CN103689459A - 一种具有抗氧化活性蛋白黑素的制备方法 - Google Patents

一种具有抗氧化活性蛋白黑素的制备方法 Download PDF

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Abstract

一种具有抗氧化活性蛋白黑素的制备方法属于功能性食品加工技术，该方法将脱脂后的大豆酱渣饼进行超声辅助乙醇提取，然后离心得上清液，将上清液浓缩后分成两部分，分别进行超滤和大孔吸附树脂处理，得到三个分子量段（小于5000Da、5000-10000Da、大于10000Da）的蛋白黑素提取液，经比较，大孔吸附树脂纯化得到蛋白黑素的抗氧化活性优于超滤纯化得到的蛋白黑素，且分子量5000-10000Da的蛋白黑素抗氧化活性最强，将5000-10000Da的蛋白黑素提取液浓缩、干燥后即得具有抗氧化活性的蛋白黑素；该蛋白黑素的OH自由基和DPPH自由基清除能力相当于Vc，可用于开发具有强抗氧化活性的功能性食品。

Description

一种具有抗氧化活性蛋白黑素的制备方法
技术领域
本发明属于功能性食品加工技术领域，主要涉及一种具有抗氧化活性蛋白黑素的制备方法。
背景技术
食品体系脂质氧化劣变的抑制和人体异常生理氧化协迫的干预一直是食品界和医药界的2个研究热点。但是，近年来随着外源合成抗氧化剂食用安全性的质凝和人体毒副作用的揭示，筛选鉴定天然药食资源中安全有效的抗氧化活性物质已日益引起了国内外学者的极大关注。
蛋白黑素作为食品加工和贮藏过程中美拉德反应所形成的重要终产物，不但特有的外观褐色决定了消费者对产品的可接受度，而且较强的生理活性和保健功也引起了世界各国的高度重视，“食品体系蛋白黑素抗氧化特性”已被列入欧盟COST Action 919行动中的五大协作研究专题。蛋白黑素是一类聚合度不等的高分子聚合体，存在形式是蛋白复合物和短肽，亲水性极强，具有类似食物纤维的功能，使ACE的活性和胰蛋白酶的活性受到抑制，可降低人体的血糖浓度，使亚硝胺的合成受到阻断，可有效结合封闭金属离子，抗杂环胺诱变，具有很强的自由基清除能力和抗氧化性。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种具有抗氧化活性蛋白黑素的制备方法，所制备的蛋白黑素抗氧化活性高，无毒副作用，具有很强的自由基清除能力。
本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：
一种具有抗氧化活性蛋白黑素的制备方法，该方法包括以下步骤：（1）将大豆酱渣饼粉碎后过筛，然后进行脱脂处理；（2）向脱脂后的大豆酱渣饼中加入一定量的乙醇溶液并进行超声辅助乙醇提取得到提取液，所述的乙醇溶液浓度为15%，液料比为30mL/g，超声温度为50℃，超声时间为5h，超声功率为300W；（3）将提取液进行离心分离得上清液，将上清液真空浓缩后分成两部分，分别进行超滤处理和大孔吸附树脂处理，得到分子量小于5000Da、分子量5000-10000Da和分子量大于10000Da三个分子量段的蛋白黑素提取液，所述的超滤处理条件为：超滤压力40-70kPa，超滤温度20-50℃，所述的大孔吸附树脂处理条件为：上样浓度20-60mg/mL，流速1-2.5mL/min，洗脱剂乙醇浓度40-60%，经比较，大孔吸附树脂纯化得到蛋白黑素的抗氧化活性优于超滤纯化得到的蛋白黑素的抗氧化活性；（4）将经大孔吸附树脂处理得到的分子量为5000-10000Da的蛋白黑素提取液进行真空浓缩、冷冻干燥后即得具有抗氧化活性的蛋白黑素。
所述的超滤处理优选参数为：超滤压力60kPa，超滤温度40℃。
所述的大孔吸附树脂处理优选参数为：上样浓度30mg/mL，流速1.5mL/min，洗脱剂乙醇浓度60%。
本发明采用超声辅助乙醇法从大豆酱渣饼中提取蛋白黑素，再通过超滤和大孔吸附树脂分别对提取液进行分离纯化，得到具有抗氧化活性的蛋白黑素。经比较，大孔吸附树脂纯化得到蛋白黑素的抗氧化活性优于超滤纯化得到的蛋白黑素，且经大孔吸附树脂纯化得到的分子量为5000-10000Da的蛋白黑素抗氧化活性最强；本发明制备的蛋白黑素的OH自由基和DPPH自由基清除能力强，相当于Vc的抗氧化能力，而且具有一定的抗亚油酸氧化能力，为开发具有强抗氧化活性的功能性食品提供理论基础。
附图说明
图1 本发明方法的工艺路线图
图2 超滤压力对膜通量速度的影响
图3 超滤温度对膜通量速度的影响
图4 乙醇浓度对解析性能的影响
图5 不同条件下蛋白黑素的OH自由基抑制率。
具体实施方式
下面结合附图对本发明具体实施例进行详细描述：
一种具有抗氧化活性蛋白黑素的制备方法，该方法包括以下步骤：（1）将大豆酱渣饼粉碎后过筛，然后进行脱脂处理；（2）向脱脂后的大豆酱渣饼中加入一定量的乙醇溶液并进行超声辅助乙醇提取得到提取液，所述的乙醇溶液浓度为15%，液料比为30mL/g，超声温度为50℃，超声时间为5h，超声功率为300W；（3）将提取液进行离心分离得上清液，将上清液真空浓缩后分成两部分，分别进行超滤处理和大孔吸附树脂处理，得到分子量小于5000Da、分子量5000-10000Da和分子量大于10000Da三个分子量段的蛋白黑素提取液，所述的超滤处理条件为：超滤压力40-70kPa，超滤温度20-50℃，所述的大孔吸附树脂处理条件为：上样浓度20-60mg/mL，流速1-2.5mL/min，洗脱剂乙醇浓度40-60%，经比较，大孔吸附树脂纯化得到蛋白黑素的抗氧化活性优于超滤纯化得到的蛋白黑素的抗氧化活性；（4）将经大孔吸附树脂处理得到的分子量为5000-10000Da的蛋白黑素提取液进行真空浓缩、冷冻干燥后即得具有抗氧化活性的蛋白黑素。
所述的超滤处理优选参数为：超滤压力60kPa，超滤温度40℃。
所述的大孔吸附树脂处理优选参数为：上样浓度30mg/mL，流速1.5mL/min，洗脱剂乙醇浓度60%。
实施例1 超滤和大孔吸附树脂纯化工艺参数的筛选试验
1.材料与方法
1.1材料、试剂
大豆酱渣饼 哈尔滨正阳河酱厂提供
1.2实验设备
pHS-25型酸度计 上海伟业仪器厂
电子分析天平 梅勒特-托利多仪器(上海)有限公司
精密电动搅拌机 江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司
电热恒温水浴锅 余姚市东方电工仪器厂
722S分光光度计 上海精密科学仪器有限公司
超滤装置 上海荣泰生化工程有限公司
大孔吸附树脂柱 江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司
1.3试验方法
工艺流程见图1
2.结果与讨论
2.1超滤工艺参数的确定
2.1.1超滤压力的确定
本试验恒定流速，研究不同压力下，膜通量速度JV随超滤时间的变化关系。由图2可以看出，超滤温度为25℃，当超滤压力P为40kPa、50kPa时，JV值较小，JV随时间的延长而衰减，但衰减较慢；当超滤压力为60kPa、70kPa时，JV值较大，JV随时间的延长而衰减，但衰减较快，试验结果表明，压力越高，JV衰减越快，而且压力过高膜易被压实。压力低，虽然JV衰减速度慢，但是JV太低不能满足实际生产需要。综合考虑，超滤压力选择60kPa比较合适。
2.1.2超滤温度的确定
由图3可以看出，随着超滤温度的升高，膜通量速度JV增加，且在20-40℃之间变化较明显。这是由于随着温度的提高，加快了膜中聚合物链节的微观布朗运动，使单位时间、单位体积形成小孔的可能性增加，从而使透过速度增大。当温度超过50℃以后，膜通量速度JV的增加比较缓慢。综合考虑，超滤温度选择40℃比较合适。
在最优工艺参数下，超滤后得三种蛋白黑素产品，F1为分子量>10000Da，F2为分子量<5000Da，F3为5000Da<分子量<10000Da。
2.2大孔吸附树脂工艺参数的确定
2.2.1上样浓度的确定
表1-1类黑精浓度对X-5树脂动态吸附性能的影响
Figure 526760DEST_PATH_IMAGE001
蛋白黑素溶液的浓度是影响树脂吸附性能的重要因素之一，吸附树脂的吸附容量一般以较浓度进行较为有利。如果蛋白黑素溶液浓度过高，则泄漏点早，吸附量减小，树脂使用周期短再生次数将增多；如果蛋白黑素溶液浓度偏低，工作效率降低，树脂吸附杂质增大，加大了类黑精与杂质分离的难度。由表1-1可以看出，蛋白黑素溶液的浓度为20、30、40、50、60mg/mL时，吸附量较适宜，在实验中观察得到，类黑精溶液的浓度为30mg/mL时，吸附过程的稳定性好，蛋白黑素在树脂上呈现明显的梯度变化，吸附时间也比较适宜。所以，选择上样浓度为30mg/mL的蛋白黑素溶液作为吸附原液。
2.2.2流速的确定
表1-2 树脂吸附性
Figure 770134DEST_PATH_IMAGE002
由表1-2可知，流速过大时，大量的类黑精来不及被树脂吸附就提早泄漏，并且在实验中可观察到类黑精在树脂上的分布没有呈现明显的梯度变化，树脂选择吸附性能降低；但流速过小时，吸附时间延长，生产效率低，同时使树脂的再生困难，树脂寿命降低，因此流速应控制在适宜的范围内，我们选择流速为1.5mL/min。
2.2.3洗脱剂乙醇浓度的确定
由图4可以看出，随着洗脱剂浓度的变大，洗脱效果越好。当洗脱剂为60%的乙醇溶液时，洗脱速度最快，第7管时基本洗脱干净，50%的乙醇溶液洗脱至第9管基本洗脱干净，而洗脱剂40%的乙醇溶液时，洗脱速度最慢，在各测定点的吸光度值均大于1.2，故选择60%的乙醇溶液为最佳的动态洗脱剂。
在最优工艺参数下，经大孔吸附树脂纯化得到三种蛋白黑素产品，M1为分子量>10000Da，M2为分子量<5000Da，M3为5000Da<分子量<10000Da。
实施例2 抗氧化活性试验
1.材料与方法
1.1材料、试剂
大豆酱渣饼 哈尔滨正阳河酱厂提供
1.2实验设备
pHS-25型酸度计 上海伟业仪器厂
电子分析天平 梅勒特-托利多仪器(上海)有限公司
精密电动搅拌机 江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司
电热恒温水浴锅 余姚市东方电工仪器厂
722S分光光度计 上海精密科学仪器有限公司
超滤装置 上海荣泰生化工程有限公司
大孔吸附树脂柱 江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司
1.3试验方法
1.3.1工艺流程（见图1）
1.3.2测定方法
1.3.2.1蛋白黑素抑制OH自由基能力的测定
OH自由基是一种强有力的氧化剂，在蛋白黑素中加入0.6mL蒸馏水，0.8mL的乙二胺四乙酸铁铵溶液（0.021%硫酸亚铁胺和 0.037%二乙烯四乙酸），加入0.8mL的二甲基亚砜 （DMSO，0.88% v/v磷酸盐缓冲溶液 pH 7.4），反应时加0.4mL的0.264%的抗坏血酸。封住试管顶，在80-90℃水浴下加热15min。终止反应后加入1mL的TCA溶液 (17.5% w/v)和3mL纳什试剂（75.0g醋酸铵，3mL冰醋酸，2mL的乙酰丙酮混合，并加入1mL的蒸馏水），在室温下，15min后观察试管内颜色的变化。用分光光度计在412nm处测生成的黄色物质的吸光值与空白对照。OH自由基的抑制率计算：
OH自由基的抑制率（%）=[1−(样品的吸光值/空白的吸光值)]×100%。
1.3.2.2蛋白黑素消除DPPH自由基能力的测定
DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)是一种非常稳定的以氮为中心的，可以长时间保存的自由基，经常被用来作为抗氧化性试剂。其乙醇溶液呈紫色，最大吸收波长为517nm。当DPPH溶液中加入自由基清除剂时，其孤电子被配对，吸收消失或减弱，导致溶液颜色变浅，在517nm处的吸光度变小，其变化程度与自由基清除程度呈线形关系。故该法可以用来表征某种物质对自由基的清除能力，通常用清除率表示。清除率越大，表明该物质清除自由基的能力越强。本试验通过测试对DPPH自由基的清除能力来评定红甘蓝花色苷的抗氧化活性。
用无水乙醇配置0.2mmoL/L DPPH溶液，在避光条件下保存，然后将1mL的溶液与1mL的测试样品溶解在100mmoL/L Tris-HCl缓冲(pH值7.4)，在室温黑暗处静置30min。取不同反应条件下的类黑晶产物和0.5mg/mL的Vc溶液备用，以Vc为对照，在517nm处测得吸光值。按照下列公式计算消除率 ：
Figure 549871DEST_PATH_IMAGE003
Ai: 吸收的1mL样品和1mL 0.2 mmoL DPPH最大吸收值
Aj: 吸收的1mL样品和1mL的乙醇的最大值
Ac: 吸收的1mL 0.2mmoL/L DPPH和1mL Tris-HCl缓冲液的最大
1.3.2.3蛋白黑素抗亚油酸氧化能力的测定
分别配置反应液无水乙醇1.5mL，2.5%的亚油酸3.0mL，9mL磷酸缓冲溶液（pH=7.0）蒸馏水1.5mL，100μg/mL，黑色物质样液0.5mL，于25mL具塞试管中，混匀后37℃恒温避光，每隔1h取反应液0.1mL，分别加入9.7mL的75%的乙醇和0.1mL的硫氰酸胺，然后加入0.1mL的20mmoL/L的硫酸亚铁溶液，反应3min后以蒸馏水为对照，于500nm处比色测定吸光度A，以Vc为对照，所有测定值均设三次重复，取平均值。
2.结果与讨论
2.1蛋白黑素抑制OH自由基能力的研究
如图5所示，OH自由基的抑制率随着反应浓度的升高而增加，在相同浓度下过大孔树脂的蛋白黑素的OH自由基抑制率明显高于超滤后的蛋白黑素，过大孔树脂的蛋白黑素M3 (5000Da<分子量<10000Da)的OH自由基的抑制率大于超滤后的蛋白黑素F3，当过大孔树脂后的蛋白黑素M3的浓度达到150μg/mL时，其OH自由基的抑制率与50μg/mL Vc的OH自由基的抑制率相当。
2.2蛋白黑素消除DPPH自由基能力的研究
表2-1 浓度对DPPH消除率的影响
Figure 7397DEST_PATH_IMAGE004
由表2-1可以看出，DPPH自由基清除率随着反应物浓度的升高而增加，在相同浓度下过大孔树脂的蛋白黑素的DPPH清除能力明显高于超滤后的蛋白黑素，蛋白黑素M2(分子量<5000Da)的蛋白黑素的DPPH清除能力明显高于M1(分子量>10000Da)的DPPH清除能力，低于蛋白黑素M3 (5000Da<分子量<10000Da)的DPPH清除能力。应物浓度达到4%时，过大孔树脂的蛋白黑素(5000Da<分子量<10000Da)的DPPH清除能力与0.5mg/mL的Vc相当。
2.3蛋白黑素抗亚油酸氧化能力的研究
表2-2 浓度对抗亚油酸氧化能力的影响
Figure 821769DEST_PATH_IMAGE005
由表2-2可以看出，蛋白黑素有抗氧化性能，能有效抑制脂质氧化，常用亚油酸法来评价化合物的总抗氧化性，对于不同浓度蛋白黑素的抗亚油酸能力，其中过大孔树脂后的蛋白黑素抗亚油酸能力最强，超滤后的蛋白黑素次之，提取后的蛋白黑素最小。在相同浓度下过大孔树脂的蛋白黑素的抗亚油酸氧化能力略高于超滤后的蛋白黑素，蛋白黑素M2(分子量<5000Da)的蛋白黑素的抗亚油酸氧化能力大于M1(分子量>10000Da)的抗亚油酸氧化能力，略低于蛋白黑素M3 (5000Da<分子量<10000Da)的抗亚油酸氧化能力。与对照相比组分抗亚油酸能力均比不上Vc。
3.结论
采用超滤和大孔吸附树脂两种纯化方法分别对蛋白黑素提取液进行分离纯化，经比较，大孔吸附树脂纯化得到蛋白黑素的抗氧化活性优于超滤纯化得到的蛋白黑素，且经大孔吸附树脂纯化得到的分子量为5000-10000Da的蛋白黑素抗氧化活性最强，具有较强的抑制OH自由基能力和消除DPPH自由基能力，而且具有一定的抗亚油酸氧化能力，一定浓度蛋白黑素产品的抗氧化活性与Vc相当。

Claims (3)

1.一种具有抗氧化活性蛋白黑素的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤：（1）将大豆酱渣饼粉碎后过筛，然后进行脱脂处理；（2）向脱脂后的大豆酱渣饼中加入一定量的乙醇溶液并进行超声辅助乙醇提取得到提取液，所述的乙醇溶液浓度为15%，液料比为30mL/g，超声温度为50℃，超声时间为5h，超声功率为300W；（3）将提取液进行离心分离得上清液，将上清液真空浓缩后分成两部分，分别进行超滤处理和大孔吸附树脂处理，得到分子量小于5000Da、分子量5000-10000Da和分子量大于10000Da三个分子量段的蛋白黑素提取液，所述的超滤处理条件为：超滤压力40-70kPa，超滤温度20-50℃，所述的大孔吸附树脂处理条件为：上样浓度20-60mg/mL，流速1-2.5mL/min，洗脱剂乙醇浓度40-60%，经比较，大孔吸附树脂纯化得到蛋白黑素的抗氧化活性优于超滤纯化得到的蛋白黑素的抗氧化活性；（4）将经大孔吸附树脂处理得到的分子量为5000-10000Da的蛋白黑素提取液进行真空浓缩、冷冻干燥后即得具有抗氧化活性的蛋白黑素。
2.根据权利要求1所述的一种具有抗氧化活性蛋白黑素的制备方法，其特征在于所述的超滤处理优选参数为：超滤压力60kPa，超滤温度40℃。
3.根据权利要求1所述的一种具有抗氧化活性蛋白黑素的制备方法，其特征在于所述的大孔吸附树脂处理优选参数为：上样浓度30mg/mL，流速1.5mL/min，洗脱剂乙醇浓度60%。
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