CN103698449A - 气相色谱-质谱检测细胞内外液中有机酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种气相色谱-质谱检测细胞内外液中有机酸的方法，属于生物化学检验测定技术领域。本发明检测方法步骤包括：（1）取发酵液，高速离心，分别收集细胞和细胞外液；（2）细胞内代谢物样品制备，将收集的菌体用生理盐水清洗，冷甲醇溶解后超声破碎，低温萃取，离心收集萃取上清液，加入内标物，低温真空烘干；（3）细胞外液样品制备，用乙腈除去胞外液中蛋白，涡旋振荡，再离心收集上清，加入内标物，低温真空烘干；（4）样品衍生，加入糖衍生剂、氨基酸衍生剂；（5）气相色谱-质谱分析和数据采集。本发明具有样品处理简单，操作简便，检测时间短，灵敏度高，检测结果重复性高，可实现多个样品制备等优点。
Description
技术领域
本发明属于生物化学检验测定技术领域，特别是涉及一种气相色谱-质谱检测细胞内外液中有机酸的方法。
背景技术
在利用气相色谱-质谱检测有机酸代谢物方面，目前已有相关技术报道，如专利201210046953.2，公布了一种气相色谱－质谱检测尿糖的方法，包括如下步骤：（1）对待检尿液样本完成尿酶处理；（2）加入内标品，采用冷冻乙醇进行沉淀蛋白的处理，将样本吹干；（3）对上述样本进行甲基硅烷化衍生处理；（4）采用上述1-3的步骤处理标准糖，得到标准糖样本；（5）采用气相色谱－质谱联用仪对标准糖样本和待检尿液样本进行检测；（6）以标准糖样本的检测结果作为参比曲线，用常规算法对待检尿液样本的糖进行定量。该专利发明主要应用领域为尿样检测，且该检测方法仅局限于糖代谢物的检测。
对于发酵液中微生物胞内、胞外代谢物的检测研究，可以揭示微生物在发酵条件下的代谢规律，尤其是发酵条件对于微生物目标产物的影响规律。掌握微生物的代谢规律可以不仅有利的促进目标产物的产量提升，而且可确定菌体内的代谢通量分布，进而利用基因工程手段实现菌体内代谢途径的优化与重构，实现目标产物高效生物合成。
目前对于发酵液中的代谢物分析检测方法局限用于特定某类物质，不可实现多类代谢物同时检测。由于发酵液中各成分含量复杂多样，对于样品的处理方法很关键，目前还没有相关发酵液中细胞内、细胞外代谢物的系统处理检测方法，使得开发一种更为灵敏的、广谱的、通用的发酵代谢物检测方法，鉴定各种谱峰对映的化合物结构，以及与其它虚拟模型的整合，成为微生物代谢组研究的热点。
发明内容
本发明的目的是提供一种气相色谱-质谱检测细胞内外液中有机酸的方法，弥补目前在微生物发酵中对代谢物系统检测方法的空白，克服现有检测技术干扰因素很多、操作繁琐、测试成本高、灵敏度低、检测范围窄等缺点。
本发明的方案是通过这样实现的：一种气相色谱-质谱检测细胞内外液中有机酸的方法，其特征在于，检测方法步骤包括：
（1）取发酵液，高速离心，分别收集菌体和上清液Ⅰ。
（2）细胞内代谢物样品制备：取步骤1）得到的菌体，用生理盐水清洗2~3次，冷甲醇溶解后超声破碎至细胞裂解，得到裂解液，低温萃取裂解液，离心收集50~200ul萃取后裂解上清液Ⅱ，加入内标物核糖醇溶液，裂解上清液Ⅱ体积与内标物核糖醇重量比例为50~200ul:20μg，室温真空烘干，得到细胞内代谢物样品Ⅰ。
（3）细胞外液样品制备：取60~350ul步骤1）得到的上清液Ⅰ，在清液Ⅰ中加入乙腈除去蛋白，上清液Ⅰ与乙腈体积比为1:0.5~1.5，涡旋振荡，再离心收集上清液Ⅲ，加入内标物核糖醇溶液，上清液Ⅲ体积与内标物核糖醇重量比例为50~300ul：20μg，室温真空烘干，得到细胞外液样品Ⅱ。
（4）样品衍生：在步骤2）和步骤3）得到的样品Ⅰ和样品Ⅱ中，分别加入50~150ul糖衍生剂，恒温放置1.5~4h，再分别加入50~150ul氨基酸衍生剂，恒温放置过夜，衍生完毕，
分别离心衍生后的样品Ⅰ和样品Ⅱ，对应收集各自上清得到待测胞内样品Ⅰ和待测胞外样品Ⅱ。
（5）利用气相色谱-质谱对步骤4）得到的待测胞内样品Ⅰ和待测胞外样品Ⅱ，分别进行分析和数据采集。
作为本发明的进一步改进，所述菌体其取样量为用冷甲醇溶解后生物量干重达0.2~1.0g/ml；所述的冷甲醇为经过冷浴槽预冷至-40℃；所述低温萃取为-40℃至-50℃下萃取2~7h。
作为本发明的进一步改进，所述糖衍生剂为0.1~0.3mg甲氧胺盐酸溶于10ml吡啶溶液中配制而得；所述氨基酸衍生剂为50~200ul三甲基氯硅烷溶于10ml的三氟乙酰胺中。
作为本发明的进一步改进，所述气相色谱-质谱其仪器分析条件为：气相色谱：色谱柱为30 m×0.25 mm的HP-5MS或者DB-5MS毛细管柱，进样口温度300℃，检测器温度250℃，柱箱升温程序平衡时间3 min→80℃维持1min →2℃/min升温至100℃→15℃/min升温至220℃→30℃/min升温至300℃→300℃维持3 min，进样体积1μL；质谱：离子源EI，检测器为四级杆，电离能70 eV，离子源表面温度280℃。
作为本发明的进一步改进，该方法应用于检测酵母菌、乳酸菌、梭菌、霉菌的生物发酵过程中的发酵液中细胞内外液的有机酸。
作为本发明的进一步改进，所述有机酸为琥珀酸、苹果酸、柠檬酸、丙酮酸、富马酸。
本发明的实质性特点和显著进步是：（1）该方法可以同步检测发酵液中细胞内和细胞外中有机酸类物质的检测，不需要对发酵液进行多次复杂处理，节约时间和简化操作步骤，及时得到发酵过程中微生物代谢规律，分析胞内外代谢流量。（2）该方法采用冷甲醇萃取细胞内代谢物法，其萃取效果优良，获得细胞内较多代谢物种类，有利于代谢规律的分析。（3）样品分析得到的色谱峰分析效果良好，可对琥珀酸、苹果酸、柠檬酸、丙酮酸、富马酸等有机酸实现检测。
具体实施方式
下面将通过实施例对本发明一种气相色谱-质谱检测细胞内外液中有机酸的方法进一步的描述，这些描述并不是对本发明内容作进一步的限定。
以下实施例中离心条件为：-4℃下10000 rpm离心10 min。
以下实施例中气相色谱-质谱其仪器分析条件为：气相色谱：色谱柱为30 m×0.25 mm的HP-5MS或者DB-5MS毛细管柱，进样口温度300℃，检测器温度250℃，柱箱升温程序平衡时间3 min→80℃维持1min →2℃/min升温至100℃→15℃/min升温至220℃→30℃/min升温至300℃→300℃维持3 min，进样体积1μL；质谱：离子源EI，检测器为四级杆，电离能70 eV，离子源表面温度280℃。
以下实施例皆可实现对琥珀酸、苹果酸、柠檬酸、丙酮酸、富马酸等有机酸进行检测。
实施例1
取酵母菌发酵液。
（1）细胞内代谢物样品制备：取5ml发酵液，离心得到菌体，用生理盐水清洗菌体2次，-40℃冷甲醇溶解后生物量干重达0.2g/ml，超声破碎至细胞裂解，得到裂解液，低温萃取裂解液，低温条件为：-40℃至-50℃下萃取4h，离心收集150ul萃取后裂解上清液Ⅰ，加入内标物核糖醇溶液，裂解上清液Ⅰ体积与内标物核糖醇重量比例为150ul:20μg，室温真空烘干，得到细胞内代谢物样品Ⅰ。
（2）细胞外液样品制备：取发酵液，离心得到上清液Ⅱ，取300ul上清液Ⅱ，在清液Ⅱ中加入乙腈除去蛋白，上清液Ⅱ与乙腈体积比为1:1.2，涡旋振荡，再离心收集得上清液Ⅲ，加入内标物核糖醇溶液，上清液Ⅲ体积与内标物核糖醇重量比例为100ul：20μg，室温真空烘干，得到细胞外液样品Ⅱ。
（3）样品衍生：在步骤1）和步骤2）得到的样品Ⅰ和样品Ⅱ中，分别加入100ul糖衍生剂（糖衍生剂为0.1mg甲氧胺盐酸溶于10ml吡啶溶液中配制而得），恒温放置1.5h，再分别加入100ul氨基酸衍生剂（氨基酸衍生剂为100ul三甲基氯硅烷溶于10ml的三氟乙酰胺中配制而得），恒温放置过夜，衍生完毕，分别离心衍生后的样品Ⅰ和样品Ⅱ，对应收集各自上清得到待测胞内样品Ⅰ和待测胞外样品Ⅱ。
（4）按照气相色谱-质谱其仪器分析条件，对待测胞内样品Ⅰ和待测胞外样品Ⅱ进行分析和数据采集。
实施例2
取乳酸菌发酵液。
（1）细胞内代谢物样品制备：取5ml发酵液，离心得到菌体，用生理盐水清洗菌体3次，-40℃冷甲醇溶解后生物量干重达1.0g/ml，超声破碎至细胞裂解，得到裂解液，低温萃取裂解液，低温条件为：-40℃至-50℃下萃取5h，离心收集100ul萃取后裂解上清液Ⅰ，加入内标物核糖醇溶液，裂解上清液Ⅰ体积与内标物核糖醇重量比例为100ul:20μg，室温真空烘干，得到细胞内代谢物样品Ⅰ。
（2）细胞外液样品制备：取发酵液，离心得到上清液Ⅱ，取350ul上清液Ⅱ，在清液Ⅱ中加入乙腈除去蛋白，上清液Ⅱ与乙腈体积比为1:0.7，涡旋振荡，再离心收集得上清液Ⅲ，加入内标物核糖醇溶液，上清液Ⅲ体积与内标物核糖醇重量比例为200ul：20μg，室温真空烘干，得到细胞外液样品Ⅱ。
（3）样品衍生：在步骤1）和步骤2）得到的样品Ⅰ和样品Ⅱ中，分别加入50ul糖衍生剂（糖衍生剂为0.3mg甲氧胺盐酸溶于10ml吡啶溶液中配制而得），恒温放置2.0h，再分别加入150ul氨基酸衍生剂（氨基酸衍生剂为150ul三甲基氯硅烷溶于10ml的三氟乙酰胺中配制而得），恒温放置过夜，衍生完毕，分别离心衍生后的样品Ⅰ和样品Ⅱ，对应收集各自上清得到待测胞内样品Ⅰ和待测胞外样品Ⅱ。
（4）按照气相色谱-质谱其仪器分析条件，对待测胞内样品Ⅰ和待测胞外样品Ⅱ进行分析和数据采集。
实施例3
取梭菌发酵液。
（1）细胞内代谢物样品制备：取5ml发酵液，离心得到菌体，用生理盐水清洗菌体3次，-40℃冷甲醇溶解后生物量干重达0.6g/ml，超声破碎至细胞裂解，得到裂解液，低温萃取裂解液，低温条件为：-40℃至-50℃下萃取3h，离心收集200ul萃取后裂解上清液Ⅰ，加入内标物核糖醇溶液，裂解上清液Ⅰ体积与内标物核糖醇重量比例为200ul:20μg，室温真空烘干，得到细胞内代谢物样品Ⅰ。
（2）细胞外液样品制备：取发酵液，离心得到上清液Ⅱ，取60ul上清液Ⅱ，在清液Ⅱ中加入乙腈除去蛋白，上清液Ⅱ与乙腈体积比为1:1.5，涡旋振荡，再离心收集得上清液Ⅲ，加入内标物核糖醇溶液，上清液Ⅲ体积与内标物核糖醇重量比例为50ul：20μg，室温真空烘干，得到细胞外液样品Ⅱ。
（3）样品衍生：在步骤1）和步骤2）得到的样品Ⅰ和样品Ⅱ中，分别加入150ul糖衍生剂（糖衍生剂为0.15mg甲氧胺盐酸溶于10ml吡啶溶液中配制而得），恒温放置2.5h，再分别加入50ul氨基酸衍生剂（氨基酸衍生剂为200ul三甲基氯硅烷溶于10ml的三氟乙酰胺中配制而得），恒温放置过夜，衍生完毕，分别离心衍生后的样品Ⅰ和样品Ⅱ，对应收集各自上清得到待测胞内样品Ⅰ和待测胞外样品Ⅱ。
（4）按照气相色谱-质谱其仪器分析条件，对待测胞内样品Ⅰ和待测胞外样品Ⅱ进行分析和数据采集。
实施例4
取霉菌发酵液。
（1）细胞内代谢物样品制备：取5ml发酵液，离心得到菌体，用生理盐水清洗菌体2次，-40℃冷甲醇溶解后生物量干重达0.8g/ml，超声破碎至细胞裂解，得到裂解液，低温萃取裂解液，低温条件为：-40℃至-50℃下萃取2h，离心收集50ul萃取后裂解上清液Ⅰ，加入内标物核糖醇溶液，裂解上清液Ⅰ体积与内标物核糖醇重量比例为50ul:20μg，室温真空烘干，得到细胞内代谢物样品Ⅰ。
（2）细胞外液样品制备：取发酵液，离心得到上清液Ⅱ，取200ul上清液Ⅱ，在清液Ⅱ中加入乙腈除去蛋白，上清液Ⅱ与乙腈体积比为1:1.0，涡旋振荡，再离心收集得上清液Ⅲ，加入内标物核糖醇溶液，上清液Ⅲ体积与内标物核糖醇重量比例为150ul：20μg，室温真空烘干，得到细胞外液样品Ⅱ。
（3）样品衍生：在步骤1）和步骤2）得到的样品Ⅰ和样品Ⅱ中，分别加入120ul糖衍生剂（糖衍生剂为0.2mg甲氧胺盐酸溶于10ml吡啶溶液中配制而得），恒温放置3.0h，再分别加入80ul氨基酸衍生剂（氨基酸衍生剂为50ul三甲基氯硅烷溶于10ml的三氟乙酰胺中配制而得），恒温放置过夜，衍生完毕，分别离心衍生后的样品Ⅰ和样品Ⅱ，对应收集各自上清得到待测胞内样品Ⅰ和待测胞外样品Ⅱ。
（4）按照气相色谱-质谱其仪器分析条件，对待测胞内样品Ⅰ和待测胞外样品Ⅱ进行分析和数据采集。
实施例5
取酵母菌发酵液。
（1）细胞内代谢物样品制备：取5ml发酵液，离心得到菌体，用生理盐水清洗菌体3次，-40℃冷甲醇溶解后生物量干重达0.5g/ml，超声破碎至细胞裂解，得到裂解液，低温萃取裂解液，低温条件为：-40℃至-50℃下萃取3h，离心收集200ul萃取后裂解上清液Ⅰ，加入内标物核糖醇溶液，裂解上清液Ⅰ体积与内标物核糖醇重量比例为150ul:20μg，室温真空烘干，得到细胞内代谢物样品Ⅰ。
（2）细胞外液样品制备：取发酵液，离心得到上清液Ⅱ，取300ul上清液Ⅱ，在清液Ⅱ中加入乙腈除去蛋白，上清液Ⅱ与乙腈体积比为1:0.5，涡旋振荡，再离心收集得上清液Ⅲ，加入内标物核糖醇溶液，上清液Ⅲ体积与内标物核糖醇重量比例为300ul：20μg，室温真空烘干，得到细胞外液样品Ⅱ。
（3）样品衍生：在步骤1）和步骤2）得到的样品Ⅰ和样品Ⅱ中，分别加入100ul糖衍生剂（糖衍生剂为0.2mg甲氧胺盐酸溶于10ml吡啶溶液中配制而得），恒温放置4.0h，再分别加入120ul氨基酸衍生剂（氨基酸衍生剂为120ul三甲基氯硅烷溶于10ml的三氟乙酰胺中配制而得），恒温放置过夜，衍生完毕，分别离心衍生后的样品Ⅰ和样品Ⅱ，对应收集各自上清得到待测胞内样品Ⅰ和待测胞外样品Ⅱ。
（4）按照气相色谱-质谱其仪器分析条件，对待测胞内样品Ⅰ和待测胞外样品Ⅱ进行分析和数据采集。
Claims (7)
1.一种气相色谱-质谱检测细胞内外液中有机酸的方法，其特征在于，检测方法步骤包括：
（1）取发酵液，高速离心，分别收集菌体和上清液Ⅰ；
（2）细胞内代谢物样品制备：取步骤1）得到的菌体，用生理盐水清洗2~3次，冷甲醇溶解后超声破碎至细胞裂解，得到裂解液，低温萃取裂解液，离心收集50~200ul萃取后裂解上清液Ⅱ，加入内标物核糖醇溶液，裂解上清液Ⅱ体积与内标物核糖醇重量比例为50~200ul:20μg，室温真空烘干，得到细胞内代谢物样品Ⅰ；
（3）细胞外液样品制备：取60~350ul步骤1）得到的上清液Ⅰ，在清液Ⅰ中加入乙腈除去蛋白，上清液Ⅰ与乙腈体积比为1:0.5~1.5，涡旋振荡，再离心收集上清液Ⅲ，加入内标物核糖醇溶液，上清液Ⅲ体积与内标物核糖醇重量比例为50~300ul：20μg，室温真空烘干，得到细胞外液样品Ⅱ；
（4）样品衍生：在步骤2）和步骤3）得到的样品Ⅰ和样品Ⅱ中，分别加入50~150ul糖衍生剂，恒温放置1.5~4h，再分别加入50~150ul氨基酸衍生剂，恒温放置过夜，衍生完毕，分别离心衍生后的样品Ⅰ和样品Ⅱ，对应收集各自上清得到待测胞内样品Ⅰ和待测胞外样品Ⅱ；
（5）利用气相色谱-质谱对步骤4）得到的待测胞内样品Ⅰ和待测胞外样品Ⅱ，分别进行分析和数据采集。
2.根据权利要求1所述的一种气相色谱-质谱检测细胞内外液中有机酸的方法，其特征在于，所述菌体其取样量为用冷甲醇溶解后生物量干重达0.2~1.0g/ml；所述的冷甲醇为经过冷浴槽预冷至-40℃；所述低温萃取为-40℃至-50℃下萃取2~7h。
3.根据权利要求1或2所述的一种气相色谱-质谱检测细胞内外液中有机酸的方法，其特征在于，所述糖衍生剂为0.1~0.3mg甲氧胺盐酸溶于10ml吡啶溶液中配制而得；所述氨基酸衍生剂为50~200ul三甲基氯硅烷溶于10ml的三氟乙酰胺中。
4.根据权利要求3所述的一种气相色谱-质谱检测细胞内外液中有机酸的方法，其特征在于，所述气相色谱-质谱其仪器分析条件为：气相色谱：色谱柱为30 m×0.25 mm的HP-5MS或者DB-5MS毛细管柱，进样口温度300℃，检测器温度250℃，柱箱升温程序平衡时间3 min→80℃维持1min →2℃/min升温至100℃→15℃/min升温至220℃→30℃/min升温至300℃→300℃维持3 min，进样体积1μL；质谱：离子源EI，检测器为四级杆，电离能70 eV，离子源表面温度280℃。
5.根据权利要求4所述一种气相色谱-质谱检测细胞内外液中有机酸的方法，其特征在于，该方法应用于检测酵母菌、乳酸菌、梭菌、霉菌的生物发酵过程中的发酵液细胞内外液中的有机酸。
6.根据权利要求1~2或4~5任一项所述的一种气相色谱-质谱检测细胞内外液中有机酸的方法，其特征在于，所述有机酸为琥珀酸、苹果酸、柠檬酸、丙酮酸、富马酸。
7.根据权利要求3所述的一种气相色谱-质谱检测细胞内外液中有机酸的方法，其特征在于，所述有机酸为琥珀酸、苹果酸、柠檬酸、丙酮酸、富马酸。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20140402 |