CN103665058B

CN103665058B - 毛樱桃中苯丙蔗糖酯苷类化合物及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN103665058B
Application number: CN201310635426.XA
Authority: CN
Inventors: 宋少江; 彭缨; 赵伟; 李玲芝; 刘庆博
Original assignee: Shenyang Pharmaceutical University
Current assignee: Shenyang Pharmaceutical University
Priority date: 2013-11-29
Filing date: 2013-11-29
Publication date: 2016-08-17
Anticipated expiration: 2033-11-29
Also published as: CN103665058A

Abstract

本发明属于医药技术领域,涉及樱桃中苯丙蔗糖酯苷类化合物及其制备方法，所述5个新的具有抗肿瘤活性苯丙蔗糖酯苷类化合物3‑对香豆酰基‑1,4,6'‑三乙酰基蔗糖，3‑对香豆酰基‑2',3',6'‑三乙酰基蔗糖，3‑对香豆酰基‑1,4',6'‑三乙酰基蔗糖，3‑对香豆酰基‑3',4',6'‑三乙酰基蔗糖，3‑阿魏酰基‑1,2',6'‑三乙酰基蔗糖，五种化合物对MCF‑7人乳腺癌细胞系、A‑549人非小细胞性肺癌细胞、HeLa子宫颈癌细胞系、HT‑29人结肠腺癌细胞系均有较好的抑制作用，有望用于制备抗肿瘤药物。

Description

毛樱桃中苯丙蔗糖酯苷类化合物及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于医药技术领域,涉及樱桃中苯丙蔗糖酯苷类化合物及其制备方法，本发明还涉及该类新化合物在抗肿瘤生物活性方面的用途。

背景技术

肿瘤是目前危害人类健康最严重的疾病之一，据WHO统计，肿瘤已成为人类健康头号杀手。传统的化学药物治疗和手术、放疗等结合，虽成功的提高了多种恶性肿瘤的治愈率，但由于较强的副作用以及耐药性，使得寻找新的治疗肿瘤的药物刻不容缓。许多天然植物具有活血化瘀、清热解毒、扶正固本等功效而发挥抗肿瘤作用，可作用于肿瘤发生、发展的多个环节，具有多靶点、多环节、多效应的特点。其在抑制杀伤肿瘤细胞、改善症状与体征以及减轻放化疗不良反应、延长患者生存期等方面发挥重要作用。同时其具有提高机体免疫力，不易产生耐药性等特点，其抗肿瘤活性已得到国际公认，因此，从祖国医药宝库中寻找疗效确切的抗肿瘤天然药物，明确其药效物质基础，进而开发出高效低毒的新药，成为中医药领域多年研究的焦点。

蔷薇科植物毛樱桃（Prunus tomentosa）为广泛分布于中国北方的灌木植物，其药用历史悠久，其中毛樱桃叶温胃，健脾，止血，解毒，可治胃寒食积，腹泻，吐血，疮毒。有文献在樱桃属中报道分离到苯丙糖苷类化合物，许多苯丙糖苷类化合物具有很好抗肿瘤效果，而且毒副作用作用低，但此类化合物在植物中作为一种次级代谢产物其含量很低。但毛樱桃分布广泛，价格低廉且生存能力强，可作为大规模培育的具有潜在开发价值的药用植物来源。因此从毛樱桃中寻找抗癌活性好的活性化合物具有技术及经济基础。

发明内容

本发明的目的旨在从毛樱桃叶中寻找新的抗肿瘤前体药物，提供该苯丙蔗糖酯苷类化合物的提取、制备方法，并且研究它们的抗肿瘤生物活性和医药用途。本发明的另一个目的在于提供该类化合物的结构鉴定方法。

本发明所述5个新的具有抗肿瘤活性苯丙蔗糖酯苷类化合物3-对香豆酰基-1,4,6'-三乙酰基蔗糖，3-对香豆酰基-2',3',6'-三乙酰基蔗糖，3-对香豆酰基-1,4',6'-三乙酰基蔗糖，3-对香豆酰基-3',4',6'-三乙酰基蔗糖，3-阿魏酰基-1,2',6'-三乙酰基蔗糖，其结构如下所示：

本发明所述新的苯丙蔗糖酯苷类化合物的提取、制备方法如下：

取干燥的毛樱桃叶8～10kg用40～70L50%～80%的乙醇回流提取2～5次，每次1～3小时，合并提取液浓缩得浸膏1～1.5kg，将浸膏与2～4L水混悬后，分别采用石油醚，乙酸乙酯进行萃取，石油醚：混悬液体积比为0.6:1～1:1.5，乙酸乙酯：混悬液体积比为0.6:1～1:1.5。将乙酸乙酯萃取液浓缩得浸膏100～140g。浸膏采用快速减压柱色谱，以二氯甲烷-甲醇系统（三氯甲烷-甲醇系统）50:1～1:1逐渐洗脱，共收集15～25个馏分，经硅胶薄层层析检识，合并为A1～A4(50:1洗脱液为A1，30:1～10:1合并为A2，8:1～2:1合并为A3，1:1洗脱液为A4)，A2(69～90g)通过CHP20柱色谱除去部分色素后得B1(59～79g)，B1经聚酰胺柱色谱以二氯甲烷-甲醇（或其它极性相近溶剂系统，例三氯甲烷-甲醇系统）系统100:1～1:1梯度洗脱，共得10～20个馏分，通过硅胶薄层板层析检识，合并为C1～C3（100:1～50:1合并为C1，30:1～10:1合并为C2，5:1～1:1合并为C3）。C1经硅胶柱色谱以二氯甲烷-甲醇系统100:1～1:1梯度洗脱得到20～50个馏分，通过硅胶薄层板层析检识合并为19部分D1～D19。利用HPLC法以乙腈-水为流动相在D7-D10中制备得到化合物1-5（3-桂皮酰基-1,4,6'-三乙酰基蔗糖，3-桂皮酰基-2',3',6'-三乙酰基蔗糖，3-桂皮酰基-1,4',6'-三乙酰基蔗糖，3-桂皮酰基-3',4',6'-三乙酰基蔗糖，3-阿魏酰基-1,2',6'-三乙酰基蔗糖）。

本发明所述新的苯丙蔗糖酯苷类化合物具有较好的抗肿瘤活性。活性试验方法如下：

1.实验材料

1.1受试品：化合物

1.2实验细胞株及来源MAC-7、A549、Hela、HT-29

2.实验方法

2.1药物处理

药物的溶解

化合物1-5均为粉末状，使用DMSO溶解。配成浓度为100mmol/L的母液，储存于－20℃。临用时用相应的培养液将其稀释为10mmol/L、1mmol/L、100μmol/L进行实验。DMSO配置的样品进行实验时，DMSO的终浓度为1‰。文献报道5-fluorouracil具有抗肿瘤活性且结构与待测化合物类似，因此选取5-fluorouracil作为阳性对照药，浓度分别为10mmol/L、1mmol/L、100μmol/L。

给药处理

取对数生长期的细胞，调整适当的细胞密度,接种于96孔板内，100μL/well，培养于37℃，5%CO₂的培养箱内。培养24h后，将药物稀释为10mmol/L，1mmol/L，100μmol/L三个浓度，10μL/well，作用48h。分设空白组、给药组，每组设5个复孔。

2.2MTT法的测定方法

药物作用48h后，将细胞与0.25mg/ml MTT于37℃下共同孵育4h，吸除培养液后每孔加入100μl二甲基亚砜(DMSO)，完全溶解后使用酶标仪于490nm测定其光密度OD值。最后以空白组OD值为100%，计算各组细胞抑制率。

2.3.统计方法

全部资料采用SPSS（13.0）统计软件包进行检验分析。各组数据用均值±标准误（Mean±S.E.）表示，采用One-Way ANOVA评价整体性差异，并进行Dunnett或Dunnett’sT3检验进行组间比较。

3.实验结果

表1化合物对肿瘤细胞的IC₅₀(μM/L)

由上述实验结果可看本发明所涉药物作用48h之后，5种化合物对四种细胞株均具有一定杀伤作用。其中化合物1的作用最为明显。化合物5对MCF-7和A549的作用比较明显,化合物3对A549和Hela的作用较强。

本发明所涉苯丙蔗糖酯苷类新化合物，对MCF-7人乳腺癌细胞系、A-549人非小细胞性肺癌细胞、HeLa子宫颈癌细胞系、HT-29人结肠腺癌细胞系等，可用于开发抗肿瘤、抗癌类药物，尤其针对临床化疗阶段药物。

本发明制备方法简单，重现性好，提取纯度高。获得的化合物具有较好的抗肿瘤活性作用。

附图说明

图1为1的¹H-NMR。

图2为1的¹³C-NMR。

图3为1的HSQC。

图4为1的HMBC。

图5为2的¹H-NMR。

图6为2的¹³C-NMR。

图7为2的HSBC。

图8为3的¹H-NMR。

图9为3的¹³C-NMR。

图10为3的HMBC。

图11为4的¹H-NMR。

图12为4的¹³C-NMR。

图13为4的HMBC。

图14为5的¹H-NMR。

图15为5的¹³C-NMR。

图16为5的HMBC。

具体实施方式

制备实施例1

取干燥的毛樱桃叶9.5kg用60L70%的乙醇回流提取三次，每次两小时，合并提取液浓缩得浸膏1.2kg，将浸膏与3L水混悬后，分别用石油醚：混悬液=1:1和乙酸乙酯：混悬液=1:1萃取。将乙酸乙酯萃取液浓缩得浸膏120g。浸膏采用快速减压柱色谱，以二氯甲烷-甲醇系统50:1、30:1、15:1、10:1、5:1、2:1、1:1逐渐洗脱，每500ml为一馏分，共收集21个馏分，经硅胶薄层层析检识，合并为4份A1～A4(50:1洗脱液为A1，30:1～10:1合并为A2，8:1～2:1合并为A3，1:1洗脱液为A4)，其中A2为主要馏分，重量为75g，A2通过CHP20柱色谱以90%甲醇-水（或乙醇-水）除去部分色素后得B1(69g)，B1经聚酰胺柱色谱以二氯甲烷-甲醇系统100:1、50:1、30:1、15:1、10:1、5:1、1:1梯度洗脱，共得17个馏分，通过硅胶薄层板层析检识，合并为3部分C1～C3（100:1～50:1合并为C1，30:1～10:1合并为C2，5:1～1:1合并为C3），其中C232g，主要为黄酮类化合物，C1为18g，C3为19g。C1经硅胶柱色谱以二氯甲烷-甲醇系统100:1、50:1、30:1、15:1、10:1、5:1、2:1、1:1梯度洗脱得到43个馏分，通过硅胶薄层板层析检识合并为19部分D1～D19。

从D7中以乙腈-水系统23:77在液相色谱柱中制得化合物1，在D8中以乙腈-水系统20:80在液相色谱柱中制得化合物2，在D9中以乙腈-水系统21:79在液相色谱柱中制得化合物3和4，在D10中以乙腈-水系统21:79在液相色谱柱中制得化合物5。

制备实施例2

取干燥的毛樱桃叶9kg用60L65%的乙醇回流提取三次，每次三小时，合并提取液浓缩得浸膏1.3kg，将浸膏与3.5L水混悬后，分别用石油醚：混悬液=1:1和乙酸乙酯：混悬液=1:1萃取。将乙酸乙酯萃取液浓缩得浸膏130g。浸膏采用快速减压柱色谱，以二氯甲烷-甲醇系统50:1、30:1、15:1、10:1、5:1、2:1、1:1逐渐洗脱，每500ml为一馏分，共收集21个馏分，经硅胶薄层层析检识，合并为4份A1～A4(50:1洗脱液为A1，30:1～10:1合并为A2，8:1～2:1合并为A3，1:1洗脱液为A4)，其中A2为主要馏分，重量为84g，A2通过CHP20柱色谱以90%甲醇-水（或乙醇-水）除去部分色素后得B1(75g)，B1经聚酰胺柱色谱以二氯甲烷-甲醇系统100:1、50:1、30:1、15:1、10:1、5:1、1:1梯度洗脱，共得21个馏分，通过硅胶薄层板层析检识，合并为3部分C1～C3（100:1～50:1合并为C1，30:1～10:1合并为C2，5:1～1:1合并为C3），其中C239g，主要为黄酮类化合物，C1为19g，C3为17g。C1经硅胶柱色谱以二氯甲烷-甲醇系统100:1、50:1、30:1、15:1、10:1、5:1、2:1、1:1梯度洗脱得到40个馏分，通过硅胶薄层板层析检识合并为22部分D1～D22。

从D8中以乙腈-水系统24:76在液相色谱柱中制得化合物1，在D8中以乙腈-水系统19:81在液相色谱柱中制得化合物2，在D9中以乙腈-水系统21:79在液相色谱柱中制得化合物3和4，在D10中以乙腈-水系统20:80在液相色谱柱中制得化合物5。

制备实施例3

取干燥的毛樱桃叶8.5kg用55L70%的乙醇回流提取三次，每次二小时，合并提取液浓缩得浸膏1.1kg，将浸膏与3.0L水混悬后，分别用石油醚：混悬液=1:1和乙酸乙酯：混悬液=1:1萃取将乙酸乙酯萃取液浓缩得浸膏110g。浸膏采用快速减压柱色谱，以二氯甲烷-甲醇系统50:1、30:1、15:1、10:1、5:1、1:1逐渐洗脱，每500ml为一馏分，共收集18个馏分，经硅胶薄层层析检识，合并为4份A1～A4（50:1洗脱液为A1，30:1～10:1合并为A2，8:1～2:1合并为A3，1:1洗脱液为A4)，其中A2为主要馏分，重量为79g，A2通过CHP20柱色谱以90%甲醇-水（或乙醇-水）除去部分色素后得B1(71g)，B1经聚酰胺柱色谱以二氯甲烷-甲醇系统100:1、50:1、30:1、15:1、10:1、5:1、1:1梯度洗脱，共得21个馏分，通过硅胶薄层板层析检识，合并为3部分C1～C3（100:1～50:1合并为C1，30:1～10:1 合并为C2，5:1～1:1合并为C3），其中C235g，主要为黄酮类化合物，C1为19g，C3为17g。C1经硅胶柱色谱以二氯甲烷-甲醇系统100:1、50:1、30:1、15:1、10:1、5:1、1:1梯度洗脱得到28个馏分，通过硅胶薄层板层析检识合并为20部分D1～D20。

从D7中以乙腈-水系统23:77在液相色谱柱中制得化合物1，在D8中以乙腈-水系统19:81在液相色谱柱中制得化合物2，在D9中以乙腈-水系统20:80在液相色谱柱中制得化合物3和4，在D10中以乙腈-水系统20:80在液相色谱柱中制得化合物5。

制备实施例4

取干燥的毛樱桃叶9kg用60L75%的乙醇回流提取四次，每次二小时，合并提取液浓缩得浸膏1.2kg，将浸膏与3.5L水混悬后，分别用石油醚：混悬液=1:1和乙酸乙酯：混悬液=1:1萃取。将乙酸乙酯萃取液浓缩得浸膏120g。浸膏采用快速减压柱色谱，以二氯甲烷-甲醇系统50:1、30:1、15:1、10:1、5:1、1:1逐渐洗脱，每500ml为一馏分，共收集18个馏分，经硅胶薄层层析检识，合并为4份A1～A4（50:1洗脱液为A1，30:1～10:1合并为A2，8:1～2:1合并为A3，1:1洗脱液为A4)，其中A2为主要馏分，重量为81g，A2通过CHP20柱色谱以90%甲醇-水（或乙醇-水）除去部分色素后得B1(73g)，B1经聚酰胺柱色谱以二氯甲烷-甲醇系统100:1、50:1、30:1、15:1、10:1、5:1、1:1梯度洗脱，共得21个馏分，通过硅胶薄层板层析检识，合并为3部分C1～C3（100:1～50:1合并为C1，30:1～10:1合并为C2，5:1～1:1合并为C3），其中C236g，主要为黄酮类化合物，C1为19g，C3为18g。C1经硅胶柱色谱以二氯甲烷-甲醇系统100:1、50:1、30:1、15:1、10:1、5:1、2:1、1:1梯度洗脱得到32个馏分，通过硅胶薄层板层析检识合并为21部分D1～D21。

从D7中以乙腈-水系统24:76在液相色谱柱中制得化合物1，在D8中以乙腈-水系统19:81在液相色谱柱中制得化合物2，在D9中以乙腈-水系统21:79在液相色谱柱中制得化合物3和4，在D10中以乙腈-水系统21:79在液相色谱柱中制得化合物5。

实验例1：

淡黄色色无定形粉末（甲醇），易溶于甲醇。高分辨质谱给出准分子离子峰m/z637.1971[M+Na]⁺，结合¹H，¹³C NMR谱，确定分子式为C₂₈H₃₆O₁₇。

化合物1（3mg）经3ml2N三氟乙酸在密封瓶中110℃放置6h水解，反应液用15ml水稀释后用5ml乙酸乙酯萃取三次并合并，合并液用水再次萃取后将乙酸乙酯合并液旋转蒸发得粉末，粉末用甲醇溶解后用HPLC法与标准品对照显示化合物1水解物中含对香豆酸。反应液萃取后的水层加甲醇后反复旋蒸至中性干燥残渣。残渣用0.06ml吡啶溶解，然后加0.06ml六甲基二硅氮烷和0.02ml三甲基氯硅烷，混合液在60℃搅拌30min。静置后上清液用GC分析，分析结果与标准糖对照显示水解液中含D-葡萄糖和D-果糖。在¹H-NMR中，有七个连氧次甲基信号(δ_H5.47,4.43,4.08,3.39,3.57,3.25,4.12)，三个连氧乙基[δ_H4.14(2H);4.44and4.38;4.54and4.10]，二个烯烃质子[δ_H6.42,(d,J=15.9Hz);7.72(d,J=15.9Hz)]和一个AA'BB'耦合的芳烃信号[δ_H6.81(d,J=8.4Hz,2H),7.52(d,J=8.4Hz,2H)]。通过典型的α,β-不饱和酮耦合数据δc168.4,δc114.3,δc147.9,δ_H6.42,(d,J=15.9Hz)andδ_H7.72(d,J=15.9Hz)及苯环的低场区碳信号δc127.1,δc131.5,δc116.8,δc161.5,δc116.8,δc131.5可知化合物1中含有一个对香豆酰基。根据酸水解及HMBC谱中端基Hδ_H5.39(d,J=3.6Hz)与一端基碳δc93.0相关提示化合物1中含有二糖结构且为α-D-葡萄糖-(1-2)-β-D-果糖结构。

进一步分析HMBC谱可知蔗糖上H-1(δ_H4.14,2H)、H-4(δ_H4.43)、H-6'(δ_H4.55,δ_H4.10,2H)分别与乙酰基中羰基相关，提示有三个乙酰基分别连接在此三个H上；在HMBC谱中还可以看到蔗糖H-3(δ_H5.47)和对香豆酰基的羰基相关，故化合物1结构可由此确定，命名为3-对香豆酰基-1,4,6'-三乙酰基蔗糖。其¹H NMR谱，¹³C NMR谱信号归属见表2及表3，HMBC如下，相关图谱见附图1-图4。

表2化合物1-5的¹H NMR数据

表3化合物1-5的¹³C NMR数据

实验例2

淡黄色色无定形粉末（甲醇），易溶于甲醇。高分辨质谱给出准分子离子峰m/z637.1978[M+Na]⁺，结合¹H、¹³C NMR谱，确定分子式为C₂₈H₃₆O₁₇。

化合物2（3mg）经3ml2N三氟乙酸在密封瓶中110℃放置6h水解，反应液用15ml水稀释后用5ml乙酸乙酯萃取三次并合并，合并液用水再次萃取后将乙酸乙酯合并液旋转蒸发得粉末，粉末用甲醇溶解后用HPLC法与标准品对照显示化合物2水解物中含对香豆酸。反应液萃取后的水层加甲醇后反复旋蒸至中性干燥残渣。残渣用0.06ml吡啶溶解，然后加0.06ml六甲基二硅氮烷和0.02ml三甲基氯硅烷，混合液在60℃搅拌30min。静置后上清液用GC分析，分析结果与标准糖对照显示水解液中含D-葡萄糖和D-果糖。在¹H-NMR中，有七个连氧次甲基信号，三个连氧乙基，二个烯烃质子和一个AA'BB'耦合的芳烃信号。通过典型的α,β-不饱和酮耦合数据δc168.3,δc114.6,δc147.6,δ_H6.44,(d,J=15.9Hz)andδ_H7.72(d,J=15.9Hz)及苯环的低场区碳信号δc127.1,δc131.5,δc116.8,δc161.5,δc116.8,δc131.5可知化合物2中含有一个对香豆酰基。根据酸水解及HMBC谱中端基Hδ_H5.56(d,J=3.7Hz)与一端基碳δc92.7相关提示化合物2中含有二糖结构且为α-D-葡萄糖-(1-2)-β-D-果糖结构。

进一步分析HMBC谱可知蔗糖上H-2'、H-3'、H-6'分别与乙酰基中羰基相关，提示有三个乙酰基分别连接在此三个H上；在HMBC谱中还可以看到蔗糖H-3和对香豆酰基的羰基相关，故化合物2结构可由此确定，命名为3-对香豆酰基-2',3',6'-三乙酰基蔗糖。其¹H NMR谱，¹³C NMR谱信号归属见表2、表3，HMBC如下，相关图谱见附图5-图7。

实验例3

淡黄色色无定形粉末（甲醇），易溶于甲醇。高分辨质谱给出准分子离子峰m/z637.1979[M+Na]⁺，结合¹H、¹³C NMR谱，确定分子式为C₂₈H₃₆O₁₇。

化合物3（3mg）经3ml2N三氟乙酸在密封瓶中110℃放置6h水解，反应液用15ml水稀释后用5ml乙酸乙酯萃取三次并合并，合并液用水再次萃取后将乙酸乙酯合并液旋转蒸发得粉末，粉末用甲醇溶解后用HPLC法与标准品对照显示化合物3水解物中含对香豆酸。反应液萃取后的水层加甲醇后反复旋蒸至中性干燥残渣。残渣用0.06ml吡啶溶解，然后加0.06ml六甲基二硅氮烷和0.02ml三甲基氯硅烷，混合液在60℃搅拌30min。静置后上清液用GC分析，分析结果与标准糖对照显示水解液中含D-葡萄糖和D-果糖。在¹H-NMR中，有七个连氧次甲基信号，三个连氧乙基，二个烯烃质子和一个AA'BB'耦合的芳烃信号。通过典型的α,β-不饱和酮耦合数据δc168.1,δc114.3,δc147.7,δ_H6.40,(d,J=15.9Hz)andδ_H7.72(d,J=15.9Hz)及苯环的低场区碳信号δc127.1,δc131.4,δc116.9,δc161.7,δc116.9,δc131.4可知化合物3中含有一个对香豆酰基。根据酸水解及HMBC谱中端基Hδ_H5.49(d,J=3.6Hz)与一端基碳δc93.1相关提示化合物3中含有二糖结构且为α-D-葡萄糖-(1-2)-β-D-果糖结构。

进一步分析HMBC谱可知蔗糖上H-1、H-4'、H-6'分别与乙酰基中羰基相关，提示有三个乙酰基分别连接在此三个H上；在HMBC谱中还可以看到蔗糖H-3(δ_H4.43)和对香豆酰基的羰基相关，故化合物3结构可由此确定，命名为3-对香豆酰基-1,4',6'-三乙酰基蔗糖。其¹H NMR谱，¹³C NMR谱信号归属见表3，HMBC如下，相关图谱见附图8-图10。

实验例4

淡黄色色无定形粉末（甲醇），易溶于甲醇。高分辨质谱给出准分子离子峰m/z637.1970[M+Na]⁺，结合¹H、¹³C NMR谱，确定分子式为C₂₈H₃₆O₁₇。

化合物4（3mg）经3ml2N三氟乙酸在密封瓶中110℃放置6h水解，反应液用15ml水稀释后用5ml乙酸乙酯萃取三次并合并，合并液用水再次萃取后将乙酸乙酯合并液旋转蒸发得粉末，粉末用甲醇溶解后用HPLC法与标准品对照显示4水解物中含对香豆酸。反应液萃取后的水层加甲醇后反复旋蒸至中性干燥残渣。残渣用0.06ml吡啶溶解，然后加0.06ml六甲基二硅氮烷和0.02ml三甲基氯硅烷，混合液在60℃搅拌30min。静置后上清液用GC分析，分析结果与标准糖对照显示水解液中含D-葡萄糖和D-果糖。在¹H-NMR中，有七个连氧次甲基信号，三个连氧乙基，二个烯烃质子和一个AA'BB'耦合的芳烃信号。通过典型的α,β-不饱和酮耦合数据δc168.1,δc114.6,δc147.7,δ_H6.42,(d,J=15.9Hz)andδ_H7.74(d,J=15.9Hz)及苯环的低场区碳信号δc127.3,δc131.5,δc116.8,δc161.4,δc116.8,δc131.5可知化合物4中含有一个对香豆酰基。根据酸水解及HMBC谱中端基Hδ_H5.54(d,J=3.6Hz)与端基碳δc92.8相关提示化合物4中含有二糖结构且为α-D-葡萄糖-(1-2)-β-D-果糖结构。

进一步分析HMBC谱可知蔗糖上H-3'、H-4'、H-6'分别与乙酰基中羰基相关，提示有三个乙酰基分别连接在此三个H上；在HMBC谱中还可以看到蔗糖H-3(δ_H5.40)和对香豆酰基的羰基相关，故化合物4结构可由此确定，命名为3-对香豆酰基-3',4',6'-三乙酰基蔗糖。其¹H NMR谱，¹³C NMR谱信号归属见表3，HMBC如下，相关图谱见附图11-图13。

实验例5

淡黄色色无定形粉末（甲醇），易溶于甲醇。高分辨质谱给出准分子离子峰m/z637.1970[M+Na]⁺，结合¹H、¹³C NMR谱，确定分子式为C₂₉H₃₈O₁₈。

化合物5（3mg）经3ml2N三氟乙酸在密封瓶中110℃放置6h水解，反应液用15ml水稀释后用5ml乙酸乙酯萃取三次并合并，合并液用水再次萃取后将乙酸乙酯合并液旋转蒸发得粉末，粉末用甲醇溶解后用HPLC法与标准品对照显示化合物5水解物中含对香豆酸。反应液萃取后的水层加甲醇后反复旋蒸至中性干燥残渣。残渣用0.06ml吡啶溶解，然后加0.06ml六甲基二硅氮烷和0.02ml三甲基氯硅烷，混合液在60℃搅拌30min。静置后上清液用GC分析，分析结果与标准糖对照显示水解液中含D-葡萄糖和D-果糖。在¹H-NMR中，有七个连氧次甲基信号，三个连氧乙基，二个烯烃质子和一个ABX耦合的芳烃信号。通过典型的α,β-不饱和酮耦合数据δc168.3,δc114.5,δc148.2,δ_H6.47,(d,J=15.8Hz)andδ_H7.71(d,J=15.8Hz)及苯环的低场区碳信号δc127.6,δc112.0,δc149.4,δc150.9,δc116.5,δc124.5可知化合物5中含有一个阿魏酰基。根据酸水解及HMBC谱中端基Hδ_H5.57(d,J=3.6Hz)与一端基碳δc90.8相关提示化合物5中含有二糖结构且为α-D-葡萄糖-(1-2)-β-D-果糖结构。

进一步分析HMBC谱可知蔗糖上H-1、H-2'、H-6'分别与乙酰基中羰基相关，提示有三个乙酰基分别连接在此三个H上；在HMBC谱中还可以看到蔗糖H-3(δ_H5.42)和阿魏酰基的羰基相关，故化合物5结构可由此确定。命名为3-阿魏酰基-1,2',6'-三乙酰基蔗糖。其 ¹HNMR谱，¹³C NMR谱信号归属见表3，HMBC如下，相关图谱见附图14-图16。

Claims

1.苯丙蔗糖酯苷类化合物的制备方法，其特征在于，取干燥的毛樱桃叶用50%~80%乙醇提取，毛樱桃叶与乙醇的比例为:1：5~1：10，合并提取液浓缩得浸膏，将浸膏与水混悬后，分别采用石油醚，乙酸乙酯进行萃取；将乙酸乙酯萃取液浓缩得浸膏，浸膏采用快速减压柱色谱，以二氯甲烷-甲醇系统 50:1 ~1:1逐渐洗脱，共收集15~25个馏分，经硅胶薄层层析检识，合并为A1~A4，其中，50:1洗脱液为A1，30:1~10:1合并为A2，8:1~2:1合并为A3，1:1洗脱液为A4， A2通过CHP20柱色谱除去部分色素后得B1，B1经聚酰胺柱色谱以二氯甲烷-甲醇系统 100:1~1:1梯度洗脱，共得10~20个馏分，通过硅胶薄层板层析检识，合并为C1~C3，其中，100:1~50:1合并为C1，30:1~10:1合并为C2， 5:1~1:1合并为C3，C1经硅胶柱色谱以二氯甲烷-甲醇系统 100:1 ~1:1梯度洗脱得到20~50个馏分，通过硅胶薄层板层析检识合并为19部分D1~D19，利用HPLC法以乙腈-水为流动相在D7-D10中制备得到化合物1-5；

。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的提取为回流提取2~5次，每次1~3小时。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，萃取中石油醚：混悬液体积比为0.6:1~1:1.5，乙酸乙酯：混悬液体积比为0.6:1~1:1.5。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的乙腈-水的比例为15：85-25:75。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，取干燥的毛樱桃叶用55%~75%的乙醇提取。

6.权利要求1所述的制备方法制备的苯丙蔗糖酯苷类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用，所述的肿瘤为乳腺癌、非小细胞性肺癌、结肠腺癌。