CN103627797B - 一种提高水中人源隐孢子虫特异性的方法以及评价水中人源隐孢子虫活性的方法 - Google Patents

一种提高水中人源隐孢子虫特异性的方法以及评价水中人源隐孢子虫活性的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN103627797B
CN103627797B CN201310542387.9A CN201310542387A CN103627797B CN 103627797 B CN103627797 B CN 103627797B CN 201310542387 A CN201310542387 A CN 201310542387A CN 103627797 B CN103627797 B CN 103627797B
Authority
CN
China
Prior art keywords
cryptosporidium
water
people source
sample
pma
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN201310542387.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN103627797A (zh
Inventor
李绍峰
冉治霖
胡健龙
曾辉
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shenzhen Polytechnic
Original Assignee
Shenzhen Polytechnic
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shenzhen Polytechnic filed Critical Shenzhen Polytechnic
Priority to CN201310542387.9A priority Critical patent/CN103627797B/zh
Publication of CN103627797A publication Critical patent/CN103627797A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103627797B publication Critical patent/CN103627797B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种提高水中人源隐孢子虫特异性的方法以及评价水中人源隐孢子虫（Cryptosporidium？hominis）活性的方法，该方法利用荧光定量PCR（quantitative？PCR，qPCR）技术并结合叠氮类染色剂叠氮溴化丙锭（propidium？monoazide，PMA）评价水中人源隐孢子虫的活性，对添加PMA染料的样品进行强光照射，构建目的基因以及引物，并进行qPCR反应，检测具有活性的人源隐孢子虫。该方法提高了检测的灵敏度和特异性，简化了操作步骤，缩短了检测时间，降低了检测成本。

Description

一种提高水中人源隐孢子虫特异性的方法以及评价水中人源隐孢子虫活性的方法
技术领域
本发明涉及提高人源隐孢子虫(Cryptosporidiumhominis)特异性的方法以及评价水中人源隐孢子虫活性的方法。
背景技术
人源隐孢子虫(Cryptosporidiumhominis)是人类卫生学上重要的一类致病性原生动物，其可以寄生于人肠道上皮组织细胞，能引起胃肠炎、腹泻等症状，特别是免疫功能缺陷者如婴儿，老人以及艾滋病患者等，被感染后会引起腹泻,甚至危及生命。人源隐孢子虫对饮用水的污染已对公民的健康构成了严重的威胁，且隐孢子虫卵囊已成为备受关注的介水传播生物危险因素之一。在我国新颁布的《生活饮用水卫生标准》中，已经将隐孢子虫和贾第虫作为非常规指标且规定了其限值，但根据目前我国的饮用水处理工艺及水源水质和供水水质现状来看，存在隐孢子虫疾病爆发的潜在风险，为保障饮用水安全，研发出一种高效、低廉的水中隐孢子虫活性评价方法具有重要和迫切的现实意义。
目前常用的水中隐孢子虫活性评价方法有体外细胞感染、荧光活体染色、动物感染、RT-PCR和体外诱导脱囊等，其中尤以荧光活体染色(DAPI/PI)较为常用。DAPI/PI检测法已广泛应用于水体中隐孢子虫的选择性检测，但DAPI和PI毒性极强，且不能够特异性地检测隐孢子虫或贾第虫，需要与特异性免疫蛋白结合使用；RT-PCR的步骤包括：mRNA反转录成cDNA、PCR扩增特定的基因片段、丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳染色观察DNA产物等，步骤繁琐、操作人员需要极高的专业水准，扩增经热应激的隐孢子虫卵囊hspmRNA的特异性差，特别容易受到外界干扰，检测实际样品的结果偏差较大；此外，细胞感染、体外诱导脱囊等技术，细胞培养需要严格的无菌操作环境、持续不断的营养配给，不适于应急检测，且相对常规检测而言花费颇大。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提高水中人源隐孢子虫的特异性，提升活性评价的精密度。
本发明进一步所要解决的技术问题是：提供一种评价水中人源隐孢子虫活性的方法，该方法简便有效，灵敏度高，解决隐孢子虫评价，成本高，效率低，造成二次污染等问题。
为解决上述技术问题，本发明还提供一种评价水中人源隐孢子虫活性的方法，包括以下步骤：
步骤1：提供含有一定浓度的人源隐孢子虫待测水样品；所述待测水样品中人源隐孢子虫的浓度范围为1～5×105个/L；
步骤2：向所述人源隐孢子虫待测水样品中加入PMA染料溶液；
步骤3：对添加PMA染料的人源隐孢子虫待测水样品进行强光照射，从而提高水中人源隐孢子虫的特异性，提升活性评价的精密度；
步骤4：提取经PMA和强光处理后人源隐孢子虫待测样品中的DNA；
步骤5：构建目的基因以及引物，并进行SYBRGreenqPCR反应，检测具有活性的人源隐孢子虫；所述引物为：
上游引物：5’-CAGAAACTTGAATGATATGT-3’；
下游引物：5’-GGTTGTATTTATTAGATAAA-3’。
优选地，所述步骤1待测样品中人源隐孢子虫的浓度范围为1～5×105个/L。
优选地，步骤2中所述的PMA染料溶液的溶质为二甲基亚砜DMSO；最终检测样品中PMA染料浓度为50μmol/L；PMA染料溶液置于-20℃下避光保存，使用时滴加入样品中再进行步骤3所述的强光照射处理。
优选地，所述步骤3中的强光照射是指卤素灯照射，操作条件为低温操作。
优选地，所述卤素灯照射使用的设备为大功率卤素灯，其功率范围在500～800W，照射时间2～5分钟；所述的低温操作是将样品置于冰浴环境中，以减少强光照射所产生的温度升高对隐孢子虫的活性影响。
优选地，所述步骤5是采用SYBRGreenqPCR，所述目的基因的序列为隐孢子虫18SrDNA基因为序列表中SEQIDNO.1。
优选地，所述qPCR反应，还包括qPCR反应程序：94℃一个循环，10min；95℃，30s，60℃，25s,72℃,30s，共35个循环，并收集荧光；所述qPCR反应熔解曲线的过程为：95℃，60s，之后从55℃开始，每20s温度升高0.5℃，共进行80个循环，结束温度为95℃，反应结束后4℃保持；所述qPCR反应，每次定量PCR反应都设以相同体积的双蒸水取代DNA的空白对照，每次测定设2个平行样。
优选地，所述步骤4中，提取经PMA和强光处理后样品中的DNA，其过程为：样品经15min，10000rpm离心后，去上清液，取沉淀部分于1.5mL灭菌离心管内，加入1mL灭菌蒸馏水并震荡混匀，10000rpm离心10min，弃上清液，重复两次以完成预处理；所得预处理后样品用DNA提取试剂盒提取DNA，最终得到80μL的DNA溶液置于-20℃冷冻保存。
本发明的有益效果如下：建立一种准确、快速、简便、廉价的高通量分子生物学检测技术，用于评价水中人源隐孢子虫活性。本方法是基于荧光定量PCR技术结合叠氮类染色剂的隐孢子虫活性评价方法，具有较明显的优势：评价水中人源隐孢子虫活性具有特异性强、灵敏度高、简便高效、专业操作要求不高、成本低廉且毒性微弱等优良特征，完善了两虫活性评价方法体系，可广泛应用于水源水、长距离输水系统及管网中“两虫”污染状况监测和预警、疾控防疫等领域，具有广阔的应用前景。本发明通过PMA-qPCR技术，将其应用于水中人源隐孢子虫活性评价，构建人源隐孢子虫特异性引物，优化qPCR方法体系，提高水中人源隐孢子虫活性的检测效率，降低荧光染料所产生的有毒有害性，克服物理性灭活水中“两虫”时产生的假阳性等问题。对于进一步完善两虫灭活效果评价方法体系，提高水中人源隐孢子虫活性评价的灵敏度和特异性，简化操作步骤，缩短检测时间，降低检测成本与毒性风险，促进健康饮水保障系统建设均有较强的现实意义。
附图说明
图1是本发明的PMA-qPCR检测水中人源隐孢子虫活性数据图。
图2是发明的PMA-qPCR检测水中大肠杆菌活性数据图。
图3是发明的PMA-qPCR和qPCR分别检测水中人源隐孢子虫活性对比。
具体实施方式
人源隐孢子虫(Cryptosporidiumhominis)较难获得，目前研究较少，而且其对人类的危害较大。目前，qPCR的研究主要集中在细菌、真菌等简单微生物的检测方面，而没有用于隐孢子虫或贾第虫的检测。本发明评价水中人源隐孢子虫活性的方法，该方法利用荧光定量PCR(quantitativePCR，qPCR)技术并结合叠氮类染色剂叠氮溴化丙锭(propidiummonoazide，PMA)评价水中人源隐孢子虫的活性。本发明利用PMA能够穿过非活性人源隐孢子虫受损的细胞进入其细胞内，进而嵌入非活性隐孢子虫的DNA中，在强光诱导下通过叠氮基团与DNA形成牢固的共价结合，但并不被PCR反应扩增，消除了非活性隐孢子虫DNA对检测结果的影响，进而达到了鉴别人源隐孢子虫死活的要求。该方法提高了检测的灵敏度和特异性，简化了操作步骤，缩短了检测时间，降低了检测成本，其检测时间短、灵敏度高、特异性强。
本发明实施例提供一种提高水中人源隐孢子虫特异性的方法主要包括以下步骤：
(1)提供含有一定浓度的人源隐孢子虫待测水样品：其中隐孢子虫的浓度控制在1～5×105个/L范围内；
(2)对待测水样进行PMA染料处理：将PMA染料溶解于20％的DMSO中制备成50mmol/L的储备液，置于-20℃下避光保存，检测时向样品中滴加PMA染料，在检测样品中最终浓度为50μmol/L；上下晃动3～4次，避光反应5～10min，反应过程中不时振荡离心管，使样品与PMA染料充分接触反应；
(3)对待测样品进行光催化法灭活处理：将经过PMA染色的样品反应管放在冰上或低温环境中，在功率为500～800W的卤素灯照射2～5min，减少强光照射所产生的温度升高对隐孢子虫的活性影响；反应结束后将离心管在10000rpm下离心10min，收集沉淀用于后续的DNA提取；从而提高水中人源隐孢子虫的特异性，提升活性评价的精密度。
本发明实施例PMA-qPCR法评价水中人源隐孢子虫活性的方法，包括上述步骤(1)～(3)，还进一步包括以下步骤：
(4)提取经PMA染色和强光处理后样品中的DNA，其过程为：样品经15min，10000rpm离心后，去上清液，取沉淀部分于1.5mL灭菌离心管内，加入1mL灭菌蒸馏水并震荡混匀，10000rpm离心10min，弃上清液，重复两次；所得预处理后样品用DNA提取试剂盒(上海华舜生物技术有限公司DNA抽提试剂盒)提取DNA，最终得到80μL的DNA溶液置于-20℃冷冻保存；
(5)进行qPCR反应，检测具有活性的隐孢子虫：采用SYBRGreenqPCR，进行目的基因以及引物的构建，并进行qPCR反应，其中：
qPCR反应体系的配方如表1：
表1qPCR反应体系的配方
组成 96孔(20μL/孔) 备注
PCR预混液(SYBR) 10微升 预混液终浓度1X
前引物 可变 大多数情况都是1微升
反向引物 可变 大多数情况都是1微升
去RNA酶水 可变 用水补齐20微升
cDNA模板 可变 大多数情况都是1微升或者2微升
总容量 20微升
目的基因的序列为隐孢子虫18SrDNA基因PCR扩增产物测序结果如序列表中SEQIDNO.1。
引物为：
上游引物：5’-CAGAAACTTGAATGATATGT-3’；
下游引物：5’-GGTTGTATTTATTAGATAAA-3’；
qPCR反应程序为：
94℃一个循环，10min；95℃，30s，60℃，25s,72℃,30s，共35个循环，并收集荧光，熔解曲线的过程为：95℃，60s，之后从55℃开始，每20s温度升高0.5℃，共进行80个循环，结束温度为95℃，反应结束后4℃保持；每次定量PCR反应都设空白对照(以相同体积的双蒸水取代DNA)，每次测定设2个平行样。实验结果分析包括：标样与目的基因扩增结果分析、表达结果分析及表达量差异分析。
例一
本实施例中，应用上述方法检测水中人源隐孢子虫活性，具体按步骤如下：
(1)提供含有一定浓度的活性隐孢子虫待测水样，隐孢子虫的浓度控制在1～5×105个/L范围内；
(2)将PMA染料溶解于20％的DMSO中制备成50mmol/L的储备溶液，置于-20℃下避光保存。检测时向样品中滴加PMA染料，检测样品中最终浓度为50μmol/L。上下晃动3～4次，避光反应5～10min，反应过程中不时振荡离心管，使样品与PMA染料充分接触反应；
(3)将经过PMA染色的样品反应管放在冰上或低温环境中，在功率为500～800W的卤素灯照射2～5min，减少强光照射所产生的温度升高对隐孢子虫的活性影响；反应结束后将离心管在10000rpm下离心10min，收集沉淀用于后续的DNA提取；
(4)提取PMA和强光处理后样品中的DNA；其过程为：样品经15min，10000rpm离心后，去上清液，取沉淀部分于1.5mL灭菌离心管内，加入1mL灭菌蒸馏水并震荡混匀，10000rpm离心10min，弃上清液，重复两次。所得预处理后样品用DNA提取试剂盒(上海华舜生物技术有限公司DNA抽提试剂盒)提取DNA，最终得到80μL的DNA溶液置于-20℃冷冻保存；
(5)进行qPCR反应，检测具有活性的人源隐孢子虫。采用SYBRGreenqPCR，进行目的基因以及引物的构建，并进行qPCR反应。其目的基因序列如序列表中SEQIDNO.1，引物如下：
上游引物：5’-CAGAAACTTGAATGATATGT-3’；
下游引物：5’-GGTTGTATTTATTAGATAAA-3’；
qPCR反应程序为：94℃一个循环，10min；95℃，30s，60℃，25s,72℃,30s，共35个循环，并收集荧光，熔解曲线的过程为：95℃，60s，之后从55℃开始，每20s温度升高0.5℃，共进行80个循环，结束温度为95℃，反应结束后4℃保持；每次定量PCR反应都设空白对照(以相同体积的双蒸水取代DNA)，每次测定设2个平行样及一个对照样(活性标准样品)。目的基因与标样扩增、表达结果见图1，从图中可以发现待测样品与活性标准样品荧光强度基本一致，通过线性拟合和数据分析，待测样品与标样差异性不显著(P>0.05)，PMA-qPCR法可以作为定量检测水中人源隐孢子虫活性的一种方法。
例二
按例一所述的方法，为评价PMA-qPCR法的检测灵敏性，以将大肠杆菌标准品添加入含有一定浓度的活性隐孢子虫的待测水样与不添加大肠杆菌标准品的活性隐孢子虫的待测水样进行对比试验，进行相同的实验步骤，PMA染色，强光照射处理，其结果见图2，从图中可以看出PMA-qPCR法在含有其他杂菌的情况下，仍然能够准确定量检测水中人源隐孢子虫的活性。
例三
按例一的方法，对比不同样品浓度下，PMA-qPCR和qPCR检测水中人源隐孢子虫活性的对比试验，(1)提供含有一定浓度的人源活性隐孢子虫待测水样，隐孢子虫的浓度控制在1～5×103、1～5×104个/L和1～5×105个/L三个数量级范围内；(2)提取样品中的DNA；其过程为：样品经15min，10000rpm离心后，去上清液，取沉淀部分于1.5mL灭菌离心管内，加入1mL灭菌蒸馏水并震荡混匀，10000rpm离心10min，弃上清液，重复两次。所得预处理后样品用DNA提取试剂盒(上海华舜生物技术有限公司DNA抽提试剂盒)提取DNA，最终得到80μL的DNA溶液置于-20℃冷冻保存。(3)进行qPCR反应，检测具有活性的隐孢子虫。采用SYBRGreenqPCR，并进行目的基因以及引物的构建，并进行qPCR反应。其目的基因的序列如序列表SEQIDNO.1；引物如下：
上游引物：5’-CAGAAACTTGAATGATATGT-3’；
下游引物：5’-GGTTGTATTTATTAGATAAA-3’；
qPCR反应程序为：94℃一个循环，10min；95℃，30s，60℃，25s,72℃,30s，共35个循环，并收集荧光，熔解曲线的过程为：95℃，60s，之后从55℃开始，每20s温度升高0.5℃，共进行80个循环，结束温度为95℃，反应结束后4℃保持；每次定量PCR反应都设空白对照(以相同体积的双蒸水取代DNA)，每次测定设2个平行样。实验结果见图3，从图中可以发现：PMA-qPCR法的相对荧光强度不仅高于PMA对照组，而且也高于qPCR法；同时，样品浓度也是影响检测精密度的一个重要因素，从图中可以发现：样品浓度越高，相对荧光强度的差异性越大，越容易定量检测水样中隐孢子虫活性。
例四
采用例一的方法对水中人源隐孢子虫活性进行评价，实验结果与与其他检测方法进行比较，其效率、成本等指标见下表2：
表2各种方法对水中人源隐孢子虫活性进行评价的比较
PMA-qPCR DAPI/PI 活体感染 体外诱导脱囊
检测时间(h) 2.0 3.0 240h 12h
特异性 强 较强 较强 一般
专业技术要求 较高 较高 高 高
毒害 微弱 强 微弱 微弱
成本 低 一般 高 一般
程序步骤 较简单 较简单 复杂 较复杂
从上表的比较可以得出，本发明的方法和设备简便有效、微毒、操作简便，是一种高效高安全、低成本的水中人源隐孢子虫活性评价方法，并有利于实践推广应用。
对于隐孢子虫这种原生动物，其目的基因序列及引物的设计是一个技术难点；而隐孢子虫(原生动物)检测较为复杂。本发明的检测方法与qPCR反应体系的配方、引物和目的基因序列不同；PMA染色过程、样品处理和qPCR步骤均有优化之处；具体还产生以下突出效果:
(1)PMA-qPCR法能够定量检测水中人源隐孢子虫活性；
(2)PMA-qPCR法在含有其他杂菌的情况下，仍然能够准确定量检测水中人源隐孢子虫的活性；
(3)PMA-qPCR法优于单独使用PMA和qPCR法；
(4)本发明的方法和设备简便有效、微毒、操作简便，是一种高效高安全、低成本的水中人源隐孢子虫活性评价方法。
以上所述是本发明的具体实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种评价水中人源隐孢子虫活性的方法，包括以下步骤：
步骤1：提供含有一定浓度的人源隐孢子虫待测水样品；所述待测水样品中人源隐孢子虫的浓度范围为1～5×105个/L；
步骤2：向所述人源隐孢子虫待测水样品中加入PMA染料溶液；
步骤3：对添加PMA染料的人源隐孢子虫待测水样品进行强光照射，从而提高水中人源隐孢子虫的特异性，提升活性评价的精密度；
步骤4：提取经PMA和强光处理后人源隐孢子虫待测水样品中的DNA；
步骤5：构建目的基因以及引物，并进行SYBRGreenqPCR反应，检测具有活性的人源隐孢子虫；
所述引物为：
上游引物：5’-CAGAAACTTGAATGATATGT-3’；
下游引物：5’-GGTTGTATTTATTAGATAAA-3’。
2.如权利要求1所述的提高水中人源隐孢子虫特异性的方法，其特征在于：步骤2中所述的PMA染料溶液的溶质为二甲基亚砜DMSO；最终检测样品中PMA染料浓度为50μmol/L；PMA染料溶液置于-20℃下避光保存，使用时滴加入样品中再进行步骤3所述的强光照射处理。
3.如权利要求2所述的提高水中人源隐孢子虫特异性的方法，其特征在于：所述步骤3中的强光照射是指卤素灯照射，操作条件为低温操作。
4.如权利要求3所述的评价水中人源隐孢子虫活性的方法，其特征在于：所述卤素灯照射使用的设备为大功率卤素灯，其功率范围在500～800W，照射时间2～5分钟；所述的低温操作是将样品置于冰浴环境中，以减少强光照射所产生的温度升高对隐孢子虫的活性影响。
5.如权利要求1至4任一项所述的评价水中人源隐孢子虫活性的方法，其特征在于：所述步骤5是采用SYBRGreenqPCR，所述目的基因的序列为隐孢子虫18SrDNA基因为序列表中SEQIDNO.1。
6.如权利要求1至4任一项所述的评价水中人源隐孢子虫活性的方法，其特征在于：所述qPCR反应，还包括qPCR反应程序：94℃一个循环，10min；95℃，30s，60℃，25s,72℃,30s，共35个循环，并收集荧光；所述qPCR反应熔解曲线的过程为：95℃，60s，之后从55℃开始，每20s温度升高0.5℃，共进行80个循环，结束温度为95℃，反应结束后4℃保持；所述qPCR反应，每次定量PCR反应都设以相同体积的双蒸水取代DNA的空白对照，每次测定设2个平行样。
7.如权利要求1所述的评价水中人源隐孢子虫活性的方法，其特征在于：所述步骤4中，提取经PMA和强光处理后样品中的DNA，其过程为：样品经15min，10000rpm离心后，去上清液，取沉淀部分于1.5mL灭菌离心管内，加入1mL灭菌蒸馏水并震荡混匀，10000rpm离心10min，弃上清液，重复两次以完成预处理；所得预处理后样品用DNA提取试剂盒提取DNA，最终得到80μL的DNA溶液置于-20℃冷冻保存。
CN201310542387.9A 2013-11-05 2013-11-05 一种提高水中人源隐孢子虫特异性的方法以及评价水中人源隐孢子虫活性的方法 Expired - Fee Related CN103627797B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310542387.9A CN103627797B (zh) 2013-11-05 2013-11-05 一种提高水中人源隐孢子虫特异性的方法以及评价水中人源隐孢子虫活性的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310542387.9A CN103627797B (zh) 2013-11-05 2013-11-05 一种提高水中人源隐孢子虫特异性的方法以及评价水中人源隐孢子虫活性的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103627797A CN103627797A (zh) 2014-03-12
CN103627797B true CN103627797B (zh) 2016-04-20

Family

ID=50209243

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201310542387.9A Expired - Fee Related CN103627797B (zh) 2013-11-05 2013-11-05 一种提高水中人源隐孢子虫特异性的方法以及评价水中人源隐孢子虫活性的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN103627797B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107881221B (zh) * 2017-12-29 2021-03-02 河南农业大学 基于Lectin基因对部分隐孢子虫种类的分子鉴定方法
CN108893526A (zh) * 2018-03-07 2018-11-27 西北农林科技大学 一种微小隐孢子虫荧光lamp检测方法
CN110055344A (zh) * 2019-03-07 2019-07-26 江苏省血吸虫病防治研究所 一种raa荧光法检测隐孢子虫的引物、探针及检测方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
PMA-qPCR选择性检测水中活性菌方法的研究与应用;仝铁铮;《中国优秀硕士学位论文全文数据库，医药卫生科技辑，清华大学硕士学位论文》;20120215;1、9、22-35 *
基于PMA-定量PCR选择性检测技术的病原菌消毒特性研究;仝铁铮等;《环境科学》;20110430;第32卷(第4期);1120-1126 *
河南省三株人源隐孢子虫分离株鉴定;张晓琴等;《河南预防医学杂志》;20061231;第17卷(第2期);79 *
隐孢子虫3种检测方法比较;李绍峰等;《环境工程学报》;20090131;第3卷(第1期);47-51 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN103627797A (zh) 2014-03-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
BR112014029181B8 (pt) Processo para identificar, diagnosticar ou fornecer um prognóstico
CN103627797B (zh) 一种提高水中人源隐孢子虫特异性的方法以及评价水中人源隐孢子虫活性的方法
CN103045761B (zh) 用于检测感染性眼病致病微生物的试剂盒及检测方法
CN102191321B (zh) 一种利用rna恒温扩增的解脲脲原体核酸检测试剂盒
CN103757093A (zh) 从土壤中定量检测香蕉枯萎病菌4号小种的方法
CN103498000A (zh) 一种多重pcr法检测水稻检疫性病原菌的引物组及试剂盒和方法
Sunnotel et al. Rapid and sensitive detection of single Cryptosporidium oocysts from archived glass slides
Borhani et al. Determination of vancomycin resistant Enterococcus faecium diversity in Tehran sewage using plasmid profile, biochemical fingerprinting and antibiotic resistance
CN104152582B (zh) 牛疙瘩皮肤病病毒Taqman-MGB探针实时荧光定量PCR检测用引物、试剂盒和检测方法
CN112522378A (zh) 一种检测mcr基因的试剂盒、检测方法及其应用
CN106381340B (zh) 番茄灰霉病菌lamp检测引物、检测试剂盒及其应用
CN103820574B (zh) 人疱疹病毒6型实时荧光定量pcr分型检测试剂盒
Zhang et al. Inactivating porcine coronavirus before nuclei acid isolation with the temperature higher than 56 C damages its genome integrity seriously
Feng et al. Research progress on the contamination status and control policy of Giardia and Cryptosporidium in drinking water
CN104513857A (zh) 副溶血性弧菌的环介导等温扩增检测引物组、检测方法和试剂盒
CN106148566A (zh) 一种大鲵虹彩病毒cpa检测引物及应用
CN106967826A (zh) 一种人脐带、胎盘保护液支原体检测用引物对、试剂盒及其检测方法
CN103045721B (zh) 解脲脲原体和微小脲原体的荧光定量检测方法
CN103014156B (zh) 粪肠球菌的环介导等温扩增检测引物组、检测方法和试剂盒
CN103525909A (zh) 鲍曼不动杆菌实时荧光环介导等温扩增试剂盒
CN105274220A (zh) 一种cyp4f2*3的检测引物及其检测体系
CN115747379A (zh) 单纯疱疹病毒1型和2型的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒及其专用引物和探针
CN104404151A (zh) 向日葵黑茎病菌的检测试剂盒
CN105154557A (zh) 一种检测羊泰勒虫和无浆体的双重pcr方法
CN103409518B (zh) 一种从土壤中快速检测香蕉枯萎病菌热带4号小种的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20160420

Termination date: 20181105

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee