CN103643480A - 可降解的复合型氧化微晶纤维素止血材料的制备方法 - Google Patents
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Abstract
可降解的复合型氧化微晶纤维素止血材料的制备方法，它涉及复合型氧化微晶纤维素止血材料的制备方法。它要解决现有止血材料的微观尺寸普遍较大，在止血过程中与创口接触时，不利于血液的迅速吸收的问题。方法：一、制备活化的微晶纤维素；二、制备氧化微晶纤维素，即产品A；三、制备氧化微晶纤维素钠或氧化微晶纤维素钾，即产品B；四、制备粘胶纤维纱布；五、制备氧化粘胶纤维纱布，即产品C；六、制备碱化粘胶纱布，即产品D；七、A和C混合得产品E；B和C混合得产品F；A和D混合得产品G；B和D混合得产品H。本发明止血材料具有更大的比表面积，使其可以具有更好的吸附性能，与血液作用时将具有更大的接触面，止血速度均大大缩短。
Description
技术领域
本发明涉及复合型氧化微晶纤维素止血材料的制备方法。
背景技术
微晶纤维素的概念由Battista等于二十世纪五、六十年代提出。微晶纤维素有三个基本特征：第一，平均聚合度达到极限聚合度值；第二，结晶度高于原纤维素，具有纤维素的晶格特征，即四角分子链与晶胞中心处于同一方向平行排列；第三，吸水性极强，并且在水介质中经强力剪切作用后具有生成凝胶体的能力。微晶纤维素为白色或类白色、无臭、无味、细微、易流动的干燥多孔性颗粒，不溶于水、稀酸、稀氢氧化钠和大多数有机溶剂，颗粒大小在20～80μm，极限聚合度一般在15～375，具有高度变形性，不具有纤维性而流动性强微晶纤维素(Microcrystalline Cellulose，MCC)是由纤维素在一定条件下酸水解，当聚合度下降到趋于平衡时所得产品。这时其聚合度称为平衡聚合度(LODP)，因纤维素的来源和水解条件不同，LODP在80-150左右变化。
微晶纤维素的表征指标主要有聚合度、晶型、结晶度、粒度、吸水值、润湿热、崩解性能、比表面积、填积面积、离心指数和特性粘数等。由于微晶纤维素是通过纤维素的水解来制备，因此与纤维素相比，微晶纤维素具有结晶度更高而聚合度更低的特点，其结晶度大小与原料及测试方法有关。微晶纤维素的结晶度通常在0.7～0.8之间，而聚合度在50-500之间。
微晶纤维素的形态结构使其在物化性质上非常独特，包括吸水性、流动性和可压性等。利用这些性质，微晶纤维素可广泛应用于医药卫生、食品轻工、日用精细化工等领域，成为一种新兴的天然高分子功能材料。
氧化纤维素(Oxidized cellulose，OC)和氧化再生纤维素(Oxidized regenerated cellulose，ORC)，由于其良好的生物相容性和可降解性的特点，可作为止血材料被应用到医疗领域。目前，临床应用范围最广的是美国强生公司的产品——医用可吸收止血纱布“速即纱”(Surgical)。“速即纱”比表面积相对较大，成本高，止血慢，需要2～8分钟达到止血，比较适合出血量较小的创面，而对出血严重的部位不能有效及时地止血。针对现有产品微观尺寸普遍较大，在止血过程中与创口接触时，不利于血液的迅速吸收，产品现有形态不利于与其他产品结合、生产过程中氧化液浪费严重等问题，亟待开发更好的替代产品。
发明内容
本发明是要解决现有止血材料的微观尺寸普遍较大，在止血过程中与创口接触时，不利于血液的迅速吸收，形态不利于与其他产品结合，以及生产过程中氧化液浪费严重的问题，而提供可降解的复合型氧化微晶纤维素止血材料的制备方法。
可降解的复合型氧化微晶纤维素止血材料的制备方法，具体是按照以下步骤进行的：
一、采用食品级标准的微晶纤维素，经过三重蒸馏水洗涤，40～55℃下烘干，得到活化的微晶纤维素；
二、采用二氧化氮/环己烷体系作为氧化剂溶液，对步骤一中所得活化的微晶纤维素进行氧化，然后经环己烷粗洗、抽滤、体积分数为50％～70％的乙醇水溶液抽滤冲洗和无水乙醇精洗，再在-20～-55℃下真空冷冻干燥16～32h，于0～4℃密封储存，得到氧化微晶纤维素，即产品A；其中，所述氧化剂溶液中二氧化氮的质量分数为20％～30％；活化的微晶纤维素与氧化剂溶液的质量体积比为1.5～10g∶42.6ml，反应温度为18～19.5℃，反应时间为40～88h；
三、将步骤三中所得氧化微晶纤维素放入碱溶液中，反应温度为10～30℃，持续浸泡1.5～4h，然后使用体积分数为80％的乙醇水溶液抽滤冲洗2～3次，再用无水乙醇抽滤冲洗3～5次，然后在-30～-60℃下冷冻干燥24～60h，得到氧化微晶纤维素钠或氧化微晶纤维素钾，即产品B；其中，所述碱溶液为浓度0.3～0.5mol/L的氢氧化钠溶液或者氢氧化钾溶液；氧化微晶纤维素与碱溶液的质量体积比为40～75g∶100ml；
四、以木浆粘胶长纤为原料，采用针织机制备粘胶纤维纱布；其中，所述针织机幅宽为8～18m，牵引带间距为4.2～6.2m，牵引带宽度为4.2～6.2m，牵引速度为180～360r/m，网眼宽度为0.5～2.5mm，纱布平均厚度为1.0～2.5mm；
五、采用二氧化氮/环己烷体系作为氧化剂溶液，对步骤四中所得粘胶纤维纱布进行氧化，然后经环己烷粗洗、抽滤、体积分数为50％～70％的乙醇水溶液抽滤冲洗和无水乙醇精洗，再在-20～-55℃下真空冷冻干燥40～88h，于0～4℃密封储存，得到氧化粘胶纤维纱布，即产品C；其中，所述氧化剂溶液中二氧化氮的质量分数为17％～23％；粘胶纤维纱布与氧化剂溶液的质量体积比为0.5～2.5g∶42.6ml，反应温度为18～19.5℃，反应时间为40～88h；
六、将步骤五中所得氧化粘胶纤维纱布放入碱溶液中，反应温度为10～30℃，反应时间0.5～48h，然后使用体积分数为80％的乙醇水溶液冲洗2～3次，再用无水乙醇冲洗3～5次，然后在-10～-80℃下冷冻干燥12～48h，得到碱化粘胶纱布，即产品D；其中，所述碱溶液为浓度0.2～1.0mol/L的氢氧化钠溶液或者氢氧化钾溶液；氧化粘胶纤维纱布与碱溶液的质量体积比为20～55g∶100ml；
七、按照质量比1～10∶20将产品A和产品C混合，获得复合产品E；按照质量比1～8∶20将产品B和产品C混合，获得复合产品F；按照质量比1～10∶20将产品A和产品D混合，获得复合产品G；按照质量比1～8∶20将产品B和产品D混合，获得复合产品H；即完成可降解的复合型氧化微晶纤维素止血材料的制备。
本发明采用廉价的食品级微晶纤维素经多步处理制备了可降解的复合型氧化微晶纤维素止血材料。
现有止血材料采用织物或海绵形态的纤维素原料，由于其密度较小，容易在反应液上漂浮，同时在反应过程中容易变形伸展，从而在反应釜中占有较大体积。这时，由于反应过程中氧化液需要浸没原料，此时的氧化液往往是过量的。而本发明中粉末状的氧化微晶纤维素在氧化液中不会变形伸展，可以更紧密的排布在反应釜中，氧化液不必过量，因此比较节省氧化液。
本发明制备可降解的复合型氧化微晶纤维素止血材料，其孔隙率达到了90％，接近海绵的孔隙率，相比普通纱布和速即纱，具有更高的孔隙率，即更大的比表面积，这使得其可以具有更好的吸附性能，与血液作用时将具有更大的接触面，止血速度均大大缩短，尤其是本发明复合产品H的静脉出血止血效果非常优异。
本发明制备可降解的复合型氧化微晶纤维素止血材料，其整体止血效果比速即纱、普通纱布均要好，具有较好的止血效果，尤其在肝脏、脾脏止血中甚佳，对血小板的吸附性能好，对创面渗血更有效。尤其是本发明中复合产品H能明显缩短家兔的出、凝血时间，亦能缩短临床手术术中止血时间，从而缩短手术时间。
本发明制备可降解的复合型氧化微晶纤维素止血材料，水溶性极佳，在制备过程中降低了原材料的酸性，扩大了材料的应用范围，使其不仅可以用于体外创面、部分脏器创面，更可以用于对酸性材料敏感的脑部手术中。
本发明制备可降解的复合型氧化微晶纤维素止血材料，植入体内4周之后，肉眼没有观察到任何水肿等任何异常炎症，并且手术伤口已完全愈合，观察不到术后痕迹，在全部的组织学病理图上均未观察到残余的植入样品，并且切片上均未观察到任何明显组织反应，可见材料的具有良好的可降解性。
本发明制备可降解的复合型氧化微晶纤维素止血材料，作为粉末状的氧化微晶纤维素，由于其宏观颗粒单位体积小、可塑性高，因此可以容易的将其负载在创可贴、绷带、医用纱布等载体上，完美实现与其他产品的结合。
附图说明
图1为实施例中可降解的复合型氧化微晶纤维素止血材料的植入部位示意图；
图2为实施例中可降解的复合型氧化微晶纤维素止血材料中产品E的植入区域的放大160x的组织学病理图；
图3为实施例中可降解的复合型氧化微晶纤维素止血材料中产品E的植入区域的放大640x的组织学病理图；
图4为实施例中可降解的复合型氧化微晶纤维素止血材料中产品F的植入区域的放大160x的组织学病理图；
图5为实施例中可降解的复合型氧化微晶纤维素止血材料中产品F的植入区域的放大640x的组织学病理图；
图6为实施例中可降解的复合型氧化微晶纤维素止血材料中产品G的植入区域的放大160x的组织学病理图；
图7为实施例中可降解的复合型氧化微晶纤维素止血材料中产品G的植入区域的放大640x的组织学病理图；
图8为实施例中可降解的复合型氧化微晶纤维素止血材料中产品H的植入区域的放大160x的组织学病理图；
图9为实施例中可降解的复合型氧化微晶纤维素止血材料中产品H的植入区域的放大640x的组织学病理图。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举的具体实施方式，还包括各具体实施方式之间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式可降解的复合型氧化微晶纤维素止血材料的制备方法，具体是按照以下步骤进行的：
一、采用食品级标准的微晶纤维素，经过三重蒸馏水洗涤，40～55℃下烘干，得到活化的微晶纤维素；
二、采用二氧化氮/环己烷体系作为氧化剂溶液，对步骤一中所得活化的微晶纤维素进行氧化，然后经环己烷粗洗、抽滤、体积分数为50％～70％的乙醇水溶液抽滤冲洗和无水乙醇精洗，再在-20～-55℃下真空冷冻干燥16～32h，于0～4℃密封储存，得到氧化微晶纤维素，即产品A；其中，所述氧化剂溶液中二氧化氮的质量分数为20％～30％；活化的微晶纤维素与氧化剂溶液的质量体积比为1.5～10g∶42.6ml，反应温度为18～19.5℃，反应时间为40～88h；
三、将步骤三中所得氧化微晶纤维素放入碱溶液中，反应温度为10～30℃，持续浸泡1.5～4h，然后使用体积分数为80％的乙醇水溶液抽滤冲洗2～3次，再用无水乙醇抽滤冲洗3～5次，然后在-30～-60℃下冷冻干燥24～60h，得到氧化微晶纤维素钠或氧化微晶纤维素钾，即产品B；其中，所述碱溶液为浓度0.3～0.5mol/L的氢氧化钠溶液或者氢氧化钾溶液；氧化微晶纤维素与碱溶液的质量体积比为40～75g∶100ml；
四、以木浆粘胶长纤为原料，采用针织机制备粘胶纤维纱布；其中，所述针织机幅宽为8～18m，牵引带间距为4.2～6.2m，牵引带宽度为4.2～6.2m，牵引速度为180～360r/m，网眼宽度为0.5～2.5mm，纱布平均厚度为1.0～2.5mm；
五、采用二氧化氮/环己烷体系作为氧化剂溶液，对步骤四中所得粘胶纤维纱布进行氧化，然后经环己烷粗洗、抽滤、体积分数为50％～70％的乙醇水溶液抽滤冲洗和无水乙醇精洗，再在-20～-55℃下真空冷冻干燥40～88h，于0～4℃密封储存，得到氧化粘胶纤维纱布，即产品C；其中，所述氧化剂溶液中二氧化氮的质量分数为17％～23％；粘胶纤维纱布与氧化剂溶液的质量体积比为0.5～2.5g∶42.6ml，反应温度为18～19.5℃，反应时间为40～88h；
六、将步骤五中所得氧化粘胶纤维纱布放入碱溶液中，反应温度为10～30℃，反应时间0.5～48h，然后使用体积分数为80％的乙醇水溶液冲洗2～3次，再用无水乙醇冲洗3～5次，然后在-10～-80℃下冷冻干燥12～48h，得到碱化黏胶纱布，即产品D；其中，所述碱溶液为浓度0.2～1.0mol/L的氢氧化钠溶液或者氢氧化钾溶液；氧化粘胶纤维纱布与碱溶液的质量体积比为20～55g∶100ml；
七、按照质量比1～10∶20将产品A和产品C混合，获得复合产品E；按照质量比1～8∶20将产品B和产品C混合，获得复合产品F；按照质量比1～10∶20将产品A和产品D混合，获得复合产品G；按照质量比1～8∶20将产品B和产品D混合，获得复合产品H；即完成可降解的复合型氧化微晶纤维素止血材料的制备。
本实施方式中步骤三得到的氧化微晶纤维素钠或氧化微晶纤维素钾，尺寸均为1～20μm；通过控制反应物的配比和反应时间等条件使氧化微晶纤维素中的羧基中和度介于1％～98％，优选的中和度为65％～80％。
本实施方式中步骤六得到的碱化粘胶纱布，通过控制反应物的配比和反应时间等条件使氧化粘胶纤维纱布中的羧基中和度介于1％～98％，优选的中和度为70％～95％。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是，步骤二中在-35℃下真空冷冻干燥24h，于1℃密封储存，得到氧化微晶纤维素，即产品A。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是，步骤二中活化的微晶纤维素与氧化剂溶液的质量体积比为4g∶42.6ml。其它步骤及参数与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是，步骤三中将步骤三中所得氧化微晶纤维素放入碱溶液中，反应温度为20℃，持续浸泡2h，然后使用体积分数为80％的乙醇水溶液抽滤冲洗3次，再用无水乙醇抽滤冲洗4次，然后在-40℃下冷冻干燥32h，得到氧化微晶纤维素钠或氧化微晶纤维素钾，即产品B。其它步骤及参数步骤及参数与具体实施方式一至三之一相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是，步骤三中氧化微晶纤维素与碱溶液的质量体积比为55g∶100ml。其它步骤及参数与具体实施方式一至四之一相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是，步骤四中所述针织机幅宽为12m，牵引带间距为5.2m，牵引带宽度为5.2m，牵引速度为240r/m，网眼宽度为1.5mm，纱布平均厚度为1.5mm。其它步骤及参数与具体实施方式一至五之一相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是，步骤五中在-35℃下真空冷冻干燥66h，于1℃密封储存，得到氧化粘胶纤维纱布，即产品C。其它步骤及参数与具体实施方式一至六之一相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是，步骤五中粘胶纤维纱布与氧化剂溶液的质量体积比为1.5g∶42.6ml。其它步骤及参数与具体实施方式一至七之一相同。
具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一至八之一不同的是，步骤六中将氧化粘胶纤维纱布放入碱溶液中，反应温度为120℃，反应时间12h，然后使用体积分数为80％的乙醇水溶液冲洗3次，再用无水乙醇冲洗4次，然后在-50℃下冷冻干燥24h，得到碱化粘胶纱布，即产品D。其它步骤及参数与具体实施方式一至八之一相同。
具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式一至九之一不同的是，步骤六中氧化粘胶纤维纱布与碱溶液的质量体积比为35g∶100ml。其它步骤及参数与具体实施方式一至九之一相同。
具体实施方式十一：本实施方式与具体实施方式一至十之一不同的是，步骤六中按照质量比6∶20将产品A和产品C混合，获得复合产品E。其它步骤及参数与具体实施方式一至十之一相同。
具体实施方式十二：本实施方式与具体实施方式一至十一之一不同的是，步骤六中按照质量比5∶20将产品B和产品C混合，获得复合产品F。其它步骤及参数与具体实施方式一至十一之一相同。
具体实施方式十三：本实施方式与具体实施方式一至十二之一不同的是，步骤六中按照质量比7∶20将产品A和产品D混合，获得复合产品G。其它步骤及参数与具体实施方式一至十二之一相同。
具体实施方式十四：本实施方式与具体实施方式一至十三之一不同的是，步骤六中按照质量比4∶20将产品B和产品D混合，获得复合产品H。其它步骤及参数与具体实施方式一至十是之一相同。
采用以下实施例验证本发明的有益效果：
实施例：
可降解的复合型氧化微晶纤维素止血材料的制备方法，具体是按照以下步骤进行的：
一、采用食品级标准的微晶纤维素，经过三重蒸馏水洗涤，50℃下烘干，得到活化的微晶纤维素；
二、采用二氧化氮/环己烷体系作为氧化剂溶液，对步骤一中所得活化的微晶纤维素进行氧化，然后经环己烷粗洗、抽滤、体积分数为60％的乙醇水溶液抽滤冲洗和无水乙醇精洗，再在-45℃下真空冷冻干燥24h，于0℃密封储存，得到氧化微晶纤维素，即产品A；其中，所述氧化剂溶液中二氧化氮的质量分数为25％；活化的微晶纤维素与氧化剂溶液的质量体积比为5g∶42.6ml，反应温度为19℃，反应时间为58h；
三、将步骤三中所得氧化微晶纤维素放入碱溶液中，反应温度为20℃，持续浸泡3h，然后使用体积分数为80％的乙醇水溶液抽滤冲洗3次，再用无水乙醇抽滤冲洗5次，然后在-50℃下冷冻干燥48h，得到氧化微晶纤维素钠，即产品B；其中，所述碱溶液为浓度0.4mol/L的氢氧化钠溶液；氧化微晶纤维素与碱溶液的质量体积比为40～75g∶100ml；
四、以木浆粘胶长纤为原料，采用针织机制备粘胶纤维纱布；其中，所述针织机幅宽为10m，牵引带间距为5.2m，牵引带宽度为5.2m，牵引速度为240r/m，网眼宽度为1.5mm，纱布平均厚度为1.5mm；
五、采用二氧化氮/环己烷体系作为氧化剂溶液，对步骤四中所得粘胶纤维纱布进行氧化，然后经环己烷粗洗、抽滤、体积分数为60％的乙醇水溶液抽滤冲洗和无水乙醇精洗，再在-45℃下真空冷冻干燥68h，于0℃密封储存，得到氧化粘胶纤维纱布，即产品C；其中，所述氧化剂溶液中二氧化氮的质量分数为20％；粘胶纤维纱布与氧化剂溶液的质量体积比为2g∶42.6ml，反应温度为19.5℃，反应时间为68h；
六、将步骤五中所得氧化粘胶纤维纱布放入碱溶液中，反应温度为25℃，反应时间12h，然后使用体积分数为80％的乙醇水溶液冲洗3次，再用无水乙醇冲洗4次，然后在-40℃下冷冻干燥24h，得到碱化粘胶纱布，即产品D；其中，所述碱溶液为浓度0.5mol/L的氢氧化钠溶液；氧化粘胶纤维纱布与碱溶液的质量体积比为35g∶100ml；
七、按照质量比8∶20将产品A和产品C混合，获得复合产品E；按照质量比5∶20将产品B和产品C混合，获得复合产品F；按照质量比8∶20将产品A和产品D混合，获得复合产品G；按照质量比5∶20将产品B和产品D混合，获得复合产品H；即完成可降解的复合型氧化微晶纤维素止血材料的制备。
本实施例制备所得复合产品E，F，G和H，即可降解的复合型氧化微晶纤维素止血材料，其检测试验如下：
止血试验
止血时间分为兔耳动脉止血模型和兔肝部止血模型两类，两类模型实验前的动物准备过程均如下所述：选取厚度约为1.5mm的复合产品E，F，G和H为测试材料，将测试材料剪成2.0cm×2.0cm大小若干块，称重、灭菌、备用。选取体重3.0-3.5kg的新西兰兔分为若干组(依据测试材料种类数量而定)，每组5只。
兔耳动脉止血模型
按40mg/kg剂量静脉缓慢注射戊巴比妥钠溶液麻醉动物后，将其中央耳动脉区域备皮、消毒，沿耳动脉方向切开皮肤，钝性分离出耳动脉、静脉和神经，再用手术刀横向切断动脉，待血液涌出后立即用相同质量的测试材料或对照样贴敷于伤口表面并使用推拉力计施加3N的压力，每隔10s观察止血情况，直至最终完全止血后记录止血时间，并取下材料称重。通过公式计算出血量，取10组平均值为最终结果。
mBL＝m1-m0
式中mBL——出血量；
m1——止血后材料质量；
m0——贴敷前材料质量。
兔肝部止血模型
动物麻醉后将其腹部朝上固定，腹部备皮尺寸约5cm×4cm，常规消毒后，于剑突下沿腹中线纵向切开皮肤，钝性分离皮下组织，暴露腹膜，纵向切开腹膜，切口长约5cm，用医用消毒纱布吸干切口部位的血液和组织液。充分暴露肝前叶，在其表面用手术刀作1.0cm×1.0cm的创口，深度约3mm，并将创面肝被膜及其下的肝组织取下。血液涌出后，立即将1层测试材料或对照样贴敷于创口表面并使用推拉力计施加3N的压力，每隔10s观察止血情况，直至最终完全止血后记录止血时间，并取下材料称重，通过计算出血量，取10组平均值为最终结果。
通过表1给出的本实施制备所得复合产品E，F，G，H，强生ORC产品(速即纱纱布)、普通纱布止血试验数据中可以看出，普通纱布在两种止血试验模型中均未能在10min之内实现伤口止血。相对来说，ORC的止血时间有所缩短，而复合产品的止血速度均大大缩短，尤其是复合产品H的静脉出血止血效果非常优异。同时，由数据还可看出，材料的止血时间越短，模型出血量越少。
表1 多种产品在不同止血模型中的平均止血时间和出血量
凝血酶时间(TT)，凝血酶原时间(PT)，激活的部分凝血活酶时间(APTT)的测定
血液和血浆的制备
血液：健康家兔，哈尔滨医科大学提供，体重2.5－3.0kg，雄性，在清醒不给药的情况下，心脏取血，血液按1∶9比例用3.8％拘掾酸钠抗凝。
血浆：以上抗凝血液在2000转/分，离心10min，收集血浆冷冻保存备用。
样品浸提液的配制：称取样品(即本实施例制备所得复合产品E，F，G和H)2g剪碎放入烧杯中，加入100ml生理盐水，混匀后用保鲜膜封口，置于37℃孵箱中48h。
原理：TT主要受血浆中纤维蛋白原水平、凝血活性和纤维蛋白的交链影响，TT的长短反映了凝血因子共同途径的水平，可从分子水平阐明材料和血液的相互作用。PT，是描述外源性凝血系统的指标。PT的长短反映了血浆中凝血酶原、纤维蛋白原和因子Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ的水平。APTT是磷脂血浆复钙时间，APTT的长短反映了血浆中内源性凝血系统凝血因子共同途径中凝血酶原、纤维蛋白原和因子Ⅴ、Ⅹ的水平。
方法：取血浆1.8ml，加入0.2ml的0.2-2％复合产品H(该材料止血效果最佳)浸提液溶液，对照用1.8ml血浆加0.2ml蒸馏水用混合器混匀后，在自动凝血仪上测定。
凝血过程分为内源性凝血途径和外源性凝血途径。内源性凝血途径是指参与凝血的因子全部来自血液，通常是因血液与带负电荷的异物表面接触启动，外源性凝血途径是指始动凝血的组织因子是来自于组织。内、外源性凝血系统的不同之处在于激活凝血因子的途径不同，外源性凝血系统是从因子Ⅲ、Ⅶ的激活开始的，内源性凝血系统是从因子Ⅻ激活开始的。
表2 为不同浓度的复合产品H对APTT及TT的影响
| 浓度(％) | APTT(秒) | TT(秒) | PT(秒) |
| 2.0 | 22.2±2.3* | 9.5±0.9* | 12.2±0.2 |
| 1.0 | 30.1±1.9* | 11.7±1.2* | 12.3±0.2 |
| 0.5 | 33.8±2.2* | 13.6±1.3* | 12.2±0.3 |
| 0.2 | 39.7±2.4* | 15.3±1.7 | 12.3±0.1 |
| 空白对照 | 43.3±4.2 | ― | 12.5±0.2 |
N＝6，X±S*P＜0.05
可见，材料样品浓度需要达到一定水平才具有止血作用，即有一定的浓度依赖性。随着浓度的增加，APTT及TT均有下降，对PT无明显影响，表明ORC有激活凝血因子Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ、Ⅻ的作用，从而启动内源性凝血系统，而对因子Ⅲ、Ⅶ的激活即对外源性凝血系统没有影响。
孔隙率测定
选用一个容积为10ml的塑料瓶，倒满乙醇称重W1，把重为WS的样品进入乙醇中，超声脱气，务必使乙醇充盈于材料的孔中，然后加满乙醇，称重为W2，把浸满了乙醇的样品取出后，称剩余的乙醇与比重瓶重W3，计算孔隙率θ，每组测三个样，最后求平均值；表2是孔隙率测定，其中，θ1表示第一次测得孔隙率的值，θ2表示第二次测得孔隙率的值，θ3表示第三次测得孔隙率的值，
表3 为不同材料的孔隙率
| 孔隙率θ1 | 孔隙率θ2 | 孔隙率θ3 | |
| 普通纱布 | 70.30％ | 76.87％ | 77.75％ |
| 速即纱纱布 | 69.21％ | 61.56％ | 70.95％ |
| 复合产品E | 89.02％ | 90.11％ | 88.56％ |
| 复合产品F | 92.77％ | 93.01％ | 91.92％ |
| 复合产品G | 88.22％ | 89.71％ | 91.44％ |
| 复合产品H | 92.89％ | 93.38％ | 94.55％ |
由表3可知，
本实施例制备所得复合产品E，F，G和H的孔隙率达到了90％，接近海绵的孔隙率，相比普通纱布和速即纱，本实施例制备所得复合产品E，F，G和H具有更高的孔隙率，即更大的比表面积，这使得其可以具有更好的吸附性能，与血液作用时将具有更大的接触面。
材料表面电位测量
通过Zeta电位测量仪，可以获得负载在纱布表面微米粒子的电位数据，从生理性止血角度来看，带有负电荷的材料会起到凝血作用，电位绝对值越大，与血细胞之间的相互作用力就越大，凝血时间就越短。从电位测量结果来看，复合产品的电位绝对值相比速即纱产品要大很多，理论上将，复合产品止血性能应该较好，而这与之前的止血实验结果相吻合。
表4 为不同材料表面zeta电位数值(单位mV)
| 第一次测量 | 第二次测量 | 第三次测量 | |
| 速即纱纱布 | -11.0 | -12.9 | -14.0 |
| 复合产品E | -29.4 | -33.7 | -31.9 |
| 复合产品F | -29.1 | -24.3 | -27.7 |
| 复合产品G | -25.4 | -26.5 | -23.7 |
| 复合产品H | -27.2 | -29.9 | -31.4 |
从结果可以看出，复合产品整体止血效果比速即纱、普通纱布均要好，具有较好的止血效果，尤其在肝脏、脾脏止血中甚佳，对血小板的吸附性能好，对创面渗血更有效。尤其是复合产品H能明显缩短家兔的出、凝血时间，亦能缩短临床手术术中止血时间，从而缩短手术时间。
植入及体内降解试验
将测试材料(本实施例制备所得复合产品E，F，G和H)裁剪成直径约为10mm的圆片，灭菌、备用。选取体重260-273g的SD大鼠若干只，平均分为若干组(依据待测材料种类数确定)，每组3只。于大鼠腹腔处缓慢注射戊巴比妥钠溶液麻醉，而后分别将测试材料(Test article)和阳性对照样(商品速即纱，Negative control)植入到大鼠背部皮下，每只动物背部均选取6个植入点，间隔2-3cm，如图1所示。
随即注射20000U/kg庆大霉素。每种植入材料均选取28d为植入期，每种材料每个植入期使用3只大鼠，所有实验动物集中饲养直至植入期结束。待每个植入期结束时，相应的实验动物注射过量的戊巴比妥钠溶液进行人道处死，取出材料植入部位及其周围的组织，放入20％福尔马林溶液中固定。待乙醇梯度脱水处理后，进行石蜡包埋、切片、HE染色，最后进行组织病理学观察。
生物可降解(可吸收)性能测试结果
首先，选用4周为植入期，并且在手术后先对实验动物及植入部位进行初步肉眼观察；然后，分别对止血材料植入部位的组织进行HE染色。最后，通过显微镜进行组织切片病理观察。手术过程结束后，所有的实验动物均恢复正常状态。
由图2和图3所示，在产品E的植入区域，大部分切片上仍可见呈粉红色条索状、块状的未完全降解的样品，其周围可见厚约几十至近百微米的包囊，其中部分区域可见组织细胞，且有成纤维细胞等细胞长入。大部分切片上包囊壁厚约几十至上百微米，个别切片上囊壁厚度可达几百微米。囊壁主要由细胞构成，其中可见大量的嗜中性粒细胞、淋巴细胞、粒细胞以及少量巨噬细胞，局部区域可见较多新生毛细血管；
产品F在植入4周之后的组织学病理照片如图4和图5所示，所有组织切片上均未观察到植入样品及包囊，个别切片上可见中性粒细胞，巨噬细胞。
当产品G和产品H两种材料植入体内4周之后，肉眼没有观察到任何水肿等任何异常炎症，并且手术伤口已完全愈合，观察不到术后痕迹，详细的组织学病理观察结果如图6、7、8和9所示。在全部的组织学病理照片上均未观察到残余的植入样品，并且切片上均未观察到任何明显组织反应。
细胞毒性试验
将含有10％牛血清的培养液加入到直径为100mm的培养皿中，再量取浓度为3.0×105个/ml小鼠成纤细胞(L929细胞)悬液10ml加入到上述培养皿中，然后将培养皿放入到37℃、5％CO2的培养箱中培养24h，制备出连续生长的单细胞层。混合1份双倍浓度的培养液(MEM)和1份3％的琼脂(Agar)制备成MEN-Agar培养基，量取10ml此培养基加入到上述培养皿中，使琼脂在单细胞层上固化形成覆盖层，并采用中性红染色。取高密度聚乙烯为阴性对照样，含有机锡添加剂的聚氯乙烯为阳性对照样，将对照样以及两片测试材料裁剪成直径为10mm的圆片，同时放置到同一培养皿的琼脂层上，圆片的边缘距离培养皿边缘大约15mm。然后将培养皿置于37℃、5％CO2的培养箱中培养24h。最后观察对照样、测试样周围、下方的褪色和细胞溶解情况，细胞毒性评价等级见表5。
表5 细胞毒性等级及现象
| 等级 | 现象 | 结论 |
| 0 | 未观察到任何反应区域 | 无细胞毒性 |
| 1 | 观察到一些畸形或者变性的细胞 | 轻微细胞毒性 |
| 2 | 反应区域仅限于样品下方 | 轻度细胞毒性 |
| 3 | 反应区域超出试样边缘1.0cm以内 | 中度细胞毒性 |
| 4 | 反应区域超过试样边缘1.0cm以外 | 重度细胞毒性 |
表6 各种样品的细胞毒性等级
| 样品 | 阴性对照样 | 阳性对照样 | 产品E | 产品F | 产品G | 产品H |
| 细胞毒性等级 | 0 | 4 | 3 | 2 | 3 | 1 |
本实验条件下，依据ISO 10993-5∶2009标准，产品E和产品G具有中度细胞毒性，而产品F稍好，具有轻度细胞毒性，产品H具有轻微细胞毒性。事实上对于某些材料而言，具有细胞毒性是无法投入到实际应用的。但是，对于氧化再生纤维素和氧化再生纤维素羧酸钠两类医用材料而言，这种细胞毒性是不可避免的，但却是可以接受的。这是因为，两种止血材料结构中都含有一定量的-COOH，它在起到止血作用的同时，其酸性还会造成一定程度的副作用，即导致细胞破裂、凋亡等毒性反应。
Claims (10)
1.可降解的复合型氧化微晶纤维素止血材料的制备方法，其特征在于它按照以下步骤进行的：
一、采用食品级标准的微晶纤维素，经过三重蒸馏水洗涤，40～55℃下烘干，得到活化的微晶纤维素；
二、采用二氧化氮/环己烷体系作为氧化剂溶液，对步骤一中所得活化的微晶纤维素进行氧化，然后经环己烷粗洗、抽滤、体积分数为50％～70％的乙醇水溶液抽滤冲洗和无水乙醇精洗，再在-20～-55℃下真空冷冻干燥16～32h，于0～4℃密封储存，得到氧化微晶纤维素，即产品A；其中，所述氧化剂溶液中二氧化氮的质量分数为20％～30％；活化的微晶纤维素与氧化剂溶液的质量体积比为1.5～10g∶42.6ml，反应温度为18～19.5℃，反应时间为40～88h；
三、将步骤三中所得氧化微晶纤维素放入碱溶液中，反应温度为10～30℃，持续浸泡1.5～4h，然后使用体积分数为80％的乙醇水溶液抽滤冲洗2～3次，再用无水乙醇抽滤冲洗3～5次，然后在-30～-60℃下冷冻干燥24～60h，得到氧化微晶纤维素钠或氧化微晶纤维素钾，即产品B；其中，所述碱溶液为浓度0.3～0.5mol/L的氢氧化钠溶液或者氢氧化钾溶液；氧化微晶纤维素与碱溶液的质量体积比为40～75g∶100ml；
四、以木浆粘胶长纤为原料，采用针织机制备粘胶纤维纱布；其中，所述针织机幅宽为8～18m，牵引带间距为4.2～6.2m，牵引带宽度为4.2～6.2m，牵引速度为180～360r/m，网眼宽度为0.5～2.5mm，纱布平均厚度为1.0～2.5mm；
五、采用二氧化氮/环己烷体系作为氧化剂溶液，对步骤四中所得粘胶纤维纱布进行氧化，然后经环己烷粗洗、抽滤、体积分数为50％～70％的乙醇水溶液抽滤冲洗和无水乙醇精洗，再在-20～-55℃下真空冷冻干燥40～88h，于0～4℃密封储存，得到氧化粘胶纤维纱布，即产品C；其中，所述氧化剂溶液中二氧化氮的质量分数为17％～23％；粘胶纤维纱布与氧化剂溶液的质量体积比为0.5～2.5g∶42.6ml，反应温度为18～19.5℃，反应时间为40～88h；
六、将步骤五中所得氧化粘胶纤维纱布放入碱溶液中，反应温度为10～30℃，反应时间0.5～48h，然后使用体积分数为80％的乙醇水溶液冲洗2～3次，再用无水乙醇冲洗3～5次，然后在-10～-80℃下冷冻干燥12～48h，得到碱化粘胶纱布，即产品D；其中，所述碱溶液为浓度0.2～1.0mol/L的氢氧化钠溶液或者氢氧化钾溶液；氧化粘胶纤维纱布与碱溶液的质量体积比为20～55g∶100ml；
七、按照质量比1～10∶20将产品A和产品C混合，获得复合产品E；按照质量比1～8∶20将产品B和产品C混合，获得复合产品F；按照质量比1～10∶20将产品A和产品D混合，获得复合产品G；按照质量比1～8∶20将产品B和产品D混合，获得复合产品H；即完成可降解的复合型氧化微晶纤维素止血材料的制备。
2.根据权利要求1所述可降解的复合型氧化微晶纤维素止血材料的制备方法，其特征在于步骤二中活化的微晶纤维素与氧化剂溶液的质量体积比为4g∶42.6ml。
3.根据权利要求1或2所述可降解的复合型氧化微晶纤维素止血材料的制备方法，其特征在于步骤三中将步骤三中所得氧化微晶纤维素放入碱溶液中，反应温度为20℃，持续浸泡2h，然后使用体积分数为80％的乙醇水溶液抽滤冲洗3次，再用无水乙醇抽滤冲洗4次，然后在-40℃下冷冻干燥32h，得到氧化微晶纤维素钠或氧化微晶纤维素钾，即产品B。
4.根据权利要求3所述可降解的复合型氧化微晶纤维素止血材料的制备方法，其特征在于步骤四中所述针织机幅宽为12m，牵引带间距为5.2m，牵引带宽度为5.2m，牵引速度为240r/m，网眼宽度为1.5mm，纱布平均厚度为1.5mm。
5.根据权利要求4所述可降解的复合型氧化微晶纤维素止血材料的制备方法，其特征在于步骤五中粘胶纤维纱布与氧化剂溶液的质量体积比为1.5g∶42.6ml。
6.根据权利要求5所述可降解的复合型氧化微晶纤维素止血材料的制备方法，其特征在于步骤六中将氧化粘胶纤维纱布放入碱溶液中，反应温度为120℃，反应时间12h，然后使用体积分数为80％的乙醇水溶液冲洗3次，再用无水乙醇冲洗4次，然后在-50℃下冷冻干燥24h，得到碱化粘胶纱布，即产品D。
7.根据权利要求6所述可降解的复合型氧化微晶纤维素止血材料的制备方法，其特征在于步骤六中按照质量比6∶20将产品A和产品C混合，获得复合产品E。
8.根据权利要求7所述可降解的复合型氧化微晶纤维素止血材料的制备方法，其特征在于步骤六中按照质量比5∶20将产品B和产品C混合，获得复合产品F。
9.根据权利要求8所述可降解的复合型氧化微晶纤维素止血材料的制备方法，其特征在于步骤六中按照质量比7∶20将产品A和产品D混合，获得复合产品G。
10.根据权利要求9所述可降解的复合型氧化微晶纤维素止血材料的制备方法，其特征在于步骤六中按照质量比4∶20将产品B和产品D混合，获得复合产品H。
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