CN103626996B - 胍基化的含二硫键聚氨基胺类聚合物及其制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药技术领域，涉及胍基化的含二硫键聚氨基胺类基因载体聚合物及其制备和应用。所述的胍基化的含二硫键聚氨基胺类基因载体聚合物，是由具有双丙烯酰结构的交联剂和胍基化试剂依次通过，苯磺酰氯类对胍基的保护反应，麦克尔加成聚合，脱去苯磺酰氯类胍基保护试剂的保护而最终制得的。聚合物基因载体能够和不同种类基因片段自组装成复合物，具有良好生物膜透过性，细胞内还原响应性降解，及核定位效应。可以通过控制胍基化试剂的种类、在聚合物中的比例以及分子量的大小来调整载体对基因片段的包载能力和转运过程。该类胍基化的SS-PAAs基因载体，可以提高基因的转染效率，并能降低的细胞毒性，是基因治疗过程中一种新型的基因载体。

Description

胍基化的含二硫键聚氨基胺类聚合物及其制备和应用

技术领域

本发明属于药物制剂新辅料和生物制剂新剂型领域，涉及胍基化的含二硫键聚氨基胺类聚合物及其制备和应用，该载体含二硫键，并具有良好膜透性和细胞内环境还原敏感性，以及拟肽核定位效应。

背景技术

基因治疗作为一种新兴的肿瘤治疗手段，近20年来，获得了医药领域专家的广泛青睐，成为了抗肿瘤药物研发的重要组成部分。基因治疗技术已经从导入期进入到成长期，具有以下明显优势：（1）能够针对疾病发生、发展的原因治疗，有望实现疾病的根本治愈；（2）基于核苷酸的互补配对原则，具有一定的天然靶向性；（3）和传统化学药物相比，具有较低的毒副作用。

基因治疗作为一种处于成长期的应用技术，有多种实施技术路线，如此多的技术路线有着不同的原理，这就意味着我们很难用一种通用载体实现基因治疗药物的体内传递；目前临床广泛应用的是基于腺病毒的病毒类载体，其在体循环稳定性和长期安全性方面存在着一定的问题。

所以非病毒类基因载体是目前该领域的研究热点，尽管非病毒类基因载体取得了长足的进展，但仍然存在着转染效率低，体循环稳定性差，和基因释放效率低等问题。解决这些问题目前主要采取增加载体细胞膜透过性（如，通过引入氨基基团增加表面正电荷密度等）和加速细胞内载体释放目的基因（如，载体胞内的还原响应性等）两个策略；但是前一策略的实施与降低载体的细胞毒性之间实际上存在矛盾关系，难以逾越。

针对非病毒类基因载体面临的现实问题，本发明构建了胍基化的SS-PAAs（含二硫键的聚氨基胺类）聚合物作为基因转运的载体。除了保留原有载体主链的二硫键（具有在细胞内环境的还原响应性）以外，更重要的是主链的胍基化，使得该类载体具有较好的膜透过性并且细胞毒性较小，同时具有精确的核定位效应。现有技术中并没有该载体的相关报道。

发明内容

本发明所解决的技术问题是提供一种含有二硫键的胍基化聚氨基胺类聚合物（SS-PAAs）。此类聚合物在生理条件下能够和目的基因片段（cDNA，microRNA，siRNA，质粒DNA，反义寡核苷酸等）形成复合物，由于其主链富含氨基和胍基官能团能够高效率的透过生物膜，主链中二硫键的存在使其具有胞内还原响应性，此外主链特殊的空间结构及类似精氨酸中的胍基官能团赋予其精确的核定位效应，因此该类聚合物能够实现高效率的基因跨膜传递，细胞内还原响应性释放，及良好的核定位效应，成为新一代高转染效率，低细胞毒性的基因治疗药物载体。可以作为基因治疗药物的多功能载体进行药物传递。

本发明是通过如下技术方案实现的：

本发明的聚合物结构如下：

所述的聚合物是N，N-双（丙烯酰）胱胺（CBA）单体和胍基化试剂的2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰氯（Pbf-Cl）保护产物聚合而成的均聚物或共聚物，并最终脱去Pbf-Cl的保护。所述的胍基化试剂选自胍、氯己定、胍基丁胺、聚六亚甲基双胍或它们的盐，胍、氯己定、胍基丁胺、聚六亚甲基双胍的分子量分别为59.07，505.45，130.27，≥2500，他们在聚合物中的比例为30-70%。

当胍基化试剂为盐酸胍时，其在聚合物中的比例为30-70%；为氯己定时，其在聚合物中的比例为30-70%；为胍基丁胺时，其在聚合物中的比例为50%；为聚六亚甲基双胍时，在聚合物中比例为50%。

本发明同时提供了胍基化聚氨基胺类聚合物（SS-PAAs）的制备方法。

其制备方法如下：

a.通过磺酰氯类对胍基的保护反应，将胍基化试剂中的胍基保护起来；

b.通过麦克尔加成聚合反应，将CBA单体交联剂聚合到各胍基单体中的伯胺或仲氨胺基团上；

c.酸性条件下脱去Pbf-Cl保护基团。

其中，步骤a中Pbf-Cl对各单体中胍基的保护反应,反应介质为能溶解反应物的各种有机溶剂或混合溶剂体系，包括丙酮、甲醇、N，N-二甲基甲酰胺或任意一种与水组成的混合溶剂。反应开始滴加Pbf-Cl丙酮溶液时，温度控制在0℃以下，滴加完毕后，反应在室温、碱性条件下进行1-4小时。

步骤b中，麦克尔加成聚合反应可以采用各种有机碱作催化剂，加速反应进行，如，加入乙醇钠，也可以不加入催化剂；反应于30-65℃，避光氮气保护条件下进行，所需时间依据是否使用催化剂，和胍基单体种类不同，从1天至6天不等。所述的交联剂N，N-双（丙烯酰）胱胺（CBA），分子量为260.38，在聚合物中的比例为30-70%。加成聚合反应的溶剂为甲醇、N，N-二甲基甲酰胺、水，或任意二者的混合溶剂。

步骤c中，脱保护反应中酸可以选择三氟乙酸（TFA）、氢氟酸、硫酸、盐酸。反应在室温条件下进行1-4小时。所述的溶剂为N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、水、甲醇以及任意两者的混合溶剂。

下面以盐酸胍或胍基丁胺的Pbf-Cl保护产物为例，来说明胍基单体与CBA聚合反应制备胍基化SS-PAAs的方法。

1、盐酸胍/胍基丁胺-CBA的制备

本发明中的聚合物分子量为2.5KDa以上，是通过具有双丙烯酰结构的CBA同含有伯氨基或两个仲氨基的胍基化试剂进行麦克尔加成聚合完成的。

本发明的盐酸胍/胍基丁胺-CBA的分子式如下：

其中R为胍或胍基丁胺，n为21-33。

1.1Pbf-Cl对胍基化试剂中胍基的保护

胍基化试剂为胍、胍基丁胺，分子量分别为59.03,130.26，合成过程中分别采用二者的盐酸盐，硫酸盐形式，它们具有良好的水溶性。

使用的胍基保护试剂Pbf-Cl，是经典的胍基保护试剂，分子量为288.79。保护反应产物中Pbf基团对酸性环境较敏感，极易脱去，脱保护反应工艺条件简单。

Pbf-Cl对盐酸胍或胍基丁胺的胍基保护反应，在pH9-12的碱性环境中进行，Pbf-Cl溶于丙酮，于零度以下滴加入溶有盐酸胍或胍基丁胺的反应液中，之后室温反应1-4小时。

盐酸胍和胍基丁胺的分子式如下：

Pbf-Cl的分子式如下：

Pbf-Cl对胍基化试剂中胍基的保护反应方程式如下：

1.2CBA同胍基保护反应产物的麦克尔加成聚合

CBA交联剂分子量为260.38，是新一代SS-PAAs加成聚合反应交联剂，分子结构中不仅有双丙烯酰结构用于和胍基化试剂聚合，其二硫键结构能够在细胞内还原敏感性环境中降解，实现基因片段的还原敏感性释放。

胍基化试剂的分子结构中至少有一个可以进行麦克尔加成聚合反应的伯胺或仲氨基团。

CBA和Pbf-Cl保护的胍基化试剂的麦克尔加成聚合反应在30-65℃，避光及氮气保护条件下进行。反应溶剂采用水和甲醇的混合溶剂，N，N-二甲基甲酰胺、水，或二者的混合溶剂能够将反应物溶解的溶剂。溶剂中水的存在具有重要意义，不仅能溶解聚合产物，而且对反应进行程度，聚合物产物的最大分子量都有影响，一定比例的水存在是必须的。

CBA交联剂的分子式如下：

CBA同胍基保护反应产物的麦克尔加成聚合反应方程式：

其中Pbf结构，前述所示，n为21-33，聚合物分子量为8.7-17.5KDa。

1.3麦克尔加成聚合反应脱去Pbf

本发明中Pbf的脱保护反应需在室温，酸性条件下进行，脱保护反应。

pbf脱保护反应方程式如下：

方程式中Pbf结构中，n为21-33，脱去Pbf保护的最终聚合物分子量为8.7-17.5KDa。最终产物采用透析的方法进行纯化，透析袋的截留分子量（MWCO）为1000。纯化后的聚合物终产品，通过冷冻干燥的方法收取。

本发明的聚合物在水中能与基因片段自发形成近似颗粒状的复合物，在pH4-9之间复合物的粒径，及表面电荷密度会发生变化。作为基因载体，在细胞内还原环境中可以发生降解，释放外源基因片段。

2、基因/载体复合物的制备

采用自组装室温孵育法制备基因载体复合物。即：在室温条件下，将不同聚合物/基因片段（N/P）在缓冲溶液中孵育5-30分钟，即得基因/载体复合物。

所述的基因片段包括cDNA质粒、siRNA质粒、cDNA片段、siRNA片段、microRNA片段；N/P值范围依据载体结构和基因片段种类不同，从1:1至48:1；缓冲溶液以HEPES缓冲液为主，还包括其他各种模拟生理条件的缓冲溶液，如磷酸盐缓冲溶液，枸橼酸缓冲液，有/无血清的细胞培养液。

本发明中的CBA，除具有麦克尔加成所必须的双丙烯酰结构，还含有能够响应细胞内还原环境的二硫键,和胍基化试剂进行麦克尔加成聚合之后，能够保留其还原敏感性，胍基化试剂又赋予聚合物良好的透膜性和核定位效应，最终制备出多功能的聚合物基因载体,对提高非病毒类基因载体的转染效率，降低细胞毒性，及未来在体内、临床的应用有重大的意义。

附图说明：

图1为三种胍基化试剂制备的聚合物包载pcDNA3.1-EGFP-cDNA质粒的体外转染效率；

图2为三种胍基化试剂制备的聚合物包载pSliencer^TM4.1CMV-FANCF-shRNA质粒的体外目的基因抑制效率；

图3为三种胍基化试剂制备的聚合物包载FANCF-shRNA片段的体外目的基因抑制效率；

图4为三种胍基化试剂制备的聚合物包载328-microRNA片段的体外转染效率；

图5为三种聚合物包载pcDNA3.1-EGFP-cDNA质粒所形成的复合物对细胞活力的影响；

图6为三种聚合物包载pSliencer^TM4.1CMV-FANCF-shRNA质粒所形成的复合物对细胞活力的影响；

图7为三种聚合物包载FANCF-shRNA片段所形成的复合物对细胞活力的影响；

图8为三种聚合物包载328-microRNA片段所形成的复合物对细胞活力的影响。

具体实施方式：

下面为本发明的实施例，但下述实施例并不限制本发明的权利范围。

实施例1：以硫酸胍基丁胺作为胍基化试剂制备SS-PAAs

材料与方法

2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰氯（Pbf-Cl）：购自吉尔生化（上海）有限公司。N,N-双（丙烯酰）胱胺（CBA）：购自阿法埃莎（天津）化学有限公司。硫酸胍基丁胺：购自常州阿奇生物科技有限公司。三氟乙酸(TFA):购自天津科密欧化学试剂有限公司。pcDNA3.1-EGFP-cDNA质粒及质粒提取试剂盒：购自天根生化科技有限公司。pSliencer^TM4.1CMV-FANCF-shRNA质粒，FANCF-shRNA，及328-microRNA片段：均由上海生物工程有限公司设计合成并购得。Lipofectamine2000：购自Invitrogen公司；ExGen500：购自Fermentas公司；MTT检测试细胞活力剂盒，细胞实验耗材，培养基，琼脂糖等：均购自宝信生物公司。

（1）Pbf-Cl对硫酸胍基丁胺中胍基结构的保护

将0.79g硫酸胍基丁胺置于50ml三颈瓶中，加入10ml水溶解，降温至0℃以下，调pH至11；缓慢滴加已溶于10ml丙酮的1gPbf-Cl，此时温度维持在0℃以下，pH维持在10-13范围内；滴加完毕后，0℃以下反应1小时，室温反应2小时，直至pH不发生变化。TLC监测反应进程。抽滤，收集沉淀，于40-60℃烘箱干燥过夜，称重，即得胍基结构被Pbf-Cl保护的胍基丁胺。

（2）以胍基丁胺为单体的胍基化SS-PAAs聚合物的合成

取（1）项下所述的0.15g胍基丁胺保护产物，0.105gCBA，置于50ml圆底烧瓶中，加入2.5ml水和6mlDMF作溶剂，45-60℃，避光，并在氮气保护、磁力搅拌条件下反应3天；TLC监测反应进程，于72小时后加入约10%过量的胍基丁胺保护产物（0.016g），继续反应24小时；停止反应，用4mol/L盐酸调体系pH为2-5，收集整个反应体系溶液，移入透析袋，透析纯化反应产物，透析介质为蒸馏水，透析袋截留分子量（MWCO）为1000，透析三天，并且每天至少更换一次透析介质；收集透析袋内溶液，置于干燥培养皿中，冻干收集聚合物产品。

（3）胍基化SS-PAAs聚合物脱去Pbf-Cl保护

取（2）项下所述的聚合物产物0.5g，TFA5ml，置于50ml圆底烧瓶；加入2.5ml水和2.5mlDMF作溶剂，室温，磁力搅拌下反应2-4小时。反应体系转移入透析袋，具体透析纯化过程如（2）项下所述。收集透析袋内溶液，置于干燥培养皿内，冻干收集聚合物终产品0.378克。

GPC测定聚合物终产品的数均分子量和质均分子量分别为：8027,10935。多分散系数（PDI）为：0.97。

实施实例2：以醋酸氯己定单体作为胍基化试剂制备SS-PAAs

（1）Pbf-Cl对醋酸氯己定中胍基结构的保护

将1g醋酸氯己定置于50ml三颈瓶中，加入15ml水溶解，降温至0℃以下，调pH至11；缓慢滴加已溶于10ml丙酮的2gPbf-Cl，此时温度维持在0℃以下，pH维持在10-13范围内；滴加完毕后，0℃以下反应1小时，室温反应3小时，直至pH不发生变化。TLC监测反应进程。抽滤，旋转蒸发除去滤液中丙酮，收集丙酮相产物，于40-60℃烘箱干燥过夜，称重，即得胍基结构被Pbf-Cl保护的氯己定。

（2）以氯己定为单体的胍基化SS-PAAs聚合物的合成

取（1）项下所述的0.47g氯己定保护产物，0.16gCBA，置于50ml圆底烧瓶中，加入2.5ml水和15mlDMF作溶剂，40-60℃，避光，并在氮气保护、磁力搅拌条件下反应6天；TLC监测反应进程，于144小时后加入约10%过量的氯己定保护产物（0.047g），继续反应24小时；停止反应，用4mol/L盐酸调体系pH为2-5，收集整个反应体系溶液，移入透析袋，透析纯化反应产物，透析介质为蒸馏水，透析袋截留分子量（MWCO）为1000，透析三天，并且每天至少更换一次透析介质；收集透析袋内溶液，置于干燥培养皿中，冻干收集聚合物产品。

（3）胍基化SS-PAAs聚合物脱去Pbf-Cl保护

取（2）项下所述的聚合物产物0.5g，TFA5ml，置于50ml圆底烧瓶；加入2.5ml水和2.5mlDMF作溶剂，室温，磁力搅拌下反应2-4小时。反应体系转移入透析袋，具体透析纯化过程如（2）项下所述。收集透析袋内溶液，置于干燥培养皿内，冻干收集聚合物终产品0.401克。

GPC测定聚合物终产品的数均分子量和质均分子量分别为：9876,16430。PDI为：0.78。

实施实例3：以盐酸胍单体作为胍基化试剂制备SS-PAAs

（1）Pbf-Cl对盐酸胍中胍基结构的保护

将1g盐酸胍置于100ml三颈瓶中，加入5ml水溶解，降温至0℃以下，调pH至11；缓慢滴加已溶于10ml丙酮的3.02gPbf-Cl，此时温度维持在0℃以下，pH维持在10-13范围内；滴加完毕后，0℃以下反应1小时，室温反应1小时，直至pH不发生变化。TLC监测反应进程。抽滤，收集沉淀产物，于40-60℃烘箱干燥过夜，称重，即得胍基结构被Pbf-Cl保护的盐酸胍。

（2）以盐酸胍为单体的胍基化SS-PAAs聚合物的合成

取（1）项下所述的0.19g盐酸胍保护产物，0.16gCBA，置于50ml圆底烧瓶中，加入25mlDMF作溶剂，40-55℃，避光，并在氮气保护、磁力搅拌条件下反应6天；TLC监测反应进程，于144小时后加入约10%过量的盐酸胍保护产物（0.019g），继续反应24小时；停止反应，用4mol/L盐酸调体系pH为3-4，收集整个反应体系溶液，移入透析袋，透析纯化反应产物，透析介质为蒸馏水，透析袋截留分子量（MWCO）为1000，透析三天，并且每天至少更换一次透析介质；收集透析袋内溶液，置于干燥培养皿中，冻干收集聚合物产品。

（3）胍基化SS-PAAs聚合物脱去Pbf-Cl保护

取（2）项下所述的聚合物产物0.5g，TFA5ml，置于圆底烧瓶；加入2.5ml水和2.5mlDMF作溶剂，室温，磁力搅拌下反应2-4小时。反应体系转移入透析袋，具体透析纯化过程如“53”项下所述。收集透析袋内溶液，置于干燥培养皿内，冻干收集聚合物终产品0.433克。

GPC测定聚合物终产品的数均分子量和质均分子量分别为：7028,10517。PDI为：1.12。

实施实例4：基因/胍基化SS-PAAs载体复合物的制备

pcDNA3.1-EGFP-cDNA质粒，pSliencer^TM4.1CMV-FANCF-shRNA质粒，FANCF-shRNA，及328-microRNA片段，分别用50mM，pH为7.4的HEPES缓冲溶液稀释至0.075mg/ml；实例1、2、3项下所述的三种聚合物载体，以0.9mg/ml溶解在HEPES缓冲液中，并以1:1的比例用HEPES缓冲液稀释；分别取0.8ml三种聚合物载体溶液，加入到不同种类0.2ml的基因片段溶液中，混合液在EP管中涡旋5秒，并在室温条件下孵育10-30min，即得不同种类，聚合物/载体质量比为48/1,24/1,12/1的基因/胍基化SS-PAAs载体复合物。动态光散射（DLS）法测定复合物粒径和Zeta电位，表1-4为各组实验三次测定粒径和Zeta电位的平均值。

表1为胍基化SS-PAAs和pcDNA3.1-EGFP-cDNA质粒形成复合物的粒径和Zeta电位：

表2胍基化SS-PAAs和pSliencer^TM4.1CMV-FANCF-shRNA质粒形成复合物的粒径和Zeta

电位：

表3胍基化SS-PAAs和FANCF-shRNA片段形成复合物的粒径和Zeta电位：

表4胍基化SS-PAAs和328-microRNA片段形成复合物的粒径和Zeta电位：

实施例4中所述的，对于不同基因片段和聚合物载体所形成的复合物，其粒径和Zeta电位测定结果表明：几种复合物粒径均在纳米级别，Zeta电位均是阳性，具备了一般阳离子聚合物基因载体的物理化学性质。

实施实例5：载体相关性质检测试验：胍基化SS-PAAs基因载体的体外转染效率评价

(1)载体包载pcDNA3.1-EGFP-cDNA质粒的体外转染效率研究

按照实施例4所述方法制备不同N/P值（48/1,24/1,12/1）的复合物之后，将三种复合物按照每孔500μl的浓度加入正常培养MCF10A细胞的六孔板中，培养基中含有血清（BSA）；转染后48小时，利用流式细胞仪检测绿色荧光蛋白的表达情况，并由流式细胞仪软件确定转染效率。选择商品化转染试剂Lipofectamine2000作为对照。结果如图1所示。

(2)载体包载pSliencer^TM4.1CMV-FANCF-shRNA质粒的体外转染效率研究

按照实施例4所述方法制备不同N/P值（48/1,24/1,12/1）的复合物之后，将三种复合物按照每孔500μl的浓度加入正常培养MCF10A细胞的六孔板中，培养基中含有血清（BSA）；转染后48小时，利用免疫荧光检测FANCF基因表达的情况，利用流式细胞仪评价绿色荧光强度，间接评价FANCF的沉默效率。选择商品化转染试剂Lipofectamine2000作为对照。结果如图2所示。

(3)载体包载FANCF-shRNA片段的体外转染效率研究

按照实施例4所述方法制备不同N/P值（48/1,24/1,12/1）的复合物之后，将三种复合物按照每孔500μl的浓度加入正常培养MCF10A细胞的六孔板中，培养基中含有血清（BSA）；转染后48小时，利用免疫荧光检测FANCF基因表达的情况，利用流式细胞仪评价绿色荧光强度，间接评价FANCF的沉默效率。选择商品化转染试剂Lipofectamine2000作为对照。结果如图3所示。

(4)载体包载328-microRNA片段的体外转染效率研究

按照实施例4所述方法制备不同N/P值（48/1,24/1,12/1）的复合物之后，将三种复合物按照每孔500μl的浓度加入正常培养MCF10A细胞的六孔板中，培养基中含有血清（BSA）；转染后48小时，利用Realtime-PCR检测328-microRNA的表达情况。选择商品化转染试剂Lipofectamine2000作为对照。结果如图4所示。

载体相关性质检测试验：胍基化SS-PAAs基因载体的体外细胞毒性评价

按实施例4所述方法制备不同N/P值（48/1,24/1,12/1）的复合物之后，将三种复合物按照每孔500μl的浓度加入正常培养MCF10A细胞的六孔板中，培养基中含有血清（BSA），继续培养24小时；之后弃去含复合物的培养基，采用经典的MTT法测定细胞活力，以未经复合物处理的细胞活力作为100%，并以ExGen500作为对照载体。结果如图5-8所示。

按照“92”项下所述，图5表示三种聚合物包载pcDNA3.1-EGFP-cDNA质粒所形成的复合物对细胞活力的影响；图6表示三种聚合物包载pSliencer^TM4.1CMV-FANCF-shRNA质粒所形成的复合物对细胞活力的影响；图7表示三种聚合物包载FANCF-shRNA片段所形成的复合物对细胞活力的影响；图8表示三种聚合物包载328-microRNA片段所形成的复合物对细胞活力的影响。

结果表明，三种基因载体，对cDNA质粒，siRNA质粒或片段，micro-RNA片段均具有较高的体外转染效率，且细胞毒性较低，达到了预期构建更理想的基因载体的目标。

Claims (10)

1.胍基化的含二硫键的聚氨基胺类聚合物，其特征在于，其结构和分子量如下：

R代表不同的胍基化试剂：

聚合物分子量为8.7-17.5KDa，n为5-33。

2.如权利要求1所述的胍基化的含二硫键的聚氨基胺类聚合物的制备方法，其特征在于，通过如下步骤制备：

a.通过磺酰氯类对胍基的保护反应，对胍基化试剂中的胍基进行保护；

b.通过麦克尔加成聚合反应将交联剂聚合到胍基单体中的伯胺或仲氨基团上；

c.在酸性条件下，将麦克尔加成聚合反应产物脱去保护基团；透析纯化后，干燥，除去反应体系中的溶剂，即得终产物。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤a中磺酰氯类保护试剂为2,2,4,6,7-五甲基-二氢苯并呋喃-5-磺酰氯，反应开始滴加保护试剂的丙酮溶液时，温度控制在0℃以下，滴加完毕后，反应在室温、碱性条件下进行1-4小时。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤b中麦克尔加成聚合反应溶剂是甲醇、N，N-二甲基甲酰胺、水，或任意二者的混合溶剂，反应于30-65℃，避光氮气保护条件下进行，步骤c中，酸为三氟乙酸、氢氟酸、硫酸、盐酸，反应在室温条件下进行1-4小时，溶剂为N，N-二甲基甲酰胺、水、甲醇或任意两者的混合溶剂。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的胍基化试剂为胍、氯己定、胍基丁胺、聚六亚甲基双胍四种或它们的盐，且在聚合物中的比例为30-70％。

6.权利要求1所述的胍基化的含二硫键的聚氨基胺类聚合物在转运基因中的应用。

7.基因/聚氨基胺类聚合物复合物，其特征在于，权利要求1的聚合物与基因片段在缓冲溶液中室温条件下孵育5-30分钟，采用自组装法制备。

8.根据权利要求7所述的基因/聚氨基胺类聚合物复合物，其特征在于，孵育用缓冲溶液为HEPES缓冲液、磷酸盐缓冲液、枸橼酸缓冲液、无血清的细胞培养液或含血清的细胞培养液。

9.根据权利要求8所述的复合物，其特征在于，所述的基因片段为cDNA质粒或片段，siRNA质粒或片段或microRNA片段，聚合物与基因片段的N/P值为1:1-48:1。

10.根据权利要求7-9任何一项所述复合物与药学上可接受的赋形剂混合，制备临床可接受的注射剂，包括局部注射剂，静脉注射剂。