CN103642785B

CN103642785B - 一种固定化3-苯氧基苯甲酸降解酶及其制备方法

Info

Publication number: CN103642785B
Application number: CN201310596557.1A
Authority: CN
Inventors: 刘书亮; 王志龙; 邓维琴; 文涛; 何利; 陈姝娟
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2013-11-25
Filing date: 2013-11-25
Publication date: 2015-08-12
Anticipated expiration: 2033-11-25
Also published as: CN103642785A

Abstract

本发明公开了一种固定化3-苯氧基苯甲酸降解酶的制备方法，属于固定化酶领域。包括如下步骤：（1）将鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas sp.）SC-1发酵液离心，收集菌体，菌体与Tris-HCl缓冲液混匀后冰水浴超声破碎，离心去除胞内酶，细胞碎片沉淀用Tris-HCl缓冲液加至破碎前体积制成酶液；（2）将此酶液与海藻酸钠溶液按一定比例均匀混合，均匀滴落于氯化钙溶液中进行包埋固定化。本发明制备的固定化3-苯氧基苯甲酸降解酶，在宽温度(4℃-40℃)和宽pH(5.0-9.0)具有较高的酶活，且具有较强的连续反应性能，制备方法简单，生产成本低。

Description

一种固定化3-苯氧基苯甲酸降解酶及其制备方法

技术领域

本发明涉及固定化酶领域，具体为一种鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas sp.）SC-1菌体中的3-苯氧基苯甲酸降解酶在海藻酸钙包埋作用下制备成固定化酶的方法。

背景技术

拟除虫菊酯类农药是第二大类杀虫剂，目前全世界范围内拟除虫菊酯类农药的施用量占杀虫剂总量的20%左右，施用面积占整个杀虫剂施用面积的25%。该类农药对光、热稳定，自然条件下难迅速降解，长期接触有致畸、致癌、致突变的危害。3-苯氧基苯甲酸(3-PBA) 是大多数拟除虫菊酯类农药的分解产物之一，与拟除虫菊酯类农药相比，在环境中的迁移速率更快，并且3-PBA在土壤中的半衰期长达180d左右，远远长于大多数拟除虫菊酯杀虫剂的半衰期（约30d）。由于自20世纪80年代起拟除虫菊酯类农药的广泛大量施用，3-PBA也越来越多的在水体、土壤、农畜产品及人类尿液中检出。近期研究发现3-PBA是一类潜在的环境激素，其既可以显示抗雄激素活性，也可以与雌激素受体结合显示拟雌激素活性。成年男性体内黄体激素的增加及雌二醇的减少与其尿液中的3-PBA水平有关。此外，3-PBA对微生物的生长具有一定的抑制作用，能阻止拟除虫菊酯类农药的彻底降解，从而使得该类农药难以被生物降解为无毒小分子，因此3-PBA对生态环境和人类健康的潜在危害性较拟除虫菊酯类杀虫剂大。

微生物降解效率高、无二次污染，且可有效降低环境中的有毒污染物。与微生物降解相比，酶降解具有反应效率高、降解速度快、安全无毒副作用等优点，因此酶法降解是治理环境农药污染和消除农产品及食品中农药残留的最直接有效途径之一。近年来对3-PBA的微生物降解研究相对较少，且主要为降解菌筛选及特性方面，而对3-PBA降解酶研究更少，一些学者分离到多株可降解3-PBA的菌株，如Ochrobactrum lupini 、 Streptomyces aureus 、 Bacillus sp.、 Stenotrophomonas sp.，研究了降解菌株的降解特性及降解途径等，但未进行3-PBA降解酶研究，也未见对3-PBA降解酶进行固定化酶的研究。

鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)SC-1(Genbank 注册序列号为JN857975)，由四川农业大学食品微生物实验室分离保藏，该菌株高效降解3-PBA(以3-PBA为唯一碳源进行生长，在基础盐培养基中，30℃、16 h可将300 μg/mL 3-PBA完全降解)，是目前报道中降解3-PBA能力最强的菌株。本实验室通过对鞘氨醇单胞菌SC-1产3-苯氧基苯甲酸(3-PBA)降解酶的细胞定位分析，表明该降解酶主要位于细胞膜上，是一种膜蛋白，其分子量约为50Ku～90Ku。

固定化技术在保持游离3-苯氧基苯甲酸降解酶的专一、高效的催化活性的同时，更是提高了3-苯氧基苯甲酸降解酶重复利用性、操控性和稳定性的有效手段。酶的固定化效果与载体性质和酶的固定化方法有着较大的关联性。目前常用的酶固定化方法主要包括吸附法、共价结合法、包埋法和交联法等，各有其自身的优缺点，不同种类和性质的酶，往往采用不同的固定化方法。其中的包埋法，可通过物理作用将酶限定在载体的网格中，从而实现对酶的固定化。该法不改变酶的构象和分子化学变化，反应条件温和，因而回收率较高，对于新发现的酶采用此法固定化具有明显的优势。

发明内容

本发明目的是针对上述问题，提供一种用于环境及农产品中3-苯氧基苯甲酸降解的固定化酶制备方法，该方法制备固定化3-苯氧基苯甲酸降解酶产品的生产工艺简单，材料易得，成本低，酶稳定性较好，使用寿命较长，可重复使用。

为实现上述目的，本发明3-苯氧基苯甲酸降解酶的固定化方法，包括如下步骤：

1）将鞘氨醇单胞菌SC-1发酵液离心（4℃,10000r/min,10min），收集菌体，菌体与0.02mol/L pH值为7的Tris-HCl缓冲液按1:2~1:16（m/v）比例（优选为1:8），混匀；冰水浴条件下超声(40 kHz，45W~450W，工作1s，间歇3s)破碎1200s，离心（4℃,11000r/min,15min）除去胞内酶液，得沉淀A，用Tris-HCl缓冲液重复2次清洗沉淀A，离心（4℃,11000r/min,15min）去除上清，得沉淀B(即细胞碎片)，用0.02mol/LTris-HCl缓冲液重悬沉淀B，恢复至破碎前体积制成3-苯氧基苯甲酸降解酶酶液；

2）将1）中酶液按1:3~1:7（v/m）比例（优选为1:6），混匀于0.5%~3%海藻酸钠溶液（优选为2%）中；用8~16号（优选为12号）医用针头将混匀后的溶液滴入0.5%~12%的CaCl₂溶液（优选为1%）中，4℃低温固定化0.5h~24h（优选为1h），经0.02mol/LTris-HCl缓冲液3次清洗除去表面残留酶液后，制成3-苯氧基苯甲酸降解酶固定化酶凝珠。

本发明具有如下显著优点：

1）本固定化酶选用的是鞘氨醇单胞菌SC-1的3-苯氧基苯甲酸降解酶粗酶液，不需分离提纯，制备过程较简单；

2）本固定化酶载体—海藻酸钠来源广，价格便宜，所需添加辅料少，制备过程较简单，且不需大型设备，易于工业化生产制备；

3）本固定化酶在固定化过程中未使用有毒有害的试剂材料，安全性好；

4）本固定化酶对3-苯氧基苯甲酸具有降解率高，稳定性好，可连续多次反应，极大提高了酶的使用效率。

附图说明

图1为本方法制备的固定化3-苯氧基苯甲酸降解酶。

图2为本方法制备的固定化3-苯氧基苯甲酸降解酶的最适反应温度和热稳定曲线。

图3为本方法制备的固定化3-苯氧基苯甲酸降解酶的最适反应pH和pH稳定曲线。

图4为金属离子对本方法制备的固定化3-苯氧基苯甲酸降解酶的酶活的影响图。

图5为本方法制备的固定化3-苯氧基苯甲酸降解酶的酶活抑制剂及促进剂的影响图。

图6为本方法制备的固定化3-苯氧基苯甲酸降解酶的米氏常数双倒数图。

图7为本方法制备的固定化3-苯氧基苯甲酸降解酶的连续反应图。

具体实施方式

实施例1：固定化3-苯氧基苯甲酸降解酶凝珠的制备及酶活检验方法。

从平板上挑取SC-1单菌落，划线于LB斜面培养基上，30℃恒温培养24h。用无菌生理盐水将SC-1菌苔从斜面培养基上洗脱并混匀制成菌悬液，接种1.0mLSC-1菌悬液(菌浓度约为10⁸cfu/mL)于30mL液体发酵培养基中，30℃、180r/min恒温振荡培养24h得种子液。将种子液按3%（v/v）接种至10L发酵罐（发酵培养基：硫酸铵1.5g；硫酸镁0.5g；氯化钠0.5g；磷酸二氢钾0.5g；磷酸氢二钾1.5g；葡萄糖5.0g；酵母浸出粉5.0g；水1000mL；调节pH值至7.0；加入3-PBA至100µg/mL，121℃灭菌15min。），发酵罐装料系数0.65，接种量6.25%，起始pH7.0，发酵温度30℃，转速控制在300r/min，发酵罐压维持在0.04MPa-0.05MPa，产泡较多时加少量无菌消泡油进行消泡。发酵培养24h，得到SC-1发酵液。发酵结束后将SC-1发酵液冷冻离心(4℃,10000r/min,10min)，收集菌体沉淀，菌体沉淀用0.02mol/LPBS缓冲液悬浮清洗两次后于-20℃低温保存备用。

称取1.0 g SC-1湿菌体悬浮于8mL 0.02mol/LTris-HCl缓冲液中，冰水浴条件下超声波破碎（功率180w，开1s，停3s，破碎1200s），得破碎混合液，将破碎混合液于4℃下11000r/min离心15min，弃去上清胞内酶液，得沉淀A，用0.02mol/LTris-HCl缓冲液重复2次清洗沉淀A，离心（4℃,11000r/min,15min）去除上清，得沉淀B（即细胞碎片），用0.02mol/L Tris-HCl缓冲液重悬沉淀B，恢复至破碎前体积制成3-苯氧基苯甲酸降解酶液。

将该酶液按1:6（v/v）混匀于2%海藻酸钠凝胶中，用12号针头将其滴入1% 的CaCl₂溶液中，于4℃冰箱中静置固定1h，用0.02mol/L Tris-HCl缓冲液清洗过滤两次。用滤纸吸干表面水分，得固定化3-苯氧基苯甲酸降解酶凝珠。形态如图1，此法所得固定化酶凝珠形态均匀稳定，包埋效果好，酶活稳定，对3-苯氧基苯甲酸降解效果好。

向0.5mL 20 µg/mL3-苯氧基苯甲酸的0.02mol/L PBS缓冲溶液中加入制备的固定化3-苯氧基苯甲酸降解酶凝珠0.5 g进行振荡反应30min，以加入固定化3-苯氧基苯甲酸降解酶凝珠后立即用乙腈终止反应为空白对照，平行重复三次，结果取其平均值。采用乙腈终止反应后，超声提取3-苯氧基苯甲酸 30min，乙腈定容至10mL混匀后12000 r/min离心10min，取上清液过有机相滤膜后，弃去初滤液，取续滤液用HPLC检测3-苯氧基苯甲酸残留量。

HPLC检测条件：色谱柱:Gemini 100ÅC18柱(5.0μm,150mm×4.60mm，i.d.)，流动相为乙腈-磷酸水(55:45，v/v)，磷酸水pH=2.5，流速为0.7mL/min，进样量为10μL，检测波长为210nm，柱温25℃。

3-苯氧基苯甲酸降解酶的酶活力定义：在本实验条件下，1.0min内使3-PBA减少1.0nmol所需要的酶量为1个酶活力单位(U)。

实施例2：固定化酶降解3-苯氧基苯甲酸的最适反应温度及热稳定性的确定。

称取0.5 g固定化酶凝珠，加入0.5mL含20 µg/mL 3-苯氧基苯甲酸的底物缓冲液，缓冲液为pH 7.0的0.02mol/LTris-HCl缓冲液，混匀。将其分别置于4℃、15℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、60℃、70℃条件下摇振反应30min。用乙腈终止反应，检测3-苯氧基苯甲酸的残留量，由相对酶活确定固定化酶凝珠的最适反应温度。将固定化酶凝珠分别在不同温度条件下水浴保温1h后，加入底物缓冲液于最适反应温度摇振反应30 min，测定残余酶活力，考察固定化酶凝珠的热稳定性。

结果如图2所示固定化3-苯氧基苯甲酸降解酶的最适反应温度和热稳定曲线，图2表明，固定化3-苯氧基苯甲酸降解酶的最适反应温度为30℃，到45℃时酶活不足30%；而其热稳定性结果显示固定化3-苯氧基苯甲酸降解酶在4℃时酶活稳定性最高，随着温度的升高，酶活稳定性逐渐降低，45℃时酶活不足10%。

实施例3：固定化酶降解3-苯氧基苯甲酸的最适反应pH值及pH稳定性的确定。

称取0.5 g固定化酶凝珠，分别加入0.5mL不同pH（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0）的含20 µg/mL 3-苯氧基苯甲酸的底物缓冲液中，于30℃条件下反应30 min，检测3-苯氧基苯甲酸的残留量，由相对酶活确定固定化酶凝珠的最适反应pH。将固定化酶凝珠分别加入不同pH的缓冲溶液中，于4℃冰箱中静置1h。过滤去除缓冲液，用生理盐水清洗过滤，重复一次，吸干固定化酶表面水分，于最适pH，30℃条件下测定残余酶活力，考察固定化酶凝珠的pH稳定性。

结果如图3所示固定化3-苯氧基苯甲酸降解酶的最适反应pH和pH稳定曲线，图3表明，在pH为7.0 时，固定化酶的活性及稳定性均达到最大值。在pH5.5~8.5之间固定化酶仍能保持60%以上的酶活。

实施例4：不同金属离子对固定化酶降解3-苯氧基苯甲酸的影响。

配制含金属离子的底物缓冲液：以底物缓冲液为溶剂分别配制浓度为0.1 mmol/L、1 mmol/L、10 mmol/L的ZnCl₂、MnCl₂、MgCl₂、CuSO₄、BaCl₂、FeCl₃、Pb(Ac)₂溶液。称取0.5g固定化酶凝珠，加入0.5mL含不同金属离子的20 µg/mL 3-苯氧基苯甲酸的底物缓冲液反应，以不含金属离子的体系为对照。在30℃条件下摇振反应30min，测定3-苯氧基苯甲酸残留量，进而判定该金属离子对固定化酶酶活的影响。

结果如图4所示金属离子对固定化3-苯氧基苯甲酸降解酶酶活的影响图，图4结果表明，Mg²⁺、Mn²⁺ 及较高浓度 Ba²⁺、低浓度Cu²⁺对固定化酶的降解作用具有一定程度的促进效果；而Pb²⁺、Zn²⁺及高浓度Cu²⁺、Fe³⁺对固定化酶降解作用有较强的抑制效果。

实施例5：固定化酶降解3-苯氧基苯甲酸的抑制剂及促进剂探究。

配制含不同浓度促进剂及抑制剂的底物缓冲液，取0.5g固定化酶凝珠与0.5mL含20 µg/mL 3-苯氧基苯甲酸的底物缓冲液反应，以未加促进剂或抑制剂的体系为对照。在30℃条件下摇振反应30min，测定3-苯氧基苯甲酸残留量，进而判定不同促进剂及抑制剂对固定化酶酶活的影响。

结果如图5所示固定化3-苯氧基苯甲酸降解酶的酶活抑制剂及促进剂的影响图，图5表明，EDTA能提高此固定化酶活性，能促进其对3-苯氧基苯甲酸的降解作用，浓度为10^-4 mol/L促进效果最明显；PMSF对固定化酶有明显抑制效果，在一定浓度范围内抑制作用随浓度增大而增大。其它试剂均对酶的抑制和促进作用因浓度不同而异，0.01% BSA、10^-6 mol/L邻菲罗啉、0.1% Vc对酶的促进作用较好。0.1% SDS、10^-2 mol/L的邻菲罗啉对酶具较强抑制作用。

实施例6：固定化酶降解3-苯氧基苯甲酸的米氏常数及最大反应速度的确定。

以pH 7.0的0.02mol/L Tris-HCl缓冲液为溶剂配制浓度分别为：10µg/mL、20µg/mL、40µg/mL、60µg/mL、80µg/mL、100µg/mL的底物(3-苯氧基苯甲酸)缓冲液。分别取不同浓度的底物(3-苯氧基苯甲酸)缓冲液0.5mL，加入0.5g固定化酶凝珠。于30℃条件下恒温水浴摇振反应30min，测定3-苯氧基苯甲酸的残留量，做酶促动力学双倒数图，确定米氏常数和最大反应速度。

结果如图6所示米氏常数双倒数图，图6表明，固定化酶降解3-苯氧基苯甲酸降反应速率倒数（1/[V]）与底物浓度倒数（1/[S]）的线性方程为:1/[V] = 12591/[S] +2.7×10⁵，R² = 0.9851。解此方程，得到固定化酶对底物的米氏常数（Km）为46.63×10⁶ nmol/L，最大反应速率（Vmax）为3.70×10³U/g。

实施例7：固定化酶降解3-苯氧基苯甲酸的连续反应能力的评价。

称取20g固定化酶凝珠，加入5µg/mL3-苯氧基苯甲酸的底物缓冲液200mL ，在磁力搅拌器上搅拌使固定化酶凝珠在悬浮状态下反应，控制反应体系温度为30℃。用恒流泵以0.7mL/min的流速匀速滴加5µg/mL的3-苯氧基苯甲酸的底物缓冲液，同时以相同的流速流出反应液维持反应体系体积，用部分收集器对流出液进行收集，收集时间为10min/管。对部分收集器连续收集的反应液中的3-苯氧基苯甲酸残留量进行检测，以连续反应时间所对应的收集管号为横坐标，3-苯氧基苯甲酸残留量为纵坐标作图，对固定化酶连续反应能力进行评价。

结果如图7所示的固定化3-苯氧基苯甲酸降解酶的连续反应图，图7表明，第15管、第20管、第25管、第30管的3-PBA残留量达到最低值（降解率达到75.23%），随着时间的不断延长，残留量不断增大，酶活逐渐损失。第90管（连续反应900 min）后，酶活趋于稳定，此时反应体系中的固定化酶对0.7 mL/min，5 µg/mL流加的3-PBA降解率仍达到26.14%。流出液中剩余3-苯氧基苯甲酸可继续通过循环加入到固定化酶反应系统中或下一级固定化3-苯氧基苯甲酸降解酶反应系统中得到降解。表明该固定化酶重复利用性好。

以上的实例仅仅是对本发明的实施方式进行描述，而并非对本发明的范围进行限定，对于本领域的技术人员来说，可以对上述说明进行改进或变形，但所有的这些改进或变形均应落入本发明的权利要求确定的保护范围。

Claims

1.一种固定化3-苯氧基苯甲酸降解酶的制备方法，具体制备步骤如下：

(1)鞘氨醇单胞菌SC-1发酵液离心，收集菌体，菌体混匀于缓冲液后破碎，离心除去胞内酶液，得沉淀A；用缓冲液重复2次清洗沉淀A，离心除去上清，得细胞碎片为沉淀B，再用缓冲液重悬沉淀B，制成3-苯氧基苯甲酸降解酶液；

(2)将此酶液按一定比例混匀于海藻酸钠溶液中，用注射器针头将其滴入CaCl₂溶液中，4℃低温下固定化成海藻酸钙凝珠，经缓冲液清洗3次除去表面残留酶液后，制成固定化3-苯氧基苯甲酸降解酶凝珠；其中所述的缓冲液为0.02mol/L，pH值为7.0的Tris-HCl缓冲溶液；其中所述菌体混匀于缓冲液的步骤，菌体质量与缓冲液体积比例为1:2~1:16（m/v）；所述破碎的条件为冰水浴中破碎，超声破碎功率为40kHz、45w~450w，工作1s、间歇3s，超声时间1200s；所述海藻酸钠溶液浓度为0.5%~3%（m/v）；所述酶液与海藻酸钠溶液混匀的比例为1:3~1:7（v/v）；所述注射器针头大小为8号~16号针头；所述CaCl₂溶液浓度为0.25%~12%（m/v）；所述4℃低温下固定化的时间为0.5h~24h。

2.按权利要求1所述的方法制备得到的固定化3-苯氧基苯甲酸降解酶。