CN103690550B - 从油茶皂素中分离的化合物的抗癌作用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及从油茶皂素中分离的化合物的抗癌作用，具体的说是涉及油茶皂素中的化合物对人胃癌SGC-7901细胞的增殖抑制及细胞凋亡作用。
Description
技术领域
本发明涉及从油茶皂素中分离的化合物的抗癌作用，具体的说是涉及油茶皂素中的化合物对人胃癌SGC-7901细胞的增殖抑制及细胞凋亡作用。
背景技术
油茶系山茶科山茶属油茶组植物，为野生木本油科植物。油茶皂素是从油茶种粕中提炼出来的，中国专利专利号200810011095.1提供了一种从油茶种粕中制备油茶皂素的制备方法，油茶皂素为油茶中皂苷类成分的总称。
近年来，随着肿瘤基础研究与临床应用研究的不断深入，化疗药物的使用也越来越广泛。但是，目前绝大多数常用化疗药物如：顺铂、5′-氟尿嘧啶、博来霉素、长春新碱等，虽然有较好疗效却缺乏选择性抗肿瘤作用，且化疗的毒副作用较大，不能使病人的治疗达到预期的效果。例如，中国学术期刊《陕西科技大学学报》第31卷第2期2013年4月公开发表的“红毛七中三萜皂苷类化学成分生物活性研究”中发现，从红毛七中分离出与油茶皂素中相同的化合物-常春藤皂苷类化合物，同时，从研究中发现这种化合物只具有抗炎、阵痛的疗效，并未发现对更深层次的肿瘤癌细胞有任何抑制作用。
基于此，科学家们在研制了油茶皂素的基础上，从油茶皂素中分离提取的化合物来对癌细胞进行抑制，而目前利用这两种五环三萜类皂苷[常春藤皂苷元-3-O-β-D-葡萄吡喃糖-(1→2)-α-L-阿拉伯吡喃糖苷(化合物A)、常春藤皂苷元-28-O-α-L-鼠李吡喃糖-(1→4)-(1→6)-β-D-葡萄吡喃糖苷(化合物B)]对肿瘤细胞的活性研究比较少，甚至无处可见。所述的化合物A、B分子式分别为：
其中，化合物A中glc代表-β-D-葡萄吡喃糖，ara(p)代表α-L-阿拉伯吡喃糖；化合物B中glc代表-β-D-葡萄吡喃糖，rha代表α-L-鼠李吡喃糖，coo代表在28位成酯。
发明内容
鉴于上述背景技术所涉及到的技术缺陷，本发明的目的是提供了从油茶皂素中分离的化合物的抗癌作用。
因此，本发明另一方面提供了能够证明油茶皂素化合物A、B对人胃癌SGC-7901细胞的增殖抑制作用及诱导细胞凋亡的方法。
说明书附图
图1为化合物A对人胃癌SGC-7901细胞的增殖活性影响的数据分析。
图2为化合物B对人胃癌SGC-7901细胞的增殖活性影响的数据分析。
图3为空白组(1)、化合物A(20、50μg m L-1)组(F、C)、化合物B(50、100μg m L-1)组(D、E)的Hoechst33342染色结果。
图4为空白组(1)、化合物A(20、50μg m L-1)组(F、C)、化合物B(50、100、150μg m L-1)组(D、E、G)的细胞凋亡情况。
具体实施方式
本发明选用人源胃癌SGC-7901细胞株为癌细胞载体，研究发现油茶皂素中常春藤皂苷元-3-O-β-D-葡萄吡喃糖-(1→2)-α-L-阿拉伯吡喃糖苷(化合物A)、常春藤皂苷元-28-O-α-L-鼠李吡喃糖-(1→4)-(1→6)-β-D-葡萄吡喃糖苷(化合物B)对人胃癌SGC-7901细胞具有明显抑制作用，同时，均可诱导SGC-7901细胞的早期凋亡。
因此，本发明另一方面提供了能够证明油茶皂素化合物A、B对人胃癌SGC-7901细胞的增殖抑制作用及诱导凋亡的方法。
为了更清楚地说明本发明，现结合如下实施例进行详细说明。
实施例
1、材料和方法
1.1材料、仪器和试剂
1.1.1细胞株
人源胃癌细胞株(SGC-7901)，购自武汉大学典型培养物保藏中心。
1.1.2主要仪器
CK40型倒置显微镜、荧光显微镜(日本OLym-pus)；
RT-2100C酶标仪(深圳雷杜生命科学股份有限公司)；
流式细胞仪(美国BD Biosciences)；
AnnexinV-FITC／PI流式双染试剂盒。
1.1.3
主要试剂
RPMI-1640干粉培养基、胰蛋白酶、胎牛血清(美国Gibco)；
四氮唑蓝(MTT，北京泛基诺生物科技有限公司)。
1.1.4材料
油茶皂素化合物A、B(自制)；
人参皂苷Rg3(上海源叶生物科技有限公司，规格：20mg)。
1.2实验方法
1.2.1细胞培养
常规传代培养，人胃癌SGC-7901细胞株用含有10％胎牛血清的RPMI1640培养液培养。同时加入0.1mgmL-1链霉素和100UmL-1青霉素，于37℃、5％CO2培养箱中全湿培养，每2-3天换液一次，使细胞保持在对数生长期。
1.2.2噻唑蓝(MTT)法测定细胞存活率
在96孔板中接种密度为2×105mL-1的人胃癌SGC-7901细胞，每孔200μL，培养24h，使细胞处于亚融合状态；向其加入不同浓度的油茶皂素化合物A(5、10、20、50、100μgmL-1)、油茶皂素化合物B(20、50、100、150、200μgmL-1)以及80μgmL-1人参皂苷Rg3(对照组)，同时设定空白组。每个时间点的每个浓度均设置5个复孔，继续孵育12、24、48h，吸弃每孔内培养基，每孔加入20μL MTT，加入新鲜培养基至200μL，继续培养4h，吸弃培养基，每孔加入150μL DMSO，用酶标仪于570nm处测定吸光度，重复实验3次。
1.2.3实验结果
油茶皂素化合物A、B可明显抑制人胃癌细胞的增殖，且随浓度的增加，抑制率也随之增加，同时随着作用时间的增加，抑制率呈现出微弱的增加趋势。
(1)油茶皂素化合物A对人胃癌SGC-7901细胞增殖抑制作用，如图1所示，5～100μgmL-1，油茶皂素化合物A对人胃癌SGC-7901细胞的抑制作用表现出明显的剂量依赖性关系。作用24h后，50μgmL-1油茶皂素化合物A对SGC-7901的增殖抑制率(45.25％)与Rg3(48.41％)相接近，当浓度达100μgmL-1时，抑制率(82.93％)明显大于Rg3。
(2)油茶皂素化合物B对人胃癌SGC-7901细胞增殖抑制作用，如图2所示，20～200μgmL-1油茶皂素化合物B可剂量依赖性的抑制SGC-7901的增殖，作用24h后，20～100μgmL-1油茶皂素化合物B的抑制效果明显不如Rg3；当浓度达150μgmL-1时，对SGC-7901的抑制率为58.56％，阳性对照品Rg3(80μgmL-1)对SGC-7901的抑制率为63.43％，二者抑制率比较接近，而当油茶皂素化合物B浓度达200μgmL-1时，抑制SGC-7901的增殖效果(80.26％)明显比Rg3(63.43％)抑制效果好。
Hoechst33342染色观察细胞凋亡
取普通洁净盖玻片于70％乙醇中浸泡30min，无菌超净台内吹干，将盖玻片置6孔板内，种入人胃癌SGC-7901细胞，培养过夜，细胞密度约60-80％。向6孔板内加入油茶皂素化合物A(20、50μgmL-1)、油茶皂素化合物B(50、100μgmL-1)，设置空白组，刺激细胞发生凋亡后，吸弃培养液，用无菌PBS洗涤3次，加入固定液(甲醇-冰乙酸＝3∶1)，于4℃过夜。吸弃固定液，用0.9％NaCl洗涤3次，用手晃动数次，吸弃液体；加入10μgmL-1Hoechst33342染色液，染色5min，用手晃动数次；用0.9％NaCl洗涤3次，将贴有细胞的盖玻片盖于载玻片上，尽量避免气泡。置于荧光显微镜下观察。
实验结果
如图3所示，空白组经Hoechst33342染料染色后，细胞呈均匀荧光，而经油茶皂素化合物A(50μgmL-1)、油茶皂素化合物B(100μgmL-1)处理过的细胞染色后，部分细胞核内呈浓染致密的颗粒块状荧光或荧光碎片，可判断SGC-7901细胞发生了凋亡，即油茶皂素化合物A、油茶皂素化合物B抑制SGC-7901细胞增殖的方式为诱导细胞凋亡。
1.2.5流式细胞术检查细胞凋亡
将处于对数生长期的人胃癌细胞SGC-7901进行传代培养，每瓶细胞数量约60～70万个，培养至约70～80％，分别加入油茶皂素化合物A(20、50μgmL-1)、油茶皂素化合物B(50、100、150μgmL-1)，刺激细胞发生凋亡，同时设定空白组。用不含EDTA的胰酶进行消化，收集细胞；PBS洗涤两次收集的细胞，于1.2×103rmin-1离心3min收集1～5×105个细胞；加入500μL Annexin V Binding Buffer悬浮细胞、5μL Annexin V-FITC混匀， 再加入5μL PI混匀，室温避光反应10min；过400目筛网，使其成为单细胞悬液，然后进行上机检测。
实验结果
空白组早期凋亡率为0.93％，晚期凋亡率为3.96％。20μgmL-1油茶皂素化合物A不能诱导SGC-7901的早期及晚期凋亡，但当其浓度为50μgmL-1时可显著诱导SGC-7901的早期凋亡(凋亡率4.33％)，总凋亡率(8.1％)明显大于空白组(4.89％)。50、100μgmL-1油茶皂素化合物B可诱导SGC-7901的早期凋亡(1.12％、1.18％)和晚期凋亡(4.28％、4.54％)，但效果不显著，而当浓度达150μgmL-1时，可明显诱导SGC-7901细胞的早期凋亡(2.46％)和晚期凋亡5.69％)。油茶皂素化合物A、B对人胃癌SGC-7901细胞均具有诱导凋亡的作用，并且随着油茶皂素化合物A、B浓度的升高，细胞的凋亡率也增加。
Claims (1)
1.从油茶皂素中分离的化合物在制备抗癌药物中的用途，其特征在于油茶皂素中的化合物对人胃癌SGC-7901 细胞具有抑制增殖及诱导凋亡作用，所述化合物为化合物B，其结构式为：
。
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