡萄糖，乳酸氧化酶和乳酸盐，半乳糖氧化酶（参见例如WO00/50606）和半乳糖，以及醛糖氧化酶（参见例如WO99/31990）和合适的醛糖。
通过研究EC1.1.3._、EC1.2.3._、EC1.4.3._、和EC1.5.3._或类似的类型（根据国际生物化学联合会），本领域技术人员可容易地识别此类氧化酶和底物的组合的其他实例。
可在本发明的方法开始时或过程中添加过氧化氢或过氧化氢源，例如作为过氧化氢的一次或多次单独添加，或连续地作为补料分批添加。过氧化氢的典型量相应于0.00l mM至25mM的水平，优选0.005mM至5mM的水平，且特别是0.01至1mM的水平的过氧化氢。过氧化氢还可以以相应于0.1mM至25mM的水平，优选0.5mM至15mM的水平，更优选1mM至10mM的水平，且最优选2mM至8mM的水平的过氧化氢量使用。
表面活性剂
本发明的方法可包括施用表面活性剂（例如，作为洗涤剂配制物的一部分或作为湿润剂）。适合于施用的表面活性剂可以是非离子的（包括半极性的）、阴离子的、阳离子和/或两性离子的；优选表面活性剂是阴离子的（诸如直链烷基苯磺酸酯、α-烯烃磺酸酯、烷基硫酸酯（脂肪醇硫酸酯）、醇乙氧基硫酸酯、仲烷磺酸酯、α-磺基脂肪酸甲酯、烷基或烯基琥珀酸或皂）或非离子的（诸如醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、烷基多糖苷、烷基二甲胺氧化物、乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺、脂肪酸单乙醇酰胺、多羟基烷基脂肪酸酰胺或葡糖胺（“葡糖酰胺”）的N-酰基N-烷基衍生物），或其混合物。
当包括在本发明方法中时，表面活性剂的浓度通常为按重量计约0.01%至约10%，优选约0.05%至约5%，且更优选约0.1%至约1%。
脂族烃
在本发明方法中氧化的烃是具有至少5个碳的链的脂族烃。优选地，脂族烃是烷或烯；更优选地，脂族烃是烷，诸如戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、十一烷、十二烷、十三烷、十四烷、十五烷或十六烷、或其异构体。甚至更优选地，脂族烃是十一烷、十二烷、十三烷、十四烷、十五烷或十六烷、或其异构体。
在实施方式中，脂族烃不是正己烷或正癸烷。
脂族烃是直链或支链的，但非环化的，因为位点特异性氧化对环烃是不可能的。支链烃相应于直链烃的异构体。
脂族烃是取代或未取代的。优选地，脂族烃是未取代的，诸如非活化的烃。
当脂族烃是取代的时（连接有官能团），优选的取代基为卤素、羟基、羧基、氨基、硝基、氰基、巯基、磺酰基、甲酰基、乙酰基、甲氧基、乙氧基、苯基、苄基、二甲苯基、氨基甲酰基和氨磺酰基；更优选的取代基为氯、羟基、羧基和磺酰基；且最优选的取代基为氯和羧基。
脂族烃可被多至10个取代基，多至8个取代基，多至6个取代基，多至4个取代基，多至2个取代或多至一个取代基取代。
方法和用途
本发明提供使用过氧化酶和过氧化氢在脂族烃至少两端的第二或第三碳进行羟基和/或桥氧（酮（keto））基的位点特异性引入的方法。
脂族烃必须包括至少5个碳的链。第二和第三碳通过从脂族烃的任一端对碳原子计数而确定。
脂族烃必须具有至少一个连接于碳的氢，其通过连接羟基被羟化；且当引入桥氧基时，具有至少两个连接于碳的氢。在优选实施方式中，第二或第三碳在与过氧化酶接触前是未取代的。
根据本发明的方法，在脂族烃的（至少）两端彼此独立地引入羟基和/或桥氧基。因此，可以在一端引入羟基，同时在另一端（两者中的另一个端）引入桥氧基，且反之亦然。不可以在脂族烃的同一端引入两个羟基，或两个桥氧基，或一个羟基和一个桥氧基。在实施例1中示出一些组合的实例。
在本发明上下文中，“氧化”意指羟基和/或桥氧基的引入。
相应地，在第一方面，本发明提供在取代或未取代的、直链或支链脂族烃的（至少）两端的第二或第三碳处引入羟基和/或桥氧（酮）基的方法，该脂族烃具有至少5个碳并具有至少一个连接于所述第二或第三碳的氢，该方法包括使脂族烃与过氧化氢和具有过氧化酶活性的多肽接触，其中多肽包括：
a）与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29，优选SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:4具有至少30%同一性的氨基酸序列；以及
b）由一种或多种以下基序所表示的氨基酸序列：
基序I：[FL]XX[YF]S[AN]X[FHY]G[GN]GX[YF]N （SEQ IDNO:9）；
基序II：G[GN]GX[YF]NXX[VA]AX[EH][LF]R    （SEQ ID NO:10）；
基序III：RXXRI[QE][DEQ]S[IM]ATN          （SEQ ID NO:11）；
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基序VI：[TI]XXXLYPNP[TK][GV]             （SEQ ID NO:14）；
基序VII：E[HG]DXSX[ST]RXD                （SEQ ID NO:15）；
优选地，基序VII：E[HG]DXSX[ST]RXD。
在实施方式中，脂族烃不是正己烷或正癸烷。
在优选的实施方式中，脂族烃通过引入两个羟基氧化为（转化为）二醇。更优选地，该两个羟基位于直链脂族烃的各端。
本发明的方法可用于多种目的，如大量化学合成（生物催化），增加脂族烃的水溶性，生物处理（bioremediation），和食品特征的改性。
本发明的方法还可用于多种工业工艺，其中所述氧化反应是有益的。此种用途的实例是纸浆和纸产品的制造，其中存在于木质（树脂）中的烷和其他相关的脂族烃可导致纸浆和纸制造工艺中的沉积问题。这些疏水化合物是纸浆和纸制造工艺内所谓树脂沉积物（pitch deposit）的前体。树脂沉积导致低品质纸浆，并可导致纸浆厂运转的停工。与具有高提取物含量的纸浆相关的特定问题包括流动性问题、纸中的污点（spot）和孔洞、以及纸张破裂（sheet break）。经过氧化酶处理可增加所述化合物的溶解性，从而减轻问题。
本发明的方法的又一用途是，例如，用于炼油厂或炼煤厂，其中过氧化酶催化的氧化可用于改变烃的溶解性、粘性和/或燃烧特征。具体而言，该处理可导致进行该处理的烃的烟点、着火点（kindling point）、燃点（fire point）和沸点的变化。
在大量化学品、农业化学品（包括杀虫剂）、特种化学品和药物的合成中，本发明的方法在将羟基选择性引入底物，从而影响改性的化合物的溶解性方面显然是重要的。此外，选择性氧化为通过有机化学合成和化学酶合成领域中已知的方法进行进一步改性提供了位点。
将天然气彻底加工以去除高级烷烃。此类高级烷烃的氧化可用于改善水溶性，并因此促进通过洗涤天然气流来去除高级烷烃。可在井中或在精炼过程中进行去除。
根据本发明，油废料的氧化会显著改善生物可降解性，并可应用于涉及来自精炼厂的废水处理和污染地面或污染水的生物处理方面。
可用具有过氧化酶活性的固定化的多肽（过氧化酶）进行本发明的方法。
本发明的方法可在水性溶剂（反应介质）、多种醇、醚、其他极性或非极性溶剂、或其混合物中进行。通过研究用于本发明的方法的脂族烃的特征，本领域技术人员可容易地识别溶剂的合适实例。通过提高或降低进行氧化的压力，可在反应温度将溶剂（反应介质）和脂族烃保持在液相中。
根据本发明的方法可在0～90摄氏度，优选5～80摄氏度，更优选10～70摄氏度，甚至更优选15～60摄氏度，最优选20～50摄氏度，且特别是20～40摄氏度的温度进行。
本发明的方法可采用10秒至（至少）24小时，优选1分钟至（至少）12小时，更优选5分钟至（至少）6小时，最优选5分钟至（至少）3小时，且特别是5分钟至（至少）1小时的处理时间。
通过本发明方法产生的二醇（二羟基脂族烃）可用于制备聚氨酯。聚氨酯是由通过氨基甲酸酯（carbamate或urethane）键连接的有机单元的链组成的聚合物。通过在催化剂存在下使单体（具有至少两个异氰酸酯官能官）与另一单体（具有至少两个羟基）反应，经逐步生长聚合来形成聚氨酯聚合物。
在另一方面，本发明提供在取代或未取代的、直链或支链的脂族烃的第二或第三碳处引入桥氧（酮）基的方法，该脂族烃具有至少5个碳并具有至少两个连接于所述第二或第三碳的氢，该方法包括使脂族烃与过氧化氢和具有过氧化酶活性的多肽接触；其中多肽包括：
a）与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29，优选SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:4具有至少30%同一性的氨基酸序列；以及
b）由一种或多种以下基序所表示的氨基酸序列：
基序I：[FL]XX[YF]S[AN]X[FHY]G[GN]GX[YF]N  （SEQ IDNO:9）；
基序II：G[GN]GX[YF]NXX[VA]AX[EH][LF]R    （SEQ IDNO:10）；
基序III：RXXRI[QE][DEQ]S[IM]ATN          （SEQ ID NO:11）；
基序IV：S[IM]ATN[PG][EQN][FM][SDN][FL]   （SEQ ID NO:12）；
基序V：P[PDK][DG]F[HFW]R[AP]             （SEQ ID NO:13）；
基序VI：[TI]XXXLYPNP[TK][GV]             （SEQ ID NO:14）；
基序VII：E[HG]DXSX[ST]RXD                （SEQ ID NO:15）；
优选地，基序VII：E[HG]DXSX[ST]RXD。
在实施方式中，脂族烃不是正己烷或正癸烷。
在又一方面，本发明还提供在直链或支链的脂族烃的末端碳处引入羟基或桥氧基的方法，该脂族烃具有至少5个碳，并且其被羧基取代，该方法包括使脂族烃与过氧化氢和具有过氧化酶活性的多肽接触；其中多肽包括：
a）与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29，优选SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:4具有至少30%同一性的氨基酸序列；以及
b）由一种或多种以下基序所表示的氨基酸序列：
基序I：[FL]XX[YF]S[AN]X[FHY]G[GN]GX[YF]N  （SEQID NO:9）；
基序II：G[GN]GX[YF]NXX[VA]AX[EH][LF]R        （SEQ ID NO:10）；
基序III：RXXRI[QE][DEQ]S[IM]ATN              （SEQ ID NO:11）；
基序IV：S[IM]ATN[PG][EQN][FM][SDN][FL]       （SEQ ID NO:12）；
基序V：P[PDK][DG]F[HFW]R[AP]                 （SEQ ID NO:13）；
基序VI：[TI]XXXLYPNP[TK][GV]       （SEQ ID NO:14）；
基序VII：E[HG]DXSX[ST]RXD          （SEQ ID NO:15）；
优选地，基序VII：E[HG]DXSX[ST]RXD。
在实施方式中，被羧基取代的脂族烃是脂肪酸；优选丁酸（酪酸）、戊酸（缬草酸）、己酸（羊油酸）、庚酸（葡萄花酸）、辛酸（羊脂酸）、壬酸（天竺葵酸）、癸酸（羊蜡酸）、十二酸（月桂酸）、十四酸（肉豆蔻酸）、十六酸（棕榈酸）、十八酸（硬脂酸）、二十酸（花生酸）、亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸。
在实施方式中，被羧基取代的脂族烃不是月桂酸或棕榈酸。
在又一方面，本发明还提供将具有至少5个碳的直链或支链的脂族烃的伯醇改变（氧化）为相应酸的方法，该方法包括使脂族烃的醇与过氧化氢和具有过氧化酶活性的多肽接触；其中多肽包括：
a）与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29，优选SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:4具有至少30%同一性的氨基酸序列；和
b）由一种或多种以下基序所表示的氨基酸序列：
基序I：[FL]XX[YF]S[AN]X[FHY]G[GN]GX[YF]N  （SEQ IDNO:9）；
基序II：G[GN]GX[YF]NXX[VA]AX[EH][LF]R     （SEQ ID NO:10）；
基序III：RXXRI[QE][DEQ]S[IM]ATN           （SEQ ID NO:11）；
基序IV：S[IM]ATN[PG][EQN][FM][SDN][FL]    （SEQ ID NO:12）；
基序V：P[PDK][DG]F[HFW]R[AP]              （SEQ ID NO:13）；
基序VI：[TI]XXXLYPNP[TK][GV]              （SEQ ID NO:14）；
基序VII：E[HG]DXSX[ST]RXD                 （SEQ ID NO:15）；
优选地，基序VII：E[HG]DXSX[ST]RXD。
例如，戊醇可改变（氧化）为戊酸（缬草酸），己醇可改变为己酸（羊油酸），庚醇可改变为庚酸（葡萄花酸），辛醇可改变为辛酸（羊脂酸），壬醇可改变为壬酸（天竺葵酸），癸醇可改变为癸酸（羊蜡酸），十二醇可改变为十二酸（月桂酸），十四醇可改变为十四酸（肉豆蔻酸），十六醇可改变为十六酸（棕榈酸），十八醇可改变为十八酸（硬脂酸），且二十醇可改变为二十酸（花生酸）。
通过以下实施例进一步描述本发明，这些实施例不应解释为限制本发明的范围。
实施例
来自茶树菇的过氧化酶氨基酸序列示为SEQ ID NO:2；且来自灰盖鬼伞的过氧化酶氨基酸序列示为SEQ ID NO:4。
实施例1
十二烷、十四烷和十六烷的酶促氧化
使用茶树菇的细胞外过氧化酶（异构体（isoform）II，44kDa，SEQID NO:2）。酶制品通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳而均质，且呈现1.75的A418/A280比。其比活是117单位·mg-1，其中1单位表示1μmol藜芦基醇在2.5mM H2O2的存在下在23℃和pH7在1分钟内氧化为藜芦醛（ε3109300M-1·cm-1）。
三种烷：十二烷（C12）、十四烷（C14）和十六烷（C16）得自Sigma-Aldrich。以上模型底物（1mM）与茶树菇过氧化酶（1U）的5mL反应在2.5mM H2O2的存在下在25℃于50mM磷酸钠缓冲液（pH7）中进行2小时。底物预先溶于丙酮且加入到缓冲液中（反应中的丙酮浓度为15%）。在对照实验中，底物在相同条件下处理而没有酶。在酶促反应之后，立即在旋转蒸发仪中去除水，且用氯仿回收产物，在氮下干燥，且再溶解于氯仿用于GC-MS分析。使用吡啶存在下的双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺（Supelco）来制备三甲基硅烷基衍生物。
用Varian3800色谱仪进行GC-MS分析，该Varian3800色谱仪与离子阱检测器（Varian4000）连接且使用来自J&W Scientific的中等长度熔融石英DB-5HT毛细管柱（12m×0.25mm内径，0.1μm膜厚），使得能够同时洗脱不同化合物类型。柱温箱（oven）从120℃（1分钟）以10℃每分钟加热至380℃，且保持5分钟。需要时，使用从50℃至110℃（以30℃每分钟）然后至320℃（以6℃每分钟）的其他温度程序。在所有GC-MS分析中，传输管线保持在300℃，注射器从120℃（0.1分钟）以200℃每分钟程控至380℃且保持直到分析结束，且使用氦以2ml每分钟的速率作为载气。
化合物通过碎片质谱法且通过将它们的质谱与Wiley和NIST库和标准物的那些质谱进行对比来识别，且使用相同或相似化合物的响应因子从总离子峰面积中得到定量。当两个峰部分重叠时，使用（基础或其他特定离子的）单离子色谱图来估算化合物丰度。
结果
测试三种饱和烷（十二烷、十四烷和十六烷）作为茶树菇过氧化酶底物。
表1 过氧化酶反应的GC-MS峰面积
Figure BDA0000454054970000161
与十二烷的反应给出在2位和3位的单羟化衍生物。除单羟化衍生物之外，从分子两端的2位和3位处的二羟化物（dihydroxylations）（即，α+1和ω-1/ω-2，或α+2和ω-1/ω-2）也识别为主要化合物。
实施例2
饱和与不饱和脂肪酸的酶促氧化
使用茶树菇的细胞外过氧化酶（异构体II，44kDa，SEQ ID NO:2）。酶制品通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳而均质，且呈现1.75的A418/A280比。其比活是117单位·mg-1，其中1单位表示1μmol藜芦基醇在2.5mM H2O2的存在下在23℃和pH7下在1分钟内氧化为藜芦醛（ε3109300M-1·cm-1）。
饱和与不饱和酸得自Sigma-Aldrich：月桂（十二，C12）酸、肉豆蔻（十四，C14）酸、棕榈（十六，C16）酸、硬脂（十八，C18）酸、花生（二十，C20）酸、月桂烯（顺-9-十二碳烯，C12:1）酸、肉豆蔻脑（顺-9-十四碳烯，C14:1）酸、棕榈油（顺-9-十六碳烯，C16:1）酸、油（顺-9-十八碳烯，C18:1）酸、亚油（顺,顺-9,12-十八碳二烯）酸和二十碳烯（C20:1）酸。以上模型底物（1mM）与茶树菇过氧化酶（1U）的5mL反应在2.5mM H2O2的存在下在25℃于50mM磷酸钠缓冲液（pH7）中进行2小时。底物预先溶于丙酮且加入到缓冲液中（反应中的丙酮浓度为15%）。在对照实验中，底物在相同条件下处理而没有酶。在酶促反应之后，立即在旋转蒸发仪中去除水，且用氯仿回收产物，在氮下干燥，且再溶解于氯仿用于GC-MS分析。使用吡啶存在下的双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺（Supelco）来制备三甲基硅烷基衍生物。
用Varian3800色谱仪进行GC-MS分析，该Varian3800色谱仪与离子阱检测器（Varian4000）连接且使用来自J&W Scientific的中等长度熔融石英DB-5HT毛细管柱（12m×0.25mm内径，0.1μm膜厚），使得能够同时洗脱不同化合物类型。柱温箱从120℃（1分钟）以10℃每分钟加热至380℃，且保持5分钟。需要时，使用从50℃至110℃（以30℃每分钟）然后至320℃（以6℃每分钟）的其他温度程序。在所有GC-MS分析中，传输管线保持在300℃，注射器从120℃（0.1分钟）以200℃每分钟程控至380℃且保持直到分析结束，且使用氦以2ml每分钟的速率作为载气。
化合物通过碎片质谱法且通过将它们的质谱与Wiley和NIST库和标准物的那些质谱进行对比来识别，且使用相同或相似化合物的响应因子从总离子峰面积中得到定量。当两个峰部分重叠时，使用（基础或其他特定离子的）单离子色谱图来估算化合物丰度。
结果
测试十一个饱和与不饱和脂肪酸作为茶树菇过氧化酶的底物，且所有脂肪酸示出对于酶的反应性。在饱和与不饱和脂肪酸的反应中通过GC-MS识别的不同单羟化、酮基、二羟化、酮基-羟基和二羧酸衍生物的丰度（相对百分比）列在表2中。
表2 反应产物的相对丰度
Figure BDA0000454054970000181
观察到所有测试的游离脂肪酸的末端甲基（ωOH）的氧化，在某些情况下，其进一步氧化，导致二羧酸（二-COOH）的形成。
实施例3
40%丙酮中十四烷的酶促氧化
使用茶树菇的细胞外过氧化酶（异构体II，44kDa，SEQ ID NO:2）和灰盖鬼伞的重组过氧化酶（WT392，SEQ ID NO:4）。通过藜芦基醇的氧化确定制品的活性。1单位表示1μmol藜芦基醇在2.5mM H2O2的存在下在23℃和pH7下在1分钟内氧化为藜芦醛（ε3109300M-1·cm-1）。
十四烷（C14）得自Sigma-Aldrich。以上模型底物（0.3mM）与1U过氧化酶的5mL反应在H2O2的存在下在40℃于50mM磷酸钠缓冲液（pH7）中进行2小时。H2O2的浓度在应用茶树菇过氧化酶时为2.5mM且在使用灰盖鬼伞过氧化酶时为0.5mM。底物预先溶于丙酮且加入到缓冲液中（反应中的丙酮浓度为40%）。在对照实验中，底物在相同条件下处理而没有酶。在酶促反应之后，立即在旋转蒸发仪中去除水，且用氯仿回收产物，在氮下干燥，且再溶解于氯仿用于GC-MS分析。使用吡啶存在下的双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺（Supelco）来制备三甲基硅烷基衍生物。
用Varian3800色谱仪进行GC-MS分析，该Varian3800色谱仪与离子阱检测器（Varian4000）连接且使用来自J&W Scientific的中等长度熔融石英DB-5HT毛细管柱（12m×0.25mm内径，0.1μm膜厚），使得能够同时洗脱不同化合物类型。柱温箱从120℃（1分钟）以10℃每分钟加热至380℃，且保持5分钟。需要时，使用从50℃至110℃（以30℃每分钟）然后至320℃（以6℃每分钟）的其他温度程序。在所有GC-MS分析中，传输管线保持在300℃，注射器从120℃（0.1分钟）以200℃每分钟程控至380℃且保持直到分析结束，且使用氦以2ml每分钟的速率作为载气。
化合物通过碎片质谱法且通过将它们的质谱与Wiley和NIST库和标准物的那些质谱进行对比来识别，且使用相同或相似化合物的响应因子从总离子峰面积中得到定量。当两个峰部分重叠时，使用（基础或其他特定离子的）单离子色谱图来估算化合物丰度。
结果
产生于饱和烷烃十四烷（C14）的羟基化的色谱图针对灰盖鬼伞过氧化酶示于图1且针对茶树菇过氧化酶示于图2。
与十四烷的反应导致在2位和3位处的单羟化衍生物（ω-1和ω-2OH）和在从分子两端的2位和3位处的二羟化物（即，ω-1/ω-1、ω-2/ω-2或ω-1/ω-2二OH）。
实施例4
20%丙酮中1-十四醇的酶促氧化
使用茶树菇的细胞外过氧化酶（异构体II，44kDa，SEQ ID NO:2）和灰盖鬼伞的重组过氧化酶（WT392,SEQ ID NO:4）。通过藜芦基醇的氧化确定制品的活性。1单位表示1μmol藜芦基醇在2.5mM H2O2的存在下在23℃和pH7下在1分钟内氧化为藜芦醛（ε3109300M-1·cm-1）。
1-十四醇（C14）得自Sigma-Aldrich。以上模型底物（0.1mM）与1U过氧化酶的5mL反应在H2O2的存在下在30℃于50mM磷酸钠缓冲液（pH7）中进行1分钟。H2O2的浓度在应用茶树菇过氧化酶时为2.5mM且在使用灰盖鬼伞过氧化酶时为0.5mM。底物预先溶于丙酮且加入到缓冲液中（反应中的丙酮浓度为20%）。在对照实验中，底物在相同条件下处理而没有酶。在酶促反应之后，立即在旋转蒸发仪中去除水，且用氯仿回收产物，在氮下干燥，且再溶解于氯仿用于GC-MS分析。使用吡啶存在下的双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺（Supelco）来制备三甲基硅烷基衍生物。
用Varian3800色谱仪进行GC-MS分析，该Varian3800色谱仪与离子阱检测器（Varian4000）连接且使用来自J&W Scientific的中等长度熔融石英DB-5HT毛细管柱（12m×0.25mm内径，0.1μm膜厚），使得能够同时洗脱不同化合物类型。柱温箱从120℃（1分钟）以10℃每分钟加热至380℃，且保持5分钟。需要时，使用从50℃至110℃（以30℃每分钟）然后至320℃（以6℃每分钟）的其他温度程序。在所有GC-MS分析中，传输管线保持在300℃，注射器从120℃（0.1分钟）以200℃每分钟程控至380℃且保持直到分析结束，且使用氦以2ml每分钟的速率作为载气。
化合物通过碎片质谱法且通过将它们的质谱与Wiley和NIST库和标准物的那些质谱进行对比来识别，且使用相同或相似化合物的响应因子从总离子峰面积中得到定量。当两个峰部分重叠时，使用（基础或其他特定离子的）单离子色谱图来估算化合物丰度。
结果
产生于1-十四醇（Alc）的氧化的色谱图针对灰盖鬼伞过氧化酶示于图3且针对茶树菇过氧化酶示于图4。
与1-十四醇的反应导致形成1-十四酸（Acd）和羟化癸酸（ω-1OHAcd和ω-2OH Acd）和两个二羟化产物（ω-1OH Alc和ω-2OH Alc）。
Figure IDA0000454055030000011
Figure IDA0000454055030000031
Figure IDA0000454055030000041
Figure IDA0000454055030000051
Figure IDA0000454055030000061
Figure IDA0000454055030000071
Figure IDA0000454055030000081
Figure IDA0000454055030000101
Figure IDA0000454055030000111
Figure IDA0000454055030000121
Figure IDA0000454055030000131
Figure IDA0000454055030000141
Figure IDA0000454055030000151
Figure IDA0000454055030000171
Figure IDA0000454055030000201
Figure IDA0000454055030000211
Figure IDA0000454055030000231
Figure IDA0000454055030000241
Figure IDA0000454055030000251
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Claims (15)

1.一种在取代或未取代的、直链或支链的脂族烃的至少两端的第二或第三碳处引入羟基或酮基的方法，所述脂族烃具有至少5个碳并具有至少一个连接于所述第二或第三碳的氢，所述方法包括使所述脂族烃与过氧化氢和具有过氧化酶活性的多肽接触，其中所述多肽包括：
a）与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29具有至少30%同一性的氨基酸序列；以及
b）由一种或多种以下基序所表示的氨基酸序列：
基序I：[FL]XX[YF]S[AN]X[FHY]G[GN]GX[YF]N （SEQ IDNO:9）；
基序II：G[GN]GX[YF]NXX[VA]AX[EH][LF]R    （SEQ ID NO:10）；
基序III：RXXRI[QE][DEQ]S[IM]ATN          （SEQ ID NO:11）；
基序IV：S[IM]ATN[PG][EQN][FM][SDN][FL]   （SEQ ID NO:12）；
基序V：P[PDK][DG]F[HFW]R[AP]             （SEQ ID NO:13）；
基序VI：[TI]XXXLYPNP[TK][GV]             （SEQ ID NO:14）；
基序VII：E[HG]DXSX[ST]RXD                （SEQ ID NO:15）。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二或第三碳在与所述过氧化酶接触前是未取代的。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述多肽包括以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29的成熟多肽，优选SEQ ID NO:2或4的成熟多肽，具有至少35%同一性，优选至少40%同一性，更优选至少45%同一性，更优选至少50%同一性，更优选至少55%同一性，更优选至少60%同一性，更优选至少65%同一性，更优选至少70%同一性，更优选至少75%同一性，更优选至少80%同一性，更优选至少85%同一性，最优选至少90%同一性，且特别至少95%同一性。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中所述多肽包括以下或由以下组成：SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29的氨基酸序列，优选SEQ IDNO:2或4的氨基酸序列；或其具有过氧化酶活性的片段。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中所述脂族烃的取代基选自卤素、羟基、羧基、氨基、硝基、氰基、巯基、磺酰基、甲酰基、乙酰基、甲氧基、乙氧基、苯基、苄基、二甲苯基、氨基甲酰基和氨磺酰基。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其中所述取代基选自氯、羟基、羧基和磺酰基；特别是氯和羧基。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其中所述脂族烃是烷烃。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述烷烃是戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、十一烷、十二烷、十三烷、十四烷、十五烷或十六烷、或其异构体。
9.根据权利要求7所述的方法，其中所述烷是十一烷、十二烷、十三烷、十四烷、十五烷或十六烷、或其异构体。
10.根据权利要求1～9中任一项所述的方法，其中所述脂族烃是未取代的。
11.根据权利要求1～10中任一项所述的方法，其中所述脂族烃是直链的。
12.根据权利要求1～11中任一项所述的方法，其中通过引入两个羟基将所述脂族烃转化为二醇。
13.一种制备聚氨酯的酶法，包括根据权利要求12所述的方法将脂族烃转化为二醇，以及使用所述二醇制备聚氨酯。
14.根据权利要求12所制备的二醇用于制备聚氨酯的用途。
15.过氧化酶用于在脂族烃的两个或更多端的第二或第三碳处引入羟基或酮基的用途。
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