CN103675152A - 一种硝酸甘油微乳喷雾剂的含量测定方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种硝酸甘油微乳喷雾剂的含量测定方法，该方法为HPLC方法，色谱条件是以DiamonsilC18柱(250mm×4.6mm,5μm)为色谱柱，以70:30的乙腈-水为流动相，流速为1.0mL/min，检测波长为215nm，柱温为30℃，该方法专属性好、准确度及日内日间精密度良好，可用于硝酸甘油微乳喷雾剂的含量测定及质量监控。

Description

一种硝酸甘油微乳喷雾剂的含量测定方法及应用

本发明专利申请为分案申请，原案申请号为201210026459.X，申请日为2012年2月7日，发明名称为：一种硝酸甘油微乳喷雾剂及其制备方法和应用。

技术领域

本发明涉及一种硝酸甘油微乳喷雾剂的含量测定方法及应用，特别涉及一种专属性好、准确度及日内日间精密度良好的硝酸甘油微乳喷雾剂的含量测定方法。

技术背景

硝酸甘油是治疗心绞痛首选的药物之一。心绞痛是一种由于冠状动脉供血不足，导致心肌急剧的、暂时的缺血与缺氧引起的以发作性胸痛或胸部不适为主要表现的临床综合征。硝酸甘油控制心绞痛发作的作用机制主要是通过扩张冠状动脉，增加冠状动脉供血，达到抗心绞痛的作用。此外，硝酸甘油也可通过扩张其他动脉、静脉，使外周血管阻力下降，从而减轻心脏的负担，增加心脏排血量，改善心脏血液循环等机制发挥抗心绞痛作用。硝酸甘油片不能吞服，这是因为吞服的硝酸甘油在吸收过程必须通过肝脏，在肝脏中绝大部分的硝酸甘油被灭活，从而使药效大大降低。因此，硝酸甘油常采用舌下给药，药物能通过舌下静脉直接入血，因此不但起效快，而且药效不会降低。硝酸甘油现有剂型有普通片、控释片、口腔崩解片、软膏剂、透皮贴剂、气雾剂、注射剂等。微乳是一种新型的药物载体，九十年代起开始应用于药学领域。它是由表面活性剂、助表面活性剂、油相和水相按照适当比例自发形成的一种透明或半透明、低粘度、且各向同性的热力学稳定体系。

发明内容

本发明目的在于公开一种专属性好、准确度及日内日间精密度良好的硝酸甘油微乳喷雾剂的含量测定方法。

本发明目的是通过如下技术方案实现的：

本发明所述硝酸甘油微乳喷雾剂的含量测定方法采用HPLC方法，色谱条件与系统适用性：以DiamonsilC18柱(250mm×4.6mm,5μm)为色谱柱，以70:30的乙腈-水为流动相，流速为1.0mL/min，检测波长为215nm，柱温为30℃；供试品的制备：取硝酸甘油微乳0.1mL置于10mL容量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，充分溶解，摇匀，用0.45μm滤头过滤，取续滤液备用；测定：精密吸取供试品溶液20μl；注入色谱仪测定，即得；本发明每1mL含以硝酸甘油计不低于5mg；

其中，所述硝酸甘油微乳喷雾剂由硝酸甘油、表面活性剂、助表面活性剂、油相和水相组成，所述硝酸甘油微乳喷雾剂的组分包括：硝酸甘油3～5重量份、Tween8012～30重量份、无水乙醇5～15重量份、薄荷素油2～5重量份、蒸馏水50～75重量份。

优选地，所述硝酸甘油微乳喷雾剂的组分包括：硝酸甘油3重量份，Tween8015重量份，无水乙醇7.5重量份，薄荷素油2.5重量份，蒸馏水72重量份。

优选地，所述硝酸甘油微乳喷雾剂的组分包括：硝酸甘油为4重量份，Tween8020重量份，无水乙醇10重量份，薄荷素油4重量份，蒸馏水62重量份。

优选地，所述硝酸甘油微乳喷雾剂的组分包括：硝酸甘油为5重量份，Tween8030重量份，无水乙醇14.5重量份，薄荷素油5重量份，蒸馏水45.5重量份。

优选地，所述硝酸甘油微乳喷雾剂由如下方法制备：称取硝酸甘油，薄荷素油、Tween80，无水乙醇，在15-30℃温度条件下，350～600r/min转速下搅拌至混合均匀后；加蒸馏水，搅拌至澄清，装进喷雾瓶中即得硝酸甘油微乳喷雾剂。

本发明另一目的在于公开一种硝酸甘油微乳喷雾剂用于制备治疗心绞痛的药物中的应用，所述硝酸甘油微乳喷雾剂由硝酸甘油、表面活性剂、助表面活性剂、油相和水相组成，组分包括：硝酸甘油3～5重量份、吐温-8012～30重量份、无水乙醇5～15重量份、薄荷素油2～5重量份、蒸馏水50～75重量份。

优选地，所述硝酸甘油微乳喷雾剂的组分包括：硝酸甘油3重量份，吐温-8015重量份，无水乙醇7.5重量份，薄荷素油2.5重量份，蒸馏水72重量份。

优选地，所述硝酸甘油微乳喷雾剂的组分包括：硝酸甘油为4重量份，吐温-8020重量份，无水乙醇10重量份，薄荷素油4重量份，蒸馏水62重量份。

优选地，所述硝酸甘油微乳喷雾剂的组分包括：硝酸甘油为5重量份，吐温-8030重量份，无水乙醇14.5重量份，薄荷素油5重量份，蒸馏水45.5重量份。

优选地，所述硝酸甘油微乳喷雾剂由如下方法制备：称取硝酸甘油，薄荷素油、Tween80，无水乙醇，在15-30℃温度条件下，350～600r/min转速下搅拌至混合均匀后；加蒸馏水，搅拌至澄清，装进喷雾瓶中即得硝酸甘油微乳喷雾剂。

附图说明

图1硝酸甘油原料药、空白微乳、载药微乳紫外可见光谱扫描图：

1.硝酸甘油2.空白微乳3.载药微乳；

图2不同Km值对微乳区域形成的影响：

(a)3:1 (b)2:1 (c)1:1 (d)1:2；

图3粒径分布；

图4硝酸甘油微乳透射电镜观察(x20000)；

图5液相色谱图：(a)硝酸甘油对照品；(b)空白微乳；(c)硝酸甘油微乳；

图6空白组；

图7模型组；

图8硝酸甘油微乳喷雾剂组；

图9硝酸甘油喷雾剂组。

微乳作为给药载体有如下优点：(1)多可自发形成，不需外力做功，工艺简单，易于制备；(2)物理稳定性好，在低温及高温条件下均稳定，且可以过滤，便于制备和保存；(3)可增加药物的溶解度从而促进药物的吸收；(4)粒径小且均匀，一般10～100nm，药物分散性好，可促进药物的吸收，生物利用度高。喷雾剂具有使药物分散均匀、可直接达到作用部位、吸收速度快、药物稳定性好等特点；微乳具有能提高药物溶解性，促进药物的吸收，增加药物生物利用度等优点。本发明结合硝酸甘油和微乳药物载体与喷雾剂剂型的优点，优化微乳药物组分，制备硝酸甘油微乳型舌下喷雾剂，为临床治疗心绞痛提供更迅速、持久、高效的新的药物剂型。

本发明的硝酸甘油微乳喷雾剂的质量控制依据2010版《中国药典》，微乳制剂要求达到以下质量控制指标，包括性状、鉴别、粒径及分布、形态观察、黏度、含量测定、稳定性考察等。下列实验例用于进一步说明本发明。

实验例1：硝酸甘油微乳的光谱扫描表明载药微乳形成

取3个10ml容量瓶，分别：①加入适量硝酸甘油原料药，以无水乙醇稀释至刻度；②加入适量空白微乳储备液以双蒸水稀释至刻度；③将适量的硝酸甘油与空白微乳储备液混合，以双蒸水至刻度。双蒸水做参比，在190-800nm波长范围内分别进行光谱扫描。结果见图1。

结果显示，原料药在199nm波长处有最大吸收，空白微乳在232nm波长处有最大吸收，载药微乳在208nm波长处出现新的吸收峰且吸光度有所增加，说明原料药加入空白微乳中制备得到了硝酸甘油载药微乳。

实验例2：本发明组分配比关系的筛选试验

微乳作为药物载体，一般由表面活性剂、助表面活性剂、油相和水相组成。应符合无毒、无刺激、具有良好的生物相容性、无不良药理作用、不影响主药的药效和稳定性等基本要求。

（1）油相的筛选

油相能与表面活性剂分子之间保持渗透和联系，使之容易形成界面膜。若所制备微乳能完全包封药物，则要求油相对硝酸甘油具有一定的溶解能力。为此，分别考察油酸乙酯、油酸、薄荷油、大豆油、花生油等5种油相对硝酸甘油的溶解能力，结果见表1。

表132℃时硝酸甘油在5种油相中的溶解度

由表1可知，32℃时，硝酸甘油在薄荷油中具有较大的溶解度，其次是油酸和油酸乙酯。所以初步选择薄荷油、油酸、油酸乙酯为油相。

（2）表面活性剂的筛选

表面活性剂在微乳中起乳化剂作用，是微乳处方中最重要的组份之一，它的主要作用是降低界面张力形成界面膜，促使微乳形成，决定着所微乳形成的类型，影响粒径的大小。表面活性剂的选择决定于形成微乳的特性和使用目的。根据乳化理论，制备水包油（O/W）型微乳，可选择亲水性较强的亲水亲油平衡值（HLB值）在8～18的表面活性剂；而制备油包水（W/O）型微乳，则需要选择亲油性较强的HLB值在4～7的表面活性剂。本发明拟制备水包油（O/W）型微乳，对于硝酸甘油这种水难溶性药物而言，包裹于水包油微乳的内相中，可使其溶解性大大提高，促进药物吸收。亲水亲油平衡值（HLB）是衡量表面活性剂亲水能力的一个重要参数。在实际应用中有重要参考价值。亲油性表面活性剂BHL较低，亲水性表面活性剂BHL较高。表2列出了几种常用表面活性剂的亲水亲油平衡值（HLB值）。

表2常用表面活性剂的HLB值

对表2中几种常用表面活性剂的HLB值比较，可知吐温80、吐温20和泊洛沙姆188的HLB值较为符合制备水包油（O/W）型微乳要求。吐温为非离子型表面活性剂，毒性较低，且具有较小的皮肤刺激性，因此，本发明拟初步选择吐温80、吐温20作为表面活性剂。

（3）助表面活性剂的筛选

在微乳的形成过程中，助表面活性剂可以调节表面活性剂的HLB值，满足微乳油相的要求。其结构和种类对微乳的形成和稳定性均有一定的影响。常用的助表面活性剂有低级醇、有机胺、单双烷基酸甘油酯等，以醇最为常用。本发明拟选用短链醇：乙醇、1，2-丙二醇为助表面活性剂。

（4）空白微乳组份及其用量筛选

室温时，在恒温磁力搅拌条件下，将表面活性剂吐温-80与吐温-20用量范围5.0-15.0ml、助表面活性剂无水乙醇与1,2-丙二醇用量范围5.0-10.0ml，于平底玻璃试管中充分混匀后，分别加入作为油相的油酸乙酯、油酸、薄荷油且用量范围2.0-5.0ml，继续混匀，之后，再逐滴加入双蒸水25.0-40.0ml。滴加双蒸水过程中，观察体系由浊变清或由清变浊情况，记录临界点，确定微乳区界限。表3表述了空白微乳的组份及用量筛选试验。

表3空白微乳组份及用量筛选

当平行光入射结果中的①、②、③、⑤、⑥、⑧澄清液时，均有丁达尔效应，初步确定为微乳。而结果中的④、⑦浑浊液则不出现丁达尔效应，可能是由于油酸黏度比较大造成的。油酸乙酯有轻微的组织刺激性，属于低毒性的药物辅料。因此，确定薄荷油为油相。则，空白微乳组份为吐温-80、无水乙醇、薄荷油。空白微乳配比关系需进一步通过三元相图来确定。

（5）三元相图的绘制及组分配比关系筛选

该试验采用三元相图法优化微乳配比关系。分别以表面活性剂和助表面活性剂为一个顶点、油相及水相作为另外两个顶点，根据各组分在临界点所占的重量百分比确定该点在相图中的位置，所形成区域即为该组分在一定K_m值下的三元相图。分述如下：

筛选K_m：K_m表示吐温-80与无水乙醇的重量比。室温(25±1)℃条件下，将表面活性剂与助表面活性剂按照K_m为1:2，l:1，2:1，3:l质量比混合，恒温磁力搅拌器充分混合均匀，加入油相分别按照10:0，9:l，8:2，7:3，6:4，5:5，4:6，3:7，2:8，l:9质量比混合均匀，再逐滴加入双蒸水。双蒸水滴加过程中，观察体系由浊变清或由清变浊情况，记录临界点，确定微乳区界限。绘制三元相图。结果见图2。

在三元相图中，M_e表示微乳区。当K_m约为2:1时，三元相图中所形成的微乳区域较大。在所筛选的空白微乳配方基础上，制备含硝酸甘油（3～5g）微乳。并对载药微乳的含量测定、粒径及其分布、电镜下微观形态、稳定性等进行了考察。结果表明:试验所制备的载药微乳符合微乳制剂的要求。确定一种硝酸甘油微乳喷雾剂的各组分配比为：硝酸甘油3～5g、吐温-8012～30g、无水乙醇5～15g、薄荷素油2～5g、蒸馏水50～75g。

实验例3硝酸甘油微乳制备工艺考察

（1）混合顺序

加混合表面活性剂法：在温度25℃下，按照处方各组分配比量称取表面活性剂和助表面活性剂混合，制备混合表面活性剂，磁力搅拌器边搅拌边滴加到油、水混合液中，记录临界点加入量，按前法绘制三元相图。

加水法：在温度25℃下，按照处方各组分配比量取油、表面活性剂和助表面活性剂组成的混合表面活性剂，成混合液，边搅拌边滴加水，记录临界点加入量，按前法绘制三元相图。

交替加入法：在温度25℃下，按照处方各组分配比量在水中，边搅拌边交替加入混合表面活性剂和油相，记录临界加入量，按前法绘制伪三元相图。

结果表明，三种方法绘制的三元相图一致，故微乳的形成与油水相的加入顺序无关。本发明拟采用第二种方法即加水法，先将油相与混合表面活性剂混匀后，再与水相混合。

（2）分散方式

在温度25℃下，分别采用振摇(150r/min)、涡旋混合、磁力搅拌(300r/min)的方式进行分散，按前法绘制三元相图并进行比较，考察不同分散强度对微乳形成的影响。

结果表明，采用振摇(150r/min)、涡旋混合的方法所绘制的相图与采用磁力搅拌(300r/min)方法绘制的相图一致。

三种不同的分散方式，其分散强度大小为：涡旋混合>磁力搅拌(300r/min)>振摇(150r/min)；从动力学意义上讲，分散强度增大，整个体系的能量增加，会缩短微乳形成所用的时间；但从微乳的形成上，只要各组分比例适当，不需外力做功就可以自发形成微乳，因而分散强度增大，只能缩短形成微乳所用时间，而不影响微乳形成区域的大小。本发明采取磁力搅拌(300r/min)的方法，该方法操作简单，制得的微乳性质稳定且均匀。

（3）分散温度

按照处方各组分配比量称取油、表面活性剂和助表面活性剂组成的混合表面活性剂，制成混合液，分别在25℃、40℃和60℃下，用磁力搅拌器边搅拌边滴加双蒸馏水，记录临界加入量，按前法绘制三元相图，考察不同分散温度对微乳形成的影响。

结果表明，温度为25℃、40℃和60℃下绘制的三元相图一致，故微乳的形成与分散温度无关。但从达到完全分散所需要的时间来看，当温度25℃、40℃和60℃时，完全分散所需要的时间分别是186秒、180秒和173秒。大约3分钟左右，相差不大，且硝酸甘油受热不稳定，本发明拟采用25℃为分散温度。

（4）硝酸甘油加入顺序

A.称取处方量的油相、表面活性剂、助表面活性剂于小烧杯中，加入处方量的硝酸甘油，于25℃温度下，磁力搅拌器搅拌至药物完全溶解，然后缓慢的加入双蒸水至处方量。

B.称取处方量的油、表面活性剂、助表面活性剂，搅拌混匀，缓慢滴加双蒸水至处方量，形成空白的微乳后，称取适量的空白微乳，于25℃下，加入处方量的硝酸甘油，磁力搅拌至药物完全溶解，体系变澄清。

C.称取处方量的硝酸甘油、油相、表面活性剂、助表面活性剂、水于小小烧杯中，混合搅拌。

结果表明，方法A制得微乳性质稳定且方法简单、方便、易于操作。

最优制备工艺：将处方量的薄荷油、Tween80与无水乙醇（K_m=2:1）的混合表面活性剂、硝酸甘油，在25℃下恒温磁力搅拌，混合均匀后，加入处方量的双蒸水，搅拌至澄清即可。

处方工艺的重现性考察

按上述处方量和优化工艺制备的三批硝酸甘油微乳样品，进行含量测定，结果见表4。

表4硝酸甘油微乳中硝酸甘油的含量测定结果

表4显示，采用优化的制备工艺得到的3批硝酸甘油微乳喷雾剂，含量的RSD不大于0.32%，结果表明，本发明重现性良好，处方合理，工艺条件可行，质量可控。

实验例4：本发明的硝酸甘油微乳制剂（实施例1制备）粒径及分布指标实验

微乳粒径大小是衡量微乳形成与否的重要指标之一；粒径越小，形成的微乳表面活性越高，越有利于吸收。本试验采用透射电镜对载药微乳（实施例1制备）进行形态观察的同时，采集粒径数据，并对粒径其分布进行分析，结果显示硝酸甘油微乳的粒径在10-100nm范围内，平均粒径为47nm，分布范围相对较窄，且基本符合正态分布。结果见表5和图3。

表5粒径及其分布

实验例5：形态观察指标实验

采用透射电镜对微乳（实施例1制备）的形态进行观察:透射电镜放大倍数为20000倍。结果见图4。结果显示微乳呈圆整均一的球体,大小均在10～100nm范围内，硝酸甘油微乳的粒径小于100nm，符合微乳的微观特征。

实验例6：黏度指标实验

按照中国药典2010版附录VIG粘度测定法的第二法，测定仪器为NDJ-8S型数显旋转粘度计，使用1号转子和低粘度附件进行测定，转速为60r/min，得到体系的绝对粘度η(10^-3Pa·s)。测得平均黏度为8.143310^-3Pa·s。

实验例7：含量指标实验

HPLC方法，色谱条件与系统适用性指标要求：

色谱柱：DiamonsilC18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)，流动相：乙腈：水(70:30)；检测波长：215nm（硝酸甘油随浓度的渐浓，特征吸收峰有红移现象）；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；进样量：20μL；

<供试品的制备>：精密量取硝酸甘油微乳0.1mL置于10mL容量瓶中，以无水乙醇稀释至刻度，充分溶解，摇匀，得载药供试品溶液。用0.45μm滤头过滤，取续滤液备用。

<对照品溶液制备>：精密量取适量硝酸甘油对照品置10mL容量瓶中，无水乙醇溶解并稀释至刻度，得到浓度为1mg/mL的硝酸甘油对照品储备液。

<空白微乳溶液制备>：按制备工艺制备不含硝酸甘油的空白微乳溶液，依载药供试品溶液相同的制备方法制备空白微乳溶液。用0.45μm滤头过滤，取续滤液备用。见图5

HPLC色谱图结果表明，硝酸甘油保留时间处，空白微乳中的辅料对硝酸甘油色谱峰不构成干扰，本方法专属性好。

<标准曲线的建立>：分别取适量标准储备液配制浓度为5、15、25、40、50、60μg/mL的标准溶液，进样测定；分三次进样，每次进样20μL，记录色谱峰面积。以硝酸甘油的峰面积A对硝酸甘油浓度c进行线性回归，得回归方程为：A=9530.3c-5889.7（n=6，回归系数r=0.9999）。按信噪比约为10:1计，测得其定量限为20ng/mL，按信噪比约为3:1计，测得其检测限约为7ng/mL。结果表明，在5μg/mL～60μg/mL浓度范围内，硝酸甘油浓度与峰面积线性关系良好。

<日内、日间精密度>：配制浓度为50、25、5μg/ml的高、中、低三个浓度的硝酸甘油溶液，分别于日内0、2、4、6、8h内及日间1、2、3、4、5d内测定，其日内精密度的RSD值不大于1.12%（n=5），日间精密度的RSD值均不大于1.21%（n=5），表明该含量测定方法日内日间精密度良好。

<加样回收率实验>：精密吸取硝酸甘油微乳样品9份，再分别加入约相当于其含量的80%、100%、120%的硝酸甘油对照品溶液，进样，测定，计算RSD，结果见表6。其平均回收率100.29%，RSD值为0.84%。回收率试验结果表明，该方法准确度良好。可用于本制剂的含量测定及质量监控。

表6回收率测定结果（n=9）

<含量测定>：精密量取三批硝酸甘油微乳样品，制备供试品溶液。然后分别精密吸取供试品溶液20μl，注入色谱仪测定，即得；三批样品含量测定结果见表7。本发明每1mL含以硝酸甘油计不低于5mg。

表7硝酸甘油微乳含量测定结果(n=3)

<重复性试验>：取不同批号样品6份，按照供试品溶液制备方法进行制备，分别测定硝酸甘油含量，结果的RSD为0.95%（n=6）。重复性试验结果表明，该载药微乳的处方合理，制备工艺及方案可行。

实验例8：稳定性考察指标

本发明所述制剂的稳定性试验研究包括：高温试验、耐寒试验、光照试验、加速试验、长期试验等。检测结果均符合制剂检查项下的有关规定。硝酸甘油遇光不稳定，应避光保存。

硝酸甘油微乳的初步稳定性考察项目参照2010版中国药典二部“附录XIX C原料药与药物制剂稳定性试验指导原则”项下操作。包括外观形状、粒径、离心实验、含量测定、高低温实验、加速试验和室温留样实验等。

考察项目

外观性状：观察微乳的外观，若无色或淡黄色并澄清透明，记作（－），表明稳定性好；浑浊、絮凝、分层或析出药物，记作（＋），表明不稳定。

粒径：测定试验前后的粒径。考察粒径对微乳初步稳定性是否有一定影响。

粘度：在25℃恒温条件下，测定粘度。

离心实验：取适量微乳于10mL离心试管中，以4000r/min的速度离心30min，观察微乳的外观。

强光照射试验：按最优处方制备载药微乳3批，各取10mL，分装于喷雾瓶中，密封后在光照条件(4500Lx)下放置，分别于第5、10天末取样，观察微乳的外观性状，并进行离心试验，测定微乳的黏度和含量。结果见表8。

表8强光照射稳定性实验结果(n=3,

)

由表8可知，该微乳在强光下放置10天微乳液仍澄清略带乳光，离心后无分层、破乳现象，含量略有下降，与硝酸甘油本身光不稳定性有关，故应避光保存。

低温实验：按最优处方制备载药微乳3批，各取10mL，分装于喷雾瓶中，密封，置于4℃冰箱冷藏柜中，分别于第5、10天末取样，观察微乳的外观性状，并进行离心试验，测定微乳的黏度和含量。结果见表9。

表9低温稳定性实验结果(n=3,

)

由表9可知，该微乳在低温下放置10天微乳液仍澄清略带乳光，离心后无分层、破乳现象，含量均无明显变化。表明该微乳制剂在低温下稳定。

高温实验：取3批最优处方（实施例1）制得的硝酸甘油微乳各10mL，分别置于喷雾瓶中，密封后分别放置于40℃的恒温箱中，分别于第5、10天末取样按考查项目下要求进行实验，与0天结果比较，结果见表10。

表10高温稳定性实验结果(n=3,

)

表10结果表明：在40℃条件下，制得的微乳外观、粒径、含量无明显变化，离心后未见分层、破乳现象，含量略有下降，与硝酸甘油本身热不稳定性有关，故应避高温条件下保存。

加速实验：将三批硝酸甘油微乳各10mL密封于喷雾瓶中，置于药物制剂稳定性测定仪中，设定温度为30℃±2℃、相对湿度为60%±5%。分别于第1、2、3、6月末取样，按上述考察项目要求进行检查，并与0个月结果比较，结果见11。

表11加速实验结果(n=3,

)

表11的结果表明，上述包装的3批样品，在加速实验条件下6个月，制得的微乳外观、粒径、含量无明显变化，离心后未见分层、破乳现象，说明该制剂在加速条件下稳定。

室温留样实验：将三批硝酸甘油微乳10mL密封于喷雾瓶中，于室温下连续放置6个月，并于1、2、3、6个月末分别取样，考察样品的外观性状，测定黏度、粒径和含量，并与新制备的样品比较，结果见下表12。

表12室温留样实验结果(n=3,

)

表12的试验结果表明，硝酸甘油微乳在室温下放置6个月后，制得的微乳外观、粒径、含量无明显变化，离心后未见分层、破乳现象，性质稳定，符合质量标准要求。

实验例9：硝酸甘油微乳喷雾剂（实施例1制备）对ISO致大鼠急性心肌缺血心电图的影响

大鼠注射ISO后ST段均明显下移，与空白对照组比较差异显著(P<0.01)，说明造模成功(附图6～7)，各个时间段硝酸甘油微乳喷雾剂组都可干预心肌缺血引起的ST段下移(附图8)，与模型组比较，差异有统计学意义(P<0.01)。硝酸甘油喷雾剂组起效较慢，3分钟后对心肌缺血引起的ST段下移有一定干预作用(附图9)，与模型组比较有统计学差异(P<0.05)，提示硝酸甘油微乳喷雾剂具有较好的缓解心肌缺血作用，与硝酸甘油喷雾剂相比起效更快，效果更好，结果见表13。

表13硝酸甘油微乳喷雾剂对心肌缺血大鼠ST段的影响(

n=10)

注：与模型组比较，^﹡P<0.05，^﹡﹡P<0.01；与空白组比较，^ΔΔP<0.01。

本研究提示本发明硝酸甘油微乳喷雾剂对异丙肾上腺素致大鼠急性心肌缺血模型具有较明显缓解作用，起效时间与维持时间优于硝酸甘油喷雾剂。

具体实施方式

实施例1

精密称取3g硝酸甘油，2.5g薄荷素油、15g吐温-80，7.5g无水乙醇，在25℃温度条件下，350～600r/min转速下搅拌至混合均匀后，加入72g蒸馏水，搅拌至澄清，准确装进喷雾瓶中即得硝酸甘油微乳喷雾剂。

实施例2

精密称取4g硝酸甘油，4g薄荷素油、20g吐温-80，10g无水乙醇，在25℃温度条件下，350～600r/min转速下搅拌至混合均匀后，加入62g蒸馏水，搅拌至澄清，准确装进喷雾瓶中即得硝酸甘油微乳喷雾剂。

实施例3

精密称取5g硝酸甘油，5g薄荷素油、30g吐温-80，14.5g无水乙醇，在25℃温度条件下，350～600r/min转速下搅拌至混合均匀后，加入45.5g蒸馏水，搅拌至澄清，准确装进喷雾瓶中即得硝酸甘油微乳喷雾剂。

Claims (10)

1.一种硝酸甘油微乳喷雾剂的含量测定方法，其特征在于，该方法为：

HPLC方法，色谱条件与系统适用性：以DiamonsilC18柱(250mm×4.6mm,5μm)为色谱柱，以70:30的乙腈-水为流动相，流速为1.0mL/min，检测波长为215nm，柱温为30℃；供试品的制备：取硝酸甘油微乳0.1mL置于10mL容量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，充分溶解，摇匀，用0.45μm滤头过滤，取续滤液备用；测定：精密吸取供试品溶液20μl；注入色谱仪测定，即得；每1mL含以硝酸甘油计不低于5mg；

其中，所述硝酸甘油微乳喷雾剂由硝酸甘油、表面活性剂、助表面活性剂、油相和水相组成，所述硝酸甘油微乳喷雾剂的组分包括：硝酸甘油3～5重量份、Tween8012～30重量份、无水乙醇5～15重量份、薄荷素油2～5重量份、蒸馏水50～75重量份。

2.根据权利要求1所述的硝酸甘油微乳喷雾剂的含量测定方法，其特征在于，所述硝酸甘油微乳喷雾剂的组分包括：硝酸甘油3重量份，Tween8015重量份，无水乙醇7.5重量份，薄荷素油2.5重量份，蒸馏水72重量份。

3.根据权利要求1所述的硝酸甘油微乳喷雾剂的含量测定方法，其特征在于，所述硝酸甘油微乳喷雾剂的组分包括：硝酸甘油为4重量份，Tween8020重量份，无水乙醇10重量份，薄荷素油4重量份，蒸馏水62重量份。

4.根据权利要求1所述的硝酸甘油微乳喷雾剂的含量测定方法，其特征在于，所述硝酸甘油微乳喷雾剂的组分包括：硝酸甘油为5重量份，Tween8030重量份，无水乙醇14.5重量份，薄荷素油5重量份，蒸馏水45.5重量份。

5.根据权利要求1-4任一所述的硝酸甘油微乳喷雾剂的含量测定方法，其特征在于，所述硝酸甘油微乳喷雾剂由如下方法制备：

称取硝酸甘油，薄荷素油、Tween80，无水乙醇，在15-30℃温度条件下，350～600r/min转速下搅拌至混合均匀后；加蒸馏水，搅拌至澄清，装进喷雾瓶中即得硝酸甘油微乳喷雾剂。

6.一种硝酸甘油微乳喷雾剂用于制备治疗心绞痛的药物中的应用，其特征在于，所述硝酸甘油微乳喷雾剂由硝酸甘油、表面活性剂、助表面活性剂、油相和水相组成，所述硝酸甘油微乳喷雾剂的组分包括：硝酸甘油3～5重量份、Tween8012～30重量份、无水乙醇5～15重量份、薄荷素油2～5重量份、蒸馏水50～75重量份。

7.根据权利要求6所述的硝酸甘油微乳喷雾剂用于制备治疗心绞痛的药物中的应用，其特征在于，所述硝酸甘油微乳喷雾剂的组分包括：硝酸甘油3重量份，Tween8015重量份，无水乙醇7.5重量份，薄荷素油2.5重量份，蒸馏水72重量份。

8.根据权利要求6所述的硝酸甘油微乳喷雾剂用于制备治疗心绞痛的药物中的应用，其特征在于，所述硝酸甘油微乳喷雾剂的组分包括：硝酸甘油为4重量份，Tween8020重量份，无水乙醇10重量份，薄荷素油4重量份，蒸馏水62重量份。

9.根据权利要求6所述的硝酸甘油微乳喷雾剂用于制备治疗心绞痛的药物中的应用，其特征在于，所述硝酸甘油微乳喷雾剂的组分包括：硝酸甘油为5重量份，Tween8030重量份，无水乙醇14.5重量份，薄荷素油5重量份，蒸馏水45.5重量份。

10.根据权利要求6-9任一所述的硝酸甘油微乳喷雾剂用于制备治疗心绞痛的药物中的应用，其特征在于，所述硝酸甘油微乳喷雾剂由如下方法制备：

称取硝酸甘油，薄荷素油、Tween80，无水乙醇，在15-30℃温度条件下，350～600r/min转速下搅拌至混合均匀后；加蒸馏水，搅拌至澄清，装进喷雾瓶中即得硝酸甘油微乳喷雾剂。

Images