CN103619918A - 包含聚(甲基乙烯基醚-共-马来酸酐)的酯的纳米颗粒及其用途 - Google Patents

包含聚(甲基乙烯基醚-共-马来酸酐)的酯的纳米颗粒及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于包封化合物的纳米颗粒、其制备和用途，所述纳米颗粒基于聚(甲基乙烯基醚-共-马来酸酐)(PVM/MA)共聚物的半(C1-C4)烷基酯。所述纳米颗粒可以包封或合并用于农业、化妆品、食品或制药领域的目的产品。

Description

包含聚(甲基乙烯基醚-共-马来酸酐)的酯的纳米颗粒及其用途
技术领域
本发明涉及生物相容性的纳米粒子递送系统，包括基于具有高黏膜生物黏附能力和在水性介质中高长期稳定性的聚(甲基乙烯基醚-共-马来酸酐)(PVM/MA)共聚物的半酯的纳米颗粒。所述纳米颗粒能够有效合并农业、化妆品、食品和制药中的目的产品。本发明还涉及一种用于生产所述纳米颗粒的方法以及涉及所述纳米颗粒的用途和应用。
背景技术
生物黏附聚合纳米颗粒或微米颗粒被认为是用于递送许多化合物(包括治疗分子)有前途的颗粒系统。这些系统的生物黏附特性提供了创建与黏膜表面的强相互作用和延长接触的可能，从而导致显著提高药物吸收和改善患者依从。不同的研究和综述描述了对颊、鼻、眼、口、直肠和阴道途径的有益施用并且提供了当使用生物黏附制剂时可体内实现的实例。
颊生物黏附微米颗粒和纳米颗粒使得在黏膜中能够实现表面药物释放。在口腔内，已经描述了治疗牙痛、细菌和真菌感染、口疮性溃疡、扁平苔癣、炎症以及牙口腔炎。大量研究已经报道颊递送系统用于药物(例如，芬太尼、登布茶碱、硫酸锌、洗必泰和茶碱)的控制释放的用途。基于生物黏附聚合物(例如，壳聚糖、透明质酸和其他聚合物)的鼻内黏膜黏附微球增强药物生物利用度[1-3]，包括去氨加压素。类似地，这些系统增强了生物活性分子(例如降钙素)的口服生物利用度。另外，在眼科中生物黏附微米载体和纳米载体施用于许多药物的表面施用，其中它们可延长药物释放并且不生产外来物或视觉模糊的感觉。黏膜黏附纳米颗粒和微米颗粒也已经施用于表面递送策略，包括皮肤递送目的，或递送至毛囊。一种用于制备黏膜黏附微米颗粒的新方法被认为是在治疗白色念珠菌(Candida albicans)中用于硝酸益康唑的创新性阴道递送系统。生物黏附微米颗粒和纳米颗粒的领域内最有兴趣的研究区域之一集中在黏膜疫苗接种和免疫治疗，以增强抗体应答在血清以及表面和远端黏膜分泌物中的诱导。在使用这种方法中的显著优点包括易于施用和生产系统性免疫和黏膜免疫。
描述了施用许多生物黏附聚合物以获得生物黏附颗粒系统，包括聚丙烯酸(PAA)、聚乙烯醇(PVA)、纤维素衍生物和海藻酸钠。还研究了多种丙烯酸共聚物，例如丙烯酸/聚乙二醇单甲醚共聚物和丙烯酸-丙烯酸2-乙基己酯共聚物。已经证明PAA、壳聚糖及其衍生物、羟丙基纤维素(HPC)、PVA、明胶、角叉菜胶、羧甲基纤维素钠(NaCMC)和透明质酸与颊黏膜的相互作用。
其他有希望的生物黏附聚合物是以商标由InternationalSpecialty Product(ISP)销售的那些，即聚甲基乙烯基醚-共-马来酸酐(PVM/MA)共聚物，其被施用为黏附剂、粘合剂、固定剂、黏膜黏附剂以用于口服递送策略、颊黏附策略、经皮递送系统和其他美容应用(例如毛发造型产品)。
Figure BPA0000181600080000022
共聚物包括：
Figure BPA0000181600080000023
AN共聚物，酸酐形式，其提供为水不溶性白色粉末，其可容易水解以生产水溶性游离酸(
Figure BPA0000181600080000024
S)的透明溶液。
Figure BPA0000181600080000025
S共聚物，游离酸形式，其以溶液或粉末形式提供；
MS共聚物，PVM/MA共聚物的钠/钙混合盐，其提供为粉末，可在水中缓慢水解，以及
Figure BPA0000181600080000027
ES共聚物，PVM/MA共聚物的不同烷基链长度和分子量的半酯形式，即
Figure BPA0000181600080000028
ES225(单乙酯)、
Figure BPA0000181600080000029
ES425(单丁酯)和
Figure BPA00001816000800000210
ES335I(异丙酯)；这些共聚物是水不溶性的，但是当它们在水溶液中被碱中和时为水溶性的，并且它们提供为醇溶液。
合成PVM/MA共聚物具有非常不同的应用。举例说明，
Figure BPA00001816000800000212
AN共聚物广泛用作增稠剂和凝聚剂、牙科黏附剂、口服片剂的赋形剂、经皮贴剂的赋形剂等。另外，还报道了这些共聚物用于药物的控制释放和以基质形式在眼中以及在用于药物递送目的或黏膜疫苗的制造生物黏附微米颗粒或纳米颗粒中用于药物的表面释放的用途[4-5]。S共聚物在牙膏和漱口水中主要用作颊卫生用品的黏合聚合物以用于抗微生物剂的延长递送。MS共聚物用于牙套黏合剂、造口术黏合剂和用于黏膜应用的表面载体(carrier)；报道了用于表面颊腔递送目的的基于
Figure BPA0000181600080000033
MS共聚物的微米颗粒和纳米颗粒。
Figure BPA0000181600080000034
ES共聚物用于肠膜涂覆剂和用于造口术黏附剂；报道了基于PVM/MA共聚物的正己基半酯、包含酮咯酸氨丁三醇、平均直径为100至150μm的微米颗粒[6]，尽管所述微米颗粒的最终应用是有限的，因为它们通常在体外经4至5天会降解。
许多研究已经使用PVM/MA共聚物以获得微米或纳米颗粒系统。
基于
Figure BPA0000181600080000035
AN共聚物的纳米系统主要通过溶剂置换方法获得。在这种情况中，已经报道了用水醇(hydroalcoholic)相对丙酮中的PVM/MA共聚物去溶剂化然后用交联剂(例如，聚胺或蛋白质)形成纳米颗粒的交联。这些纳米系统在水性介质中的稳定性非常短，因为
Figure BPA0000181600080000036
AN共聚物水解成水溶性的
Figure BPA0000181600080000037
S共聚物。在水性介质中，所述纳米颗粒可非常快速地溶解。
Figure BPA0000181600080000038
AN纳米系统在水性介质中的稳定需要用交联剂(cross-linking agent或cross-linker)对PVM/MA共聚物进行化学改性和功能化，所述交联剂例如有多胺化合物诸如亚精胺或精胺(尽管该偶联反应在某些条件下需要至少20小时)、二胺化合物诸如有毒的1，3-二氨基丙烷(DP)、或者免疫原性分子诸如牛血清白蛋白(BSA)。添加DP仅微弱地增强了
Figure BPA0000181600080000039
AN纳米颗粒在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的稳定性[7]。交联PVM/MA纳米颗粒的其他缺点包括纳米颗粒尺寸的显著增加或纳米系统生物黏附能力的显著降低。为了增强
Figure BPA00001816000800000310
AN纳米颗粒的生物黏附能力，所述纳米颗粒可通过水溶性聚合物如聚乙二醇(PEG)进行改性。然而，完成该方法具有一些缺点，例如，用含羟基的化合物改性马来酸酐共聚物以形成酯衍生物需要高温和极端的酸性条件，以及使用亲水性PEG(低OH含量)可使
Figure BPA00001816000800000311
AN共聚物转化成水溶性更强的衍生物，从而降低所得纳米颗粒在水性介质中的稳定性。
另外，已经报道了一些与
Figure BPA00001816000800000312
AN纳米颗粒用于在聚合物的有机相(AN在丙酮中的溶液)中合并水溶性药物的能力有关的困难。如已知的，水溶性药物在丙酮中是不溶的并且可形成大尺寸晶体，一旦添加水醇溶液以沉淀纳米系统形式的
Figure BPA0000181600080000042
AN，该晶体可干扰纳米颗粒的形成。因此，仅通过将水溶性药物(5-氟尿苷(FURD))与之前形成的纳米颗粒孵育使所述药物装载到
Figure BPA0000181600080000043
AN纳米颗粒中，因此获得非常低的封装效率(约13％)[8]。
关于
Figure BPA0000181600080000044
AN纳米颗粒合并水不溶性或不良水溶性分子的能力，有必要使用络合剂诸如环糊精(CD)或增溶剂包括PEG和氨基酸(例如，甘氨酸)，以便增强所述类型分子在
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AN纳米颗粒中的合并，事实上，如果不使用络合剂或增溶剂，那么没有掺入到
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AN纳米颗粒中的游离药物将沉淀为在减压下有机溶剂蒸发后获得纳米颗粒的最终水性悬液中的大晶体。因此，如果不使用共溶剂，那么不良水溶性分子封装效率极低。尽管使用共溶剂PEG和氨基酸提高了不良水溶性化合物(例如，紫杉醇)的封装效率，但是其显著地降低了纳米颗粒制造方法的产率。
由双乳化技术制备的MS微球显示出水不溶性分子的低封装效率(在三氯生的情况中为约30％)。另外，实现了三氯生的快速释放(在PBS中在第一小时内约100％)，这表明了
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MS微系统的低稳定性以及快速药物释放和/或微系统降解[9]。此外，基于MS的颗粒系统显示出在等渗磷酸盐缓冲液(pH7.0)中的快速膨胀(膨胀半衰期为约10分钟)和对猪食管黏膜的短保留时间[10]。
另一方面，纳米颗粒生产的一个非常重要的方面是工业生产和放大工艺的复杂性。已经开发了许多技术以制备用于递送药物的纳米颗粒如乳化或溶剂蒸发技术，其涉及使用有机有毒溶剂(例如，二氯甲烷、乙酸乙酯、氯仿、丙酮等)和专用复杂设备如均质机。所述技术在大规模生产的实施仍是一个挑战，因为其需要确定的步骤(包括工艺可行性、制剂优化、工艺优化、放大和验证)以开发合格产品和提供用于生产步骤的合理方法(包括药物浓缩和聚合物浓缩、加工操作、颗粒尺寸、药物稳定性或封装效率)。
尽管已知基于使用PVM/MA共聚物的用于递送目的产品的大量纳米颗粒系统，但是有一些仍未解决并且限制其应用的缺点。
因此，有必要开发另一些能够解决全部或一些与基于PVM/MA共聚物的纳米颗粒系统有关的上述缺点的用于递送目的产品的纳米颗粒系统，例如，在水性介质中的低长期稳定性、使用交联剂以改进水性介质中的稳定性、亲水性化合物的低封装效率、使用共溶剂或络合剂以改进包封疏水性化合物的效率、成本以及需要使用有毒有机溶剂或复杂技术的复杂生产工艺。有利地，所述另一些用于递送目的产品的纳米颗粒系统除了高黏膜生物黏附能力之外应具有在水性介质中的高长期稳定性及目的产品(包括油以及小或大的亲水性或疏水性的化合物)的高封装效率，和/或它们应通过更简单的、环境友好的工艺进行生产。这些目的可通过由本发明提供的纳米颗粒来实现。
简要说明
现在出乎意料地发现，任选地在赋形剂的存在下使包含聚(甲基乙烯基醚-共-马来酸酐)(PVM/MA)共聚物的半(C1-C4)烷基酯的可药用或可美容用的溶剂诸如乙醇或多元醇(例如，丙二醇)与水性介质混合，使得自发形成具有非常均匀小尺寸(约130nm)和高纳米颗粒产率(约98％)的纳米颗粒。该方法使得所获得的纳米颗粒具有大的和小的亲水性分子(BSA和罗丹明B)以及疏水分子(酮康唑、米诺地尔和三氯生)二者的高封装效率，而不需要另一些通常施用以获得纳米系统的有机溶剂(例如，丙酮、二氯甲烷或乙酸乙酯)、共溶剂(例如，CD或PEG)或表面活性剂。另外，该纳米颗粒制备方法还使得，一旦包含目的产品(POI)的共聚物溶液与体液相混合，则在所述体液中形成原位自组装纳米颗粒(SANP)；因此，装载POI的纳米颗粒可在与体液(水性介质)接触时原位自发地形成。
基于PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的纳米颗粒的制备方法的简易性降低了工业规模成本，因为在不使用任何特定装置的情况下获得这些纳米系统的简易性。另外，与其他PVM/MA纳米颗粒(例如，基于
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AN的纳米颗粒)相比，在这些系统的制备中避免丙酮作为溶剂、化学交联和干燥过程是有利的关键步骤。
所得的基于PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的纳米颗粒已经显示出的长期稳定性(低降解率)高于基于AN的纳米颗粒的长期稳定性(低降解率)，在水性介质中在不同的条件下在3个月内平均尺寸没有任何变化。这使得基于PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的纳米颗粒的水性悬液可以直接商业化而不需要使用有毒的交联剂、冻干或其他干燥技术。另外，它们可容易地掺入许多剂型中，如广泛用于化妆品工业和制药工业的溶液、悬液、凝胶和半固体或固体。
另外，基于PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的纳米颗粒对猪的颊和舌黏膜模型表面展现出的黏附亲和力高于针对其他基于
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AN的共聚物的纳米颗粒所观察到的，这确保有效增强目的产品的控制释放。
令人惊讶地，PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯以及基于PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的纳米颗粒具有不良水溶性化合物的共溶剂效应，导致增强在这些研究中所用的疏水性药物(酮康唑、米诺地尔或三氯生)的封装效率。因此，所述基于PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的纳米颗粒确保对包封亲水性分子和尤其是疏水性分子二者的高效率而不需要使用共溶剂或络合剂。
综上所述，基于PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的纳米颗粒除了其他以外显示出以下特性：(i)对黏膜表面的高黏附亲和力；(ii)在水性介质和水醇介质二者中的高长期稳定性(降解率)；(iii)对包封亲水性分子和尤其是疏水性分子的高效率而不需要共溶剂或络合剂；以及(iv)掺入许多剂型(例如，液体、固体或半固体诸如悬液、凝胶等)的高方便性。另外，有利地，可以以小规模和大规模水平容易地生产所述纳米颗粒而不需要使用有毒有机溶剂或复杂技术。所有上述特性均有利于所述纳米颗粒在不同领域中(例如在农业、食品等领域中，特别是在化妆品和制药领域中)作为控制释放递送系统用于不同表面(除了其他以外包括毛发、皮肤等)或其通过至少颊、鼻、口、直肠、阴道等途径施用的用途。
因此，本发明的一个目的是基于PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的纳米颗粒的生产和用途。
因此，在一个方面中，本发明涉及选自以下中的纳米颗粒：
a)基质纳米球，其中所述基质纳米球包含基质，所述基质包含聚(甲基乙烯基醚-共-马来酸酐)(PVM/MA)共聚物的半(C1-C4)烷基酯；以及
b)核-壳型囊状纳米胶囊，其中所述核-壳型囊状纳米胶囊包含核和壳，所述壳包含PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯。
在一个特定的实施方案中，由本发明提供的所述纳米颗粒还包含目的产品，例如农业、化妆品、食品或制药工业中的目的产品。
在另一个方面中，本发明涉及包含至少一种由本发明提供的纳米颗粒和载体的组合物。在一个特定的实施方案中，所述组合物为适合用于通过颊、齿、鼻、眼、口、肠胃外、直肠、表面或阴道途径施用的化妆品组合物或药物组合物。
在另一个方面中，本发明涉及包含以下的组合物：
a)选自以下中的组分：
i.至少一种根据本发明的纳米颗粒；及
ii.在介质中包含聚(甲基乙烯基醚-共-马来酸酐)(PVM/MA)共聚物的半(C1-C4)烷基酯和目的产品的溶液或悬液，所述介质包含挥发性水可混溶的醇和水性介质，其中水性介质的量低于形成纳米颗粒所需水性介质的量；以及
b)载体，
其中所述目的产品选自乙酰水杨酸、α-心房利钠肽、精氨酸血管升压素、阿托品、奥格莫森(augmerosen)、阿托伐他汀、
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(贝伐单抗)、降钙素、绒毛膜促性腺激素、促肾上腺皮质激素、去氨加压素、地棘蛙素(epibatidine)、
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(西妥昔单抗)、艾塞那肽、
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(曲妥珠单抗)、
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(阿达木单抗)、
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酮康唑、兰乐肽(lanreotide)、促黄体素α、美托洛尔、米诺地尔、奈西立肽、奥曲肽、紫杉醇、对乙酰氨基酚、哌加他尼(pegaptanib)、重组促卵泡激素、重组生长因子、(英夫利昔单抗)、(利妥昔单抗)、舍莫瑞林、促生长素(somatotropin)、紫杉烷衍生物、泰素、醋酸特立帕肽(teriparatide acetate)、促甲状腺素、三氯生、尿促卵泡素、
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(奥马珠单抗)、放线菌素D、阿苯达唑、醛固酮、阿普唑伦、胺碘酮(amiodarone)、阿米替林、安普那韦、阿西马朵林(asimadoline)、阿托伐他汀、布尼洛尔、丁螺环酮、喜树碱、卡马西平、卡维地洛、塞利洛尔、环孢素A、西米替丁、克霉唑、秋水仙碱、可的松、柔红霉素、异喹胍(debrisoquine)、地塞米松、地西泮、洋地黄毒苷、地高辛、地尔硫卓、多西他赛、多潘立酮、多柔比星、依法韦仑、表柔比星、红霉素、麦角胺、雌二醇、葡萄糖醛酸雌二醇、厄洛替尼、依托泊苷、苯妥英、芬太尼、非洛地平、吩噻嗪类、非索非那定、氟喹诺酮类、氟尿嘧啶、FK-506、庆大霉素、灰黄霉素、氢化可的松、伊马替尼、茚地那韦、伊曲康唑、伊维菌素、酮康唑、山奈酚(kaempferol)、左氧氟沙星、利多卡因、洛哌丁胺、氯沙坦、洛伐他汀、甲苯达唑、甲泼尼龙、甲氨蝶呤、咪拉地尔(mibefradil)、咪达唑仑、尼索地平、吗啡、那非那韦、尼卡地平、尼群地平、硝苯地平、昂丹司琼、紫杉醇、喷他佐辛、吡喹酮(praziquantel)、泼尼松龙、泼尼松、槲皮素、奎尼丁、雷尼替丁、雷帕霉素、利福布汀、利福平、利托那韦、沙奎那韦、西罗莫司、磺胺甲二唑(sulfamethizole)、他克莫司、他莫昔芬、他林洛尔、替尼泊苷、特非那丁、四环素、拓扑替康、曲安西龙、伐司朴达(valspodar)、维拉帕米、长春碱、长春新碱、长春地辛、佐匹克隆及其混合物。
在另一个方面中，本发明涉及包含由本发明提供的纳米颗粒的食品。
在另一个方面中，本发明涉及由本发明提供的纳米颗粒，其中目的产品为米诺地尔，用于治疗脱发；或者其中目的产品为三氯生或酮康唑，用于治疗颊感染。
在又一些方面中，本发明涉及由本发明提供的纳米颗粒的用途，其中目的产品为米诺地尔，用于制备用于治疗脱发的药物；或者其中目的产品为三氯生或酮康唑，用于制备用于治疗颊感染的药物。
在又一些方面中，本发明涉及一种在对象中治疗脱发的方法，包括向所述对象施用装载有米诺地尔的由本发明提供的纳米颗粒；或者一种在对象中治疗颊感染的方法，包括向所述对象施用装载有三氯生或酮康唑的由本发明提供的纳米颗粒。
在另一个方面中，本发明涉及一种生产包含基质的基质纳米球的方法，所述基质包含聚(甲基乙烯基醚-共-马来酸酐)(PVM/MA)共聚物的半(C1-C4)烷基酯，所述方法包括使包含PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的溶液或悬液与水性介质接触以形成所述基质纳米球。
在另一个方面中，本发明涉及一种用于生产包含目的产品的基质纳米球的方法，其中所述基质纳米球包含基质，所述基质包含聚(甲基乙烯基醚-共-马来酸酐)(PVM/MA)共聚物的半(C1-C4)烷基酯，所述方法包括：
a)使包含所述目的产品和所述PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的醇或水醇(hydroalcoholic)、溶液或悬液与水性介质相接触；或者，可替换地，
b)使包含所述目的产品和所述PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的醇溶液或悬液与水性介质相接触；或者，可替换地，
c)使包含所述目的产品和所述PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的有机溶液或悬液与水性介质相接触，其中所述有机溶液或悬液包含非挥发性水可混溶的溶剂。
在另一个方面中，本发明涉及一种用于生产包含目的产品的核-壳型囊状纳米胶囊的方法，其中所述核-壳型囊状纳米胶囊包含核和壳，所述壳包含PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯，所述方法包括使包含所述目的产品和所述PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的溶液或悬液与水性介质接触。
附图说明
图1.通过(A)扫描电子显微法(SEM)和通过透射电子显微法(TEM)所获得的
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ES225纳米颗粒的照片。
图2.与在室温(25℃)下纳米颗粒浓度相关的稳定性研究和相应的扫描电子显微法(SEM)。(A)和(C)分别示出了分别在水解前和水解后通过SEM所获得的AN纳米颗粒的照片；(B)在24小时通过SEM所获得的
Figure BPA0000181600080000093
ES225纳米颗粒的照片。
图3.在室温(25℃)下在稳定性研究期间监测
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ES225和
Figure BPA0000181600080000095
AN纳米颗粒二者的尺寸。
图4.使用双蒸水作为分散介质在不同温度下(即，在(A)4℃、(B)室温(25℃)和(C)37℃下)，
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ES225(GES NP)和AN(GAN NP)纳米颗粒之间的比较稳定性研究。在该测试中所用的纳米颗粒的浓度为10mg/mL。
图5.(A)柠檬精油对照制剂和(B)装载柠檬精油的
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ES425纳米胶囊的荧光显微法。
图6.装载FITC-BSA的ES425纳米颗粒的荧光显微法。
图7.(A)装载酮康唑的
Figure BPA00001816000800000910
ES425纳米颗粒(
Figure BPA00001816000800000911
ES425纳米颗粒)和(B)通过应用于纳米颗粒形成的相同方法处理的KTZ晶体的扫描电子显微法(SEM)。
图8.(A)三氯生(TRI)晶体、(B)装载三氯生的
Figure BPA00001816000800000912
ES425纳米颗粒(
Figure BPA00001816000800000913
ES425纳米颗粒)、(C)TRI油的扫描电子显微法(SEM)和(D)采用亲脂性荧光探针1，1′-二(十八烷基)-3，3，3′，3′-四甲基-吲哚羰花青高氯酸盐染色的TRI乳剂的荧光显微法。
图9.监测装载米诺地尔的
Figure BPA00001816000800000914
ES425纳米颗粒(
Figure BPA00001816000800000915
ES425纳米颗粒)的纳米颗粒尺寸。所研究的制剂为具有200和250mg MXD的没有赋形剂或者具有丙二醇(PG)、甘油(G)或聚乙二醇400(PEG)的装载MXD的
Figure BPA00001816000800000916
ES425纳米颗粒。
图10.没有赋形剂或者具有丙二醇(NPGES/MXD PG)、甘油(NPGES/MXD G)或聚乙二醇400(NPGES/MXD PEG)的装载MXD的
Figure BPA0000181600080000101
ES425纳米颗粒制剂和商品(
Figure BPA0000181600080000102
和
Figure BPA0000181600080000103
)在干燥前和干燥后的宏观可视化和微观可视化。所有制剂以类似的MXD浓度(2％w/v)使用。
图11.对于没有赋形剂(NPGES/MXD)或者具有赋形剂甘油(NPGES/MXD G)、丙二醇(NPGES/MXD PG)和PEG400(NPGES/MXD PEG)的MXD
Figure BPA0000181600080000104
ES425纳米颗粒和对于商品(
Figure BPA0000181600080000105
和
Figure BPA0000181600080000106
)进行的扫描电子显微法(SEM)。
图12.对于毛发样品的微观表征。毛发结构20×，(A)对于没有经荧光标记的
Figure BPA0000181600080000107
ES425纳米颗粒的正常毛发的荧光显微法；和(B)对于M1组(C)和M2组(D)的正常毛发的荧光显微法。
图13.与用于毛发M1组(A、B)和M2组(C、D)的
Figure BPA0000181600080000108
ES425纳米颗粒孵育的正常毛发的扫描电子显微法(SEM)。
图14.在不同时间在猪的颊和舌黏膜组织二者中的纳米颗粒制剂的累积黏附量的测定。制剂为：具有罗丹明B的经荧光标记的
Figure BPA0000181600080000109
ES225纳米颗粒(NP GESR)的水性悬液；具有罗丹明B的经荧光标记
Figure BPA00001816000800001010
AN纳米颗粒(NP GANR)的水性悬液；经荧光标记的
Figure BPA00001816000800001011
ES225(GEL NPGESR)；或悬浮于透明质酸钠凝胶(0.75％w/v)中的经荧光标记
Figure BPA00001816000800001012
AN纳米颗粒(GEL NPGANR)。每个值表示为平均值(n＝3；SD为低于平均值的20％)。
图15.颊黏膜横截面的组织可视化：(A)颊黏膜的光学显微法；(B)没有纳米颗粒的颊组织的荧光显微法；(C)装载罗丹明B的ES225纳米颗粒施用后0.5小时；(D)装载罗丹明B的
Figure BPA00001816000800001014
AN纳米颗粒施用后0.5小时；(E)装载罗丹明B的ES225纳米颗粒施用后2.5小时；和(F)装载罗丹明B的
Figure BPA00001816000800001016
AN纳米颗粒施用后2.5小时。
图16.具有称作“丝状乳突”的微小毛发样凸起的猪舌背表面横截面的组织可视化。(A)舌背黏膜表面的光学显微法；(B)装载罗丹明B的
Figure BPA00001816000800001017
AN纳米颗粒施用后2.5小时；(C、D)装载罗丹明B的
Figure BPA00001816000800001018
ES225纳米颗粒施用后2.5小时。
发明详述
本发明提供了基于PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的纳米颗粒、用于生产所述纳米颗粒的方法，以及所述纳米颗粒的应用。
定义
为了促进理解本发明的目的，在本发明的上下文中使用的一些术语和表达的涵义陈述如下。
本文中使用的术语“(C 1 -C 4 )烷基”涉及衍生自1至4个碳原子的线性或支链烷的原子团，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基等。
本文中使用的“平均尺寸(average size或mean size)”涉及在水性介质中一起移动的纳米颗粒群体的平均直径。可通过本领域技术人员已知的标准方法和通过举例说明在附于下述实施例的实验部分中描述的标准方法测量这些系统的平均尺寸。颗粒的平均尺寸可主要受以下影响：共聚物的量和分子量，存在于本发明的纳米颗粒中目的产品(如果有)的性质和量(通常，所述组分的量和分子量越大，纳米颗粒的平均尺寸越大)，以及用于生产所述纳米颗粒的方法的一些参数(例如，搅拌速度等)。
当产品用于人或动物食物中根据国家或组织的食品法典委员会(Codex Alimentarius)(例如，联合国粮食和农业组织(FAO)或世界卫生组织(WHO))是安全的时，该产品被认为是“食品级”；因此，“食品级”产品是“适合用于其在食品中使用”的无毒性产品，所以两种表达是同义词并且在该描述中不区分地使用。
本文中使用的术语“聚(甲基乙烯基醚-共-马来酸酐)(PVM/MA)共聚物的半(C 1 -C 4 )烷基酯”涉及下式的结构：
Figure BPA0000181600080000111
其中R为C1-C4烷基，其中两个羧基中仅一个被酯化。
本文中使用的术语“纳米颗粒”是指由天然或合成聚合物形成的(在这种情况中，由PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的聚合所形成的)具有以下平均尺寸的固体聚合颗粒的胶体系统：小于1微米(μm)，通常为10至900纳米(nm)，优选50至500nm，更优选100至400nm，仍更优选120至160nm，仍更优选约120至160nm。除了其他事实以外，根据其制备方法，纳米颗粒可被再分为基质纳米球和核-壳型囊状纳米胶囊[11]。“基质纳米球”是由聚合三维网络所形成的基质形式；当纳米球装载有目的产品(例如，药物)时，所述目的产品可物理地和均匀地分散在所述三维网络中。本发明的基质纳米球的基质或三维网络包含PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯。“核-壳型囊状纳米胶囊”是由任选地包含目的产品并且由聚合壁或膜(称为“壳”)围绕的内腔(称为“核”)所形成的囊状系统，即，它们是展现出典型核-壳结构的纳米囊状系统，其中目的产品被限制于存储处或由聚合物壁或膜(“壳”)所围绕的腔(“核”)内。本领域技术人员已知核-壳型囊状纳米胶囊的核可仅包含赋形剂，可包含下文中所定义的任何目的产品，或者可包含赋形剂和下文中定义的所述目的产品二者。在这两种情况中，由于这些系统的大比表面，所以目的产品的分子可被捕获或吸附在纳米颗粒的表面中。
本文中使用的“目的产品”或“POI”是指易用于任何类型工业(例如，农业、化妆品、食品或制药工业)的任何化合物。实际上，易用于任何类型工业的任何化合物可以被认为是根据本发明的POI。根据本发明的POI的举例说明的非限制性实例包括小的或大的，水溶性或脂溶性，亲水性、疏水性或两亲性的，有机的或无机的化合物，诸如脂、核苷、核苷酸、油、寡核苷酸、肽、多核苷酸、蛋白质、小有机化学化合物等。POI可以是任何形式或状态的，例如液体、半固体或固体状态，即，POI可溶解或分散在水性介质或有机介质中，从而形成水性或有机、溶液或悬液(包括油性溶液或悬液)，或者，可替换地，POI可以是非溶解的或非分散的(例如，固体产品)。
在一个特定的实施方案中，POI是具有农业活性的化合物，即，易用于农业工业，例如控制害虫和病原体的植物检疫产品、植物生长促进剂，如除草剂(例如，草甘膦等)、杀虫剂(例如，λ-氯氟氰菊酯等)、杀真菌剂(例如，代森锰锌等)。
在另一个特定的实施方案中，POI为具有化妆品活性的化合物，即，用于增强人或动物身体的外观或气味的物质。化妆品包括皮肤护理霜、洗剂、粉、香水、唇膏、指甲油和趾甲油、眼妆和面妆、药巾、烫发、着色隐形眼镜、毛发颜料、发胶(hair spray)和毛发凝胶(hair gel)、除臭剂、洗手液、婴儿产品、浴油、泡沫浴、浴盐、黄油和许多其他类型产品。用于化妆品工业的IPO的举例说明的非限制性实例包括抗衰老产品(例如，类视黄醇)，抗痤疮产品(例如，红霉素、过氧化苯甲酰等)，面部护理产品(例如，面部清洁剂中的GHK铜等)，色素性化妆品(pigmentedcosmetic)(例如，用于胭脂、粉底、遮瑕、粉等中的颜色色素)，美容品(cosmetical)(例如，Co-Q10等)，个人护理产品(例如，香料在除臭剂中的水分控制释放，等)，遮光/防晒产品(例如，UV阻断剂)，牙清洁、牙膏或漂洗产品(例如，三氯生/杀细菌剂、香料、香味、抗口干活性物在口中的缓释，等)，洗发产品(例如，抗头皮屑/保湿活性物等)，香水(例如，香味颗粒等)，毛发用产品(例如，固定剂、容积毛发造型产品等)。
在另一个特定的实施方案中，POI为具有营养活性的化合物，即，易用于食品工业，例如叶酸，4-氨基苯甲酸，烟酸(niacin)或维生素B3，泛酸或维生素B5，单磷酸硫胺，焦磷酸硫胺，三磷酸硫胺，抗坏血酸，蝶酰聚谷氨酸，亚叶酸，尼克酸(nicotinic acid)，透明质酸，硫辛酸，对香豆酸，咖啡酸，A、D、E、K族的维生素及其衍生物，磷脂，类胡萝卜素(例如，胡萝卜素、番茄红素、叶黄素、辣椒红素、玉米黄质素等)，脂肪酸，Ω-3脂肪酸(例如，DHA、EPA等)，氨基酸(例如，异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸)，植物甾烷醇(phytostanol)或植物甾醇(phytosterol)(例如，谷甾醇、菜油甾醇、豆甾醇等)，多酚(槲皮素、芦丁、白藜芦醇、山奈酚，杨梅黄酮、异鼠李亭等)等。
在另一个特定的实施方案中，POI为具有治疗活性的化合物(即，当向对象施用时与其受体在作用位点相互作用并发挥某些作用的物质)；这种产品易用于制药工业。具有治疗作用的IPO的举例说明的非限制性实例包括抗体或其片段(细菌、真菌或病毒蛋白质或抗原)、细胞受体、凝血因子、细胞因子、酶、红细胞生成素、生长因子、激素、胰岛素、白细胞介素、干扰素、配体、核酸(例如，核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸、DNA、RNA等)、信号转导剂、小有机化合物、毒素等。在一个特定的实施方案中，POI包括镇痛(麻醉)剂(例如，可待因、吗啡等)、镇痛(非麻醉)剂(例如，乙酰水杨酸、氟芬那酸等)、抗脱发剂(例如，非那雄胺、米诺地尔等)、抗心绞痛剂(例如，阿替洛尔、尼卡地平等)、抗细菌剂(例如，阿莫西林、氨苄青霉素、阿奇霉素、头孢克洛、环丙沙星、新霉素、四环素等)、抗抑郁剂(例如，氟西汀、帕罗西汀等)、抗真菌剂(例如，异康唑、酮康唑等)、抗高血压剂(例如，贝那普利、卡托普利、卡维地洛、依那普利、氯沙坦、米诺地尔等)、抗炎剂(例如，尼氟灭酸、塞来昔布、布洛芬等)、抗肿瘤剂(例如，阿伦单抗、顺铂、多西他赛、曲妥珠单抗等)、解热剂(例如，醋氨酚、吲哚美辛等)、抗精神病剂(例如，利培酮等)、抗焦虑剂(例如，阿普唑伦、劳拉西泮等)、支气管扩张剂(例如，卡布特罗、肾上腺素等)、糖皮质激素(例如，布地奈德、泼尼松龙等)、免疫抑制剂(例如，阿仑珠单抗、他克莫司等)等。在又一个特定的实施方案中，所述POI选自乙酰水杨酸、α-心房利钠肽、精氨酸血管升压素、阿托品、奥格莫森、阿托伐他汀、
Figure BPA0000181600080000141
(贝伐单抗)、降钙素、绒毛膜促性腺激素、促肾上腺皮质激素、去氨加压素、地棘蛙素、
Figure BPA0000181600080000142
(西妥昔单抗)、艾塞那肽、
Figure BPA0000181600080000143
(曲妥珠单抗)、
Figure BPA0000181600080000144
(阿达木单抗)、
Figure BPA0000181600080000145
酮康唑、兰乐肽、促黄体素α、美托洛尔、米诺地尔、奈西立肽、奥曲肽、紫杉醇、对乙酰氨基酚、哌加他尼、重组促卵泡激素、重组生长因子、(英夫利昔单抗)、
Figure BPA0000181600080000147
(利妥昔单抗)、舍莫瑞林、促生长素、紫杉烷衍生物、泰素、醋酸特立帕肽、促甲状腺素、三氯生、尿促卵泡素、
Figure BPA0000181600080000148
(奥马珠单抗)，等。在另一个实施方案中，POI选自放线菌素D、阿苯达唑、醛固酮、阿普唑伦、胺碘酮、阿米替林、安普那韦、阿西马朵林、阿托伐他汀、布尼洛尔、丁螺环酮、喜树碱、卡马西平、卡维地洛、塞利洛尔、环孢素A、西米替丁、克霉唑、秋水仙碱、可的松、柔红霉素、异喹胍、地塞米松、地西泮、洋地黄毒苷、地高辛、地尔硫卓、多西他赛、多潘立酮、多柔比星、依法韦仑、表柔比星、红霉素、麦角胺、雌二醇、葡萄糖醛酸雌二醇、厄洛替尼、依托泊苷、苯妥英、芬太尼、非洛地平、吩噻嗪类、非索非那定、氟喹诺酮类、氟尿嘧啶、FK-506、庆大霉素、灰黄霉素、氢化可的松、伊马替尼、茚地那韦、伊曲康唑、伊维菌素、酮康唑、山奈酚、左氧氟沙星、利多卡因、洛哌丁胺、氯沙坦、洛伐他汀、甲苯达唑、甲泼尼龙、甲氨蝶呤、咪拉地尔、咪达唑仑、尼索地平、吗啡、那非那韦、尼卡地平、尼群地平、硝苯地平、昂丹司琼、紫杉醇、喷他佐辛、吡喹酮、泼尼松龙、泼尼松、槲皮素、奎尼丁、雷尼替丁、雷帕霉素、利福布汀、利福平、利托那韦、沙奎那韦、西罗莫司、磺胺甲二唑、他克莫司、他莫昔芬、他林洛尔、替尼泊苷、特非那丁、四环素、拓扑替康、曲安西龙、伐司朴达、维拉帕米、长春碱、长春新碱、长春地辛、佐匹克隆及其混合物。
在另一个特定的实施方案中，POI为赋形剂，即可以是用作组合物活性成分的介质或载体的液体、固体或半固体的惰性物质。充当赋形剂的POI的举例说明的非限制性实例为液体石蜡或熔融脂质诸如蜡、棉籽油、玉米油、氢化植物油、菜籽油、椰子油等。所述POI尤其用于生产核-壳型囊状纳米胶囊并且它们可发现于所述纳米胶囊的核中。
本文中使用的“挥发性溶剂”为在室温下容易汽化/蒸发的液体；挥发性溶剂通常具有高蒸汽压和比水更低的沸点。类似地，本文中使用的“非 挥发性溶剂”是指在室温下不容易蒸发的或蒸发非常缓慢的液体(例如，PG、PEG400、甘油)；非挥发性溶剂通常具有低蒸汽压和比水更高的沸点。
“水可混溶的”溶剂或液体为完全溶于水并且难于与水分开的溶剂或液体，例如，醇等。
本发明的纳米颗粒
在一个方面中，本发明涉及纳米颗粒，下文称为“本发明的纳米颗粒”，其选自：
a)包含基质的基质纳米球，所述基质包含聚(甲基乙烯基醚-共-马来酸酐)(PVM/MA)共聚物的半(C1-C4)烷基酯；和
b)包含核和壳的核-壳型囊状纳米胶囊，所述壳包含PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯。
术语“纳米颗粒”之前已经定义，其是指在该特定情况中由PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的聚合所形成的具有以下平均尺寸的固体聚合颗粒的胶体系统：小于1μm，通常为10至900nm，优选100至400nm，更优选120至160nm，仍更优选约130至140nm。除非另有所指，否则术语“纳米颗粒”包括基质纳米球和核-壳型囊状纳米胶囊。在这两种情况中，由于这些系统的大比表面，所以POI分子(如果存在)可被捕获或吸附于纳米颗粒的表面中。
在一个特定的实施方案中，本发明的纳米颗粒为包含基质的基质纳米球，所述基质包含PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯。在该实施方案中，目的产品可被捕获或吸附于纳米球内，或者可替换地，目的产品可被吸附在纳米球的表面上。
在另一个特定的实施方案中，本发明的纳米颗粒为包含核和壳的核-壳纳米囊状结构(纳米胶囊)，所述壳包含PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯。腔(核或存储处)可包含液体、半固体或固体形式的或者作为分子分散物的POI；根据所用的制备方法和原料，该存储处可以是亲脂性的或疏水性的。这尤其用于携带液体、半固体或固体状态形式(例如油、水不可混的液体、有机溶液或悬液)的POI，包括含有POI的油性溶液或悬液，含有POI的水性溶液或悬液，等。根据该实施方案，POI可以在纳米胶囊内，或者可替换地，其可被吸附在纳米胶囊的表面上。
在另一个特定的实施方案中，本发明提供了至少一个包含基质的基质纳米球与至少一个包含核和壳的核-壳型囊状纳米胶囊的组合，所述基质包含PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯，所述壳包含PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯。
PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯是已知产品或者可由在合适醇(例如，含有1至4个碳原子的醇)中打开PVM/MA共聚物的酸酐而生产。PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的举例说明的非限制性实例包括共用商标为
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ES的由ISP商品化的那些，例如
Figure BPA0000181600080000162
ES225(PVM/MA共聚物的单乙酯)、
Figure BPA0000181600080000163
ES335I(PVM/MA共聚物的异丙酯)和
Figure BPA0000181600080000164
ES425(PVM/MA共聚物的单丁酯)。PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯为水不溶性的并且可以在醇溶液中(例如，在乙醇溶液[50％(w/v)]中)提供。
PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯能够长时间与黏膜表面黏附，这提供了在应用位点的高停留时间和延长的药物释放。
鉴于一些短期口服毒性研究的结果(PVM/MA共聚物的单乙酯或单丁酯的LD50＞25.6g/kg)以及在亚慢性吸入研究中，PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯被认为是非毒性化合物并且不是眼刺激物或真皮刺激物。它们在人志愿者中测定时均不是皮肤刺激物、致敏剂或光敏剂。PVM/MA共聚物的单丁酯对基因毒性是阴性的。PVM/MA共聚物的单乙酯和单丁酯以中性形式在本用途实践中作为化妆品成分是安全的。事实上，PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯被认为是GRAS列出的材料共聚物(作为成膜剂或毛发固定剂(Cosmetic Ingredient Review)起作用)并且可根据欧盟化妆品指导(Cosmetics Directive of the European Union)总则用于在欧洲销售的化妆品和个人护理产品。PVM/MA共聚物的单丁酯用于气雾剂和泵式发胶、定型摩斯和定型液、眼妆、面妆、皮肤妆、霜以及洗剂。
在一个特定的实施方案中，所述PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯为PVM/MA共聚物的单乙酯或PVM/MA共聚物的单丁酯。
PVM/MA的半(C1-C4)烷基酯的分子量可在广泛范围内变化；在一个特定的实施方案中，PVM/MA的半(C1-C4)烷基酯的分子量为10至300kDa，优选50至250kDa，更优选90至150kDa。在一个具体的实施方案中，所述PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯为PVM/MA共聚物的单乙酯并且具有100至150kDa的分子量。在另一个具体的实施方案中，所述PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯为PVM/MA共聚物的单丁酯并且具有90至150kDa的分子量。
由于本发明的纳米颗粒的大比表面，目的产品的分子可被捕获或吸附于纳米颗粒的表面中。因此，本发明的纳米颗粒可有效地合并具有不同用途和应用的目的产品(例如，大的或小的、疏水性或亲水性的化合物)，从而它们可潜在地施用于不同的应用(例如，在制药、化妆品或农业组合物中，在食品中，等)。
因此，在一个特定的实施方案中，本发明的纳米颗粒还包含目的产品(POI)；在该情况中，本发明的纳米颗粒在本说明书中偶尔被认为是“本发明的经装载的纳米颗粒”。与所述POI有关的信息可见于上述部分(“定义”)中。本领域技术人员将理解，本发明的经装载的纳米颗粒可在相同纳米颗粒中合并一种或更多种目的产品(POI)，前提是所述POI彼此不相容。
在一个特定的实施方案中，所述POI为酮康唑、米诺地尔或三氯生，本发明的纳米颗粒为基质纳米球，其中所述POI被捕获或包封于纳米球内，或者可替换地，其被吸附在纳米球的表面上。
在另一个特定的实施方案中，所述POI为精油(诸如柠檬精油)，本发明的纳米颗粒为核-壳型囊状纳米胶囊，其中所述POI被捕获或包封于纳米球内，或者可替换地，其被吸附在纳米球的表面上。
“共聚物”：POI重量比在本发明的经装载的纳米颗粒中可在广泛范围内变化，其中“共聚物”是指由PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的聚合所形成的共聚物；然而，在一个特定的实施方案中，共聚物：POI重量比在本发明的经装载的纳米颗粒中可以为1：10-6至1：106，优选1：10-3至1：103，更优选1：0.03至1：0.5。
生产纳米颗粒的方法
在另一个方面中，本发明涉及一种用于生产包含基质的基质纳米球的方法，所述基质包含聚(甲基乙烯基醚-共-马来酸酐)(PVM/MA)共聚物的半(C1-C4)烷基酯(即，本发明的纳米颗粒的一个特定实施方案)，所述方法下文称为“本发明的方法[1]”，其包括使包含PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的有机溶液或悬液与水性介质相接触以形成所述基质纳米球。该本发明的方法[1]提出了“空的”本发明的纳米颗粒(即，没有目的产品(POI)的纳米颗粒)，特别是基质纳米球，其中所述基质包含PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯。
PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯是已知产品或者可由在醇中打开PVM/MA共聚物(例如，
Figure BPA0000181600080000181
AN)的酸酐而生产。在一个特定的实施方案中，PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯为PVM/MA共聚物的单乙酯、单异丙酯或丁酯。
有机溶剂可以是任何合适的有机溶剂，在其中PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯可以并非完全或部分溶解，优选可药用或可美容用有机溶剂。可在本发明的方法[1]的上下文内使用的有机溶剂的举例说明的非限制性实例包括醇和除了醇以外的非挥发性水可混溶的溶剂，以及其混合物。
本文中使用的术语“醇”是指在其中羟基官能团(-OH)与一般与其他碳原子或氢原子连接的碳原子相结合的任何有机化合物，其包括仅具有一个羟基的醇(例如，甲醇、乙醇、异丙醇等)和包含两个或更多个(多个)羟基的醇(例如，丙二醇(PG)、聚乙二醇(PEG)等)。甲醇、乙醇和异丙醇是挥发性醇，而PG和PEG是非挥发性醇(其可以以液体(PG)或作为取决于PEG的分子量(Mw)(例如，PEG6000、PEG10000)的固体存在)。可以使用固体溶剂(例如，PEG6000、PEG10000等)，例如以生产用于施用药物的固体药用形式，例如栓剂如直肠栓(包含例如解热药物)或阴道栓(suppository或ovule)(包含例如抗真菌剂等)，当包含聚合物的溶液或悬液与体液(例如，阴道液)相接触时将形成纳米颗粒。
在一个特定的实施方案中，有机溶剂为挥发性醇，例如乙醇。在另一个特定的实施方案中，有机溶剂为非挥发性醇，例如PG。在另一个特定的实施方案中，有机溶剂包含两种或更多种挥发性醇的混合物。在另一个特定的实施方案中，有机溶剂包含两种或更多种非挥发性醇的混合物。在另一个特定的实施方案中，有机溶剂包含至少一种挥发性醇和至少非挥发性醇的混合物，例如乙醇和PG的混合物。
或者，有机溶剂可以是除醇以外的非挥发性水可混溶的溶剂。除醇以外的非挥发性水可混溶的溶剂的举例说明的非限制性实例包括聚氧甘油酯(例如，辛酰己酰聚氧甘油酯)、脂肪酸衍生物(例如，其PG或PEG衍生物)，等。术语“辛酰己酰聚氧甘油酯”是指基于脂质的表面活性剂。一个示例性辛酰己酰聚氧甘油酯为由Gattefosse以销售的PEG-8辛酸/癸酸甘油酯。辛酰己酰聚氧甘油酯也被称为“辛酰己酰聚乙二醇甘油酯”。
所述PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯在共聚物有机溶液或悬液中的浓度可在广泛范围内变化；然而，在一个特定的实施方案中，PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯在所述共聚物有机溶液或悬液中的浓度为0.01％至50％(w/v)，优选0.1％至30％(w/v)，更优选1％至15％(w/v)，仍更优选2％至10％(w/v)；在一个特定的实施方案中，PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯在共聚物有机溶液或悬液中的浓度为约5％(w/v)。
可通过使所述产品溶解或分散于有机溶剂中来制备包含PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的有机溶液或悬液。在一个特定的实施方案中，有机溶剂为醇，例如简单醇如挥发性简单醇(例如，乙醇等)或多元醇如非挥发性多元醇(例如，PG)。在另一个特定的实施方案中，有机溶剂为除醇以外的非挥发性水可混溶的溶剂如聚氧甘油酯(例如，辛酰己酰聚乙二醇甘油酯)或脂肪酸衍生物。
在一个特定的实施方案中，溶剂为醇；因此，如果PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯已经是浓缩醇溶液形式，那么期望浓度的包含PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的稀释醇溶液可简单地通过将所需量的醇添加至浓缩溶液中以实现期望浓度来进行制备。这是例如商品ES225(PVM/MA共聚物的单乙酯)、
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ES335I(PVM/MA共聚物的异丙酯)和
Figure BPA0000181600080000193
ES425(PVM/MA共聚物的单丁酯)的情况，其通常以50％(w/v)浓度的所述酯的醇溶液提供；因此，为了实现期望浓度(例如，5％(w/v))，可通过添加所需量的纯乙醇来稀释商品溶液。
根据本发明的方法[1]，使包含PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的有机溶液或悬液与充当水可混溶的聚合物非溶剂的水性介质相接触，以形成纳米颗粒。在一个特定的实施方案中，水性介质包含水，优选蒸馏水或双蒸水。该步骤在合适的温度下进行，通常为1℃至100℃，优选10℃至40℃，更优选15℃至25℃。因此，必要时，使所获得的纳米颗粒的悬液经受合适的处理以清除有机溶剂。有机溶剂的清除根据待除去溶剂的性质可通过本领域技术人员已知的任何常规方法(包括例如蒸发等)来进行。在一个特定的实施方案中，当有机溶剂为乙醇时，优选地在减压下使用旋转蒸发仪蒸发纳米颗粒悬液以清除所述醇。
或者，可通过去除包含PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯和水可混溶的醇(优选挥发性水可混溶的醇)的水醇溶液或悬液中的溶剂来生产纳米颗粒(特别是基质纳米球)，其中水的量低于形成纳米颗粒所需水的量；在该实施方案中，一旦去除部分醇，则发生纳米颗粒的形成。本发明人进行的测定显示，在通过蒸发去除部分乙醇后向人皮肤(约37℃)表面施用包含PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯和乙醇的水醇溶液(其中水的量低于形成纳米颗粒所需水的量)导致纳米颗粒在表面上形成，如通过初始透明溶液转化成不透明悬液所示，这表明了纳米颗粒在皮肤表面的形成。
因此，在一个特定的实施方案中，本发明的方法[1]包括(i)使包含PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的有机溶液或悬液(其中所述有机溶液或悬液包含挥发性水可混溶的溶剂，优选挥发性水可混溶的醇)与水性介质相接触，以提供包含PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的水-有机溶液或悬液，其中水性介质的量低于形成纳米颗粒所需水性介质的量，以及(ii)去除至少一部分所述溶剂以形成包含基质的基质纳米球，其中所述基质包含PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯。
形成纳米颗粒所需的水性介质的量除了其他方面以外取决于所述PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯在包含所述共聚物的水-有机溶液或悬液中的浓度；然而，在一个特定的实施方案中，水性介质(水)：醇(乙醇)的比率为0.01：1(v/v)至1000：1(v/v)，优选0.5：1(v/v)至10：1(v/v)，更优选约2：1(v/v)。在一个具体实施方案中，在将10mL水添加至在乙醇中包含5％(w/v)的PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的醇溶液后形成纳米颗粒[与此相反，如果5mL水添加至10mL的相同醇共聚物溶液，那么不会形成纳米颗粒]。
在介质(所述介质包含挥发性水可混溶的溶剂，优选挥发性水可混溶的醇)中包含PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯和水性介质(其中水性介质的量低于形成纳米颗粒所需水性介质的量)的水-有机溶液或悬液构成了本发明的另外一个方面。在除去溶剂之后，所述水-有机溶液或悬液可用于形成纳米颗粒，主要是基质纳米球，其中所述基质包含PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯。在一个特定的实施方案中，溶剂为挥发性水可混溶的醇(例如，乙醇)，水性介质包含水；在该实施方案中，所得水-有机溶液或悬液特别地用于向对象的皮肤或毛发表面施用，其中在蒸发部分乙醇后纳米颗粒在皮肤或毛发的表面上形成。
或者，可不需要使所得纳米颗粒悬液进行去除有机溶剂的处理而原位形成所述纳米颗粒。对于该目的而言，通过以下来制备包含PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的共聚物有机溶液或悬液、优选其中共聚物溶剂为非挥发性水可混溶的溶剂(例如非挥发性水可混溶的醇如PG或者除醇以外的非挥发性水可混溶的溶剂)的有机溶液或悬液：使所述PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯与所述有机溶剂混合，然后使包含共聚物的所述有机溶液或悬液与水性介质如包含水的介质(例如水，优选双蒸水)或者体液(例如，胃肠液等)混合，从而直接形成原位自组装的纳米颗粒(SANP)。在该实施方案中，因为与溶剂蒸发方法相比非挥发性水可混溶的溶剂在SANP中的最小残余量而没有必要去除溶剂。举例说明，5％(w/v)的PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯如ES(其中
Figure BPA0000181600080000212
ES是指ES225、ES335I或
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ES425)在PG中的溶液可通过使10g市售
Figure BPA0000181600080000216
ES的乙醇溶液(50％w/v)溶解于100ml PG中来进行制备；这意味着中5％
Figure BPA0000181600080000217
ES的PG溶液包含5％(v/v)乙醇。在纳米颗粒形成时，1ml5％
Figure BPA0000181600080000218
ES的PG溶液与10ml水混合，从而乙醇的浓度为0.225％(v/v)，即，与去除乙醇(例如，通过蒸发)前根据之前所公开溶剂去除方法获得的纳米颗粒悬液中乙醇的浓度(其中乙醇的浓度可以为约66.66％(v/v))相比的乙醇的最低终浓度。制剂中的低乙醇含量避免使用高乙醇量以获得共聚物溶液或悬液，从而可以与可接受浓度范围的乙醇口服施用(增强药物的口服生物利用度)或颊黏膜途径施用。
根据该实施方案，如果包含共聚物的有机溶液或悬液为这样的溶液或悬液，其中溶剂为非挥发性水可混溶的多元醇(例如，PG)，并且例如通过使得所述溶液或悬液与体液相接触的合适途径(例如，通过口服、肠胃外、直肠、阴道等)向对象(例如，动物，其包括人)施用所述包含PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的非挥发性多元醇溶液或悬液，那么通过PVM/MA共聚物链的半(C1-C4)烷基酯与包含水性介质的所述合适体液接触的自组装来原位形成纳米颗粒。
PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯在包含所述共聚物的有机(非挥发性水可混溶的溶剂)溶液或悬液中的浓度可在广泛范围内变化；然而，在一个特定的实施方案中，通过PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的共聚合形成的共聚物在所述共聚物有机溶液或悬液中的浓度为0.01％至50％(w/v)，优选0.1％至30％(w/v)，更优选1％至15％(w/v)，仍更优选2％至10％(w/v)；在一个具体的实施方案中，PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯在共聚物有机溶液中的浓度为约5％(w/v)。
在另一个方面中，本发明涉及一种用于生产包含目的产品(POI)的基质纳米球的方法，其中所述基质纳米球包含基质，所述基质包含聚(甲基乙烯基醚-共-马来酸酐)(PVM/MA)共聚物的半(C1-C4)烷基酯(即，本发明的纳米颗粒的一个特定实施方案)，所述方法下文称为“本发明的 方法[2]”，其包括：
[A]使包含所述POI和所述PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的醇或水醇、溶液或悬液与水性介质相接触；或者，可替换地，
[B]使包含所述POI和所述PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的醇溶液或悬液与水性介质相接触。
本发明的方法[2]提供了本发明的“经装载的”的纳米颗粒，即装载有至少一种目的产品(POI)的基质纳米球。
根据本发明的方法[2]的选项[A]，包含POI和PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的醇或水醇、溶液或悬液与水性介质相接触。当POI为亲水性化合物或两亲性化合物(在这种情况下，应调节水的百分比)时，该选项[A]尤其有用。简要地，包含POI和PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的醇或水醇、溶液或悬液可通过本领域技术人员已知的常规方式来获得，例如，通过所述POI的醇溶液或悬液(通过使POI溶解或悬浮于合适醇中来获得)或者可替换地所述POI的水溶液或悬液(通过使POI溶解或悬浮于水性介质(例如，包含水的介质，优选水)中来获得)与所述PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的醇溶液在合适条件下混合以获得所述包含POI和PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的醇或水醇、溶液或悬液。所述操作条件的举例说明的非限制性实例包括在室温下搅拌合适的时间，例如1至30分钟，通常少于15分钟，优选约5分钟。
POI的详细情况之前已经在“定义”部分中提及。PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的详细情况以及PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的醇溶液的详细情况(例如，醇、浓度等)之前已经在关于本发明的方法[1]中提及。在一个特定的实施方案中，存在于醇溶液中的醇为乙醇或多元醇如PG。
根据本发明的方法[2]的选项[A]，包含POI和PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的醇或水醇、溶液或悬液与水性介质(即，包含水的介质，其充当水可混溶的聚合物非溶剂)接触，以形成装载有所述POI的纳米颗粒(“装载POI的纳米颗粒”)。共聚物溶剂(醇，例如乙醇)和非溶剂(例如，水)之间的体积比[溶剂：非溶剂]可在广泛范围内变化，通常为1：0.001(v/v)至1：5000(v/v)，优选1：0.5(v/v)至1：1(v/v)。然而，如果包含POI和PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的醇或水醇、溶液或悬液与“不足”的水性介质(即，其中水的量低于形成纳米颗粒所需水的量)相接触，那么也可通过去除至少部分醇来形成装载POI的纳米颗粒，例如与本发明的方法[1]的一个特定实施方案有关的之前提及的；在该情况中，醇应优选为挥发性水可混溶的醇，例如乙醇。该实施方案可用于制备通过其表面施用递送POI的组合物，例如化妆品或药物组合物。
因此，在一个特定的实施方案中，本发明的方法[2]包括(i)使包含POI和PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的醇或水醇、溶液或悬液(其中所述溶液或悬液包含挥发性水可混溶的醇)与水性介质接触以形成包含PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的水-醇溶液或悬液，其中水性介质的量低于形成纳米颗粒所需水性介质的量；以及(ii)除去至少部分所述醇以形成包含基质的基质纳米球，其中所述基质包含PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯。
在介质中包含PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯和POI的水醇溶液或悬液(所述介质包含挥发性水可混溶的醇和水性介质，其中水性介质的量低于形成纳米颗粒所需水性介质的量)构成了本发明的另一方面。在去除醇之后，所述水-有机溶液或悬液可用于生产装载POI的纳米颗粒，主要是基质纳米球，其中所述基质包含PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯。在一个特定的实施方案中，醇为乙醇并且水性介质包含水；在该实施方案中，所得水醇溶液或悬液特别地用于其向对象的皮肤或毛发表面施用，其中在蒸发部分乙醇后纳米颗粒在皮肤或毛发表面上形成。
在合适的温度下进行使包含所述POI和所述PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的所述醇或水醇溶液或悬液与水性介质接触的步骤，所述温度通常为1℃至100℃，优选10℃至40℃，更优选15℃至25℃。随后，需要时，使如此获得的装载POI的纳米颗粒的悬液经受合适处理以除去醇，以便获得装载POI的纳米颗粒的水性悬液。可通过本领域技术人员已知的常规方法(包括例如蒸发等)进行醇的除去；在一个特定的实施方案中，优选地在减压下使用旋转蒸发仪蒸发装载POI的纳米颗粒悬液以除去乙醇。
根据本发明的方法[2]的选项[B]，包含POI和PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的醇溶液或悬液与水性介质相接触。当POI为疏水性或两亲性化合物时，该选项[B]尤其有用。简要地，通过以下获得包含POI和PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的醇悬液：使所述POI与所述PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的醇溶液在合适条件下混合以获得所述包含POI和PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的醇悬液。所述操作条件的举例说明的非限制性实例包括在室温下搅拌合适的时间，例如1至30分钟。
POI的详细情况之前已经在“定义”部分中提及。PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的详细情况以及PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的醇溶液的详细情况(例如，醇、浓度等)之前已经在关于本发明的方法[1]中提及。在一个特定的实施方案中，存在于醇溶液中的醇为乙醇或多元醇如丙二醇(PG)。
根据本发明的方法[2]的选项[B]，包含POI和PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的醇悬液与水性介质(即，包含水的介质，其充当水可混溶的聚合物非溶剂)接触，以形成装载有所述POI的纳米颗粒(“装载POI的纳米颗粒”)。在一个特定的实施方案中，水性介质包含水，优选蒸馏水或双蒸水。共聚物溶剂(醇，例如乙醇或PG)和非溶剂(例如，水)之间的体积比[溶剂：非溶剂]可在广泛范围内变化，通常为1：0.001(v/v)至1：5000(v/v)，优选1：0.5(v/v)至1：1(v/v)。在合适的温度下进行使包含所述POI和所述PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的所述醇溶液或悬液与水性介质相接触的步骤，所述温度通常为1℃至100℃，优选10℃至40℃，更优选15℃至25℃。随后，需要时，使如此获得的装载POI的纳米颗粒的悬液经受合适处理以除去醇，以便获得装载POI的纳米颗粒的水性悬液，如之前已经在本发明的方法[2]的选项[A]中提及的。当溶剂为PG时，因为其可以通过口服途径用于人而不必要将其除去。
或者，由于PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯可能形成原位自组装的纳米颗粒(SANP)，本发明提供了另一种用于生产包含目的产品(POI)的基质纳米球的方法，其中所述基质纳米球包含基质，所述基质包含聚(甲基乙烯基醚-共-马来酸酐)(PVM/MA)共聚物的半(C1-C4)烷基酯(即，本发明的纳米颗粒的一个特定实施方案)，所述方法下文称为“本发明的 方法[3]”，其包括使包含所述POI和所述PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的有机溶液或悬液与水性介质接触，其中所述有机溶液或悬液包含非挥发性水可混溶的溶剂。
本发明的方法[3]提供了本发明的“经装载的”纳米颗粒，即，装载至少一种POI的原位自组装基质纳米球。
根据本发明的方法[3]，使在非挥发性水可混溶的溶剂中包含POI和PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的有机溶液或悬液与水性介质接触。当POI为疏水性、亲水性或两亲性化合物时，该方法尤其有用。简要地，通过以下获得在非挥发性水可混溶的溶剂中包含POI和PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的有机溶液或悬液：使所述POI的溶液或悬液(可通过溶解或分散于非挥发性水可混溶的溶剂中来获得)与所述PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯在非挥发性水可混溶的溶剂中的溶液或悬液在合适条件下混合以获得所述在非挥发性水可混溶的溶剂中包含POI和PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的溶液或悬液。所述操作条件的举例说明的非限制性实例包括在室温下搅拌合适的时间，例如1至30分钟，通常少于15分钟，优选约5分钟。尽管所述溶液或悬液的溶剂(POI的溶液或悬液和PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的溶液或悬液)可以不同，但是实际上优选地是，这两种溶液或悬液的溶剂是相同的；在一个特定的实施方案中，所述溶剂为多元醇如PG。
POI的详细情况之前已经在“定义”部分中提及。PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的详细情况之前已经在关于本发明的方法[1]中提及。
如上所述，溶剂可以是任何溶剂，例如非挥发性水可混溶的溶剂，在其中PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯可被完全或部分溶解，所述溶剂优选可药用或可美容用非挥发性水可混溶的溶剂。可在本发明的方法[3]的上下文内使用的非挥发性水可混溶的溶剂的举例说明的非限制性实例包括非挥发性水可混溶的醇(例如，PG、PEG等)、除醇以外的非挥发性水可混溶的溶剂如聚氧甘油酯(例如，辛酰己酰聚氧甘油酯(
Figure BPA0000181600080000251
))、脂肪酸衍生物(例如，其PG或PEG衍生物等)、及其任何混合物，例如两种或更多种非挥发性水可混溶的醇的混合物、两种或更多种除醇以外的非挥发性水可混溶的溶剂的混合物、或者至少一种非挥发性水可混溶的醇与至少一种除醇以外的非挥发性水可混溶的溶剂的混合物。
所述PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯在包含所述POI和所述非挥发性水可混溶的溶剂的溶液或悬液中的浓度可在广泛范围内变化；然而，在一个特定的实施方案中，PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯在所述溶液或悬液中的浓度为0.01％至50％(w/v)、优选0.1％至30％(w/v)、更优选1％至15％(w/v)、仍更优选2％至10％(w/v)；在一个具体的实施方案中，PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯在共聚物有机溶液或悬液中的浓度为约5％(w/v)。
根据本发明的方法[3]，在非挥发性水可混溶的溶剂中包含POI和PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的溶液或悬液与水性介质(即，包含水的介质)接触以通过共聚物链的原位自组装来形成装载有所述POI的纳米颗粒(“装载POI的纳米颗粒”)。在一个特定的实施方案中，水性介质包含水，优选蒸馏水或双蒸水。该步骤在合适的温度下进行，通常为1℃至100℃，优选10℃至40℃，更优选15℃至25℃。
在另一个方面中，本发明涉及一种用于生产包含目的产品(POI)的核-壳型囊状纳米胶囊的方法，其中所述核-壳型囊状纳米胶囊包含核和壳，其中所述壳包含PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯(即，本发明的纳米颗粒的一个特定实施方案)，所述方法下文称为“本发明的方法[4]”，其包括使包含所述POI和所述PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的溶液或悬液与水性介质接触。在一个特定的实施方案中，在表面活性剂的存在下使包含POI和PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的溶液或悬液与水性介质接触。
本发明的方法[4]提供了本发明的“经装载的”纳米颗粒，即，装载有至少一种POI的核-壳型囊状纳米胶囊。POI可以在纳米胶囊内或被吸附在壳纳米胶囊的表面上。POI可以是液体、半固体或固体状态。在一个特定的实施方案中，所述POI为油。在另一个特定的实施方案中，所述POI被溶解或分散于水不可混的溶剂中。在另一个特定的实施方案中，所述POI为油性溶液或悬液形式或者水不可混的溶剂中的溶液或分散体形式的药物或化妆品。
根据本发明的方法[4]，在表面活性剂的存在下使包含POI和PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的溶液或悬液与水性介质接触。当POI为疏水性、亲水性或两亲性化合物时，该方法尤其有用。
简要地，通过以下获得包含POI和PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的溶液或悬液：使(i)POI、(ii)醇和(iii)所述PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的醇溶液在合适的条件下混合以获得所述包含POI和PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的溶液或悬液。
在一个特定的实施方案中，待与POI和所述PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的醇溶液二者混合的醇可以相同或者优选地与形成所述PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的醇溶液的醇不同。所述醇的举例说明的非限制性实例实际上包括任何醇，优选可药用醇或可美容用醇，例如，简单醇(如乙醇等)或多元醇(例如，PG、PEG等)，或者简单醇、多元醇或至少一种简单醇和至少一种多元醇二者的任何混合物。醇的混合物的使用除了其他特性以外可方便地取决于PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯在包含POI的液相(例如，油，POI在水不可混的溶剂中的溶液或悬液，等)和醇(或其混合物)的混合物中的溶解度。在一个特定的实施方案中，待与POI和所述PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的醇溶液二者混合的醇是乙醇、PG等，优选PG(当包含POI的液相在PG中为高溶解的时)或者乙醇和PG的混合物，形成所述PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的醇溶液的醇为简单醇，例如乙醇等。
获得包含POI和PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的溶液或悬液的操作条件的举例说明的非限制性实例包括在室温下搅拌合适的时间，例如1至30分钟，通常少于15分钟，优选约5分钟。
POI：共聚物重量比(其中“共聚物”是指共聚物的醇溶液或悬液)可在广泛范围内变化；然而，在一个特定的实施方案中，所述POI：共聚物比率按重量计为0.001：1至100：1，优选0.01：1至1：1，更优选0.02：1至0.05：1。
POI的详细情况之前已经在“定义”部分中提及；然而，在该情况中，POI应是水不可混的液体中溶液或悬液的形式。因此，在一个特定的实施方案中，POI是油，例如精油。在另一个特定的实施方案中，POI溶解或分散于水不可混的溶剂(例如油)中，从而形成油性溶液或悬液等。因此，实际上在本发明的方法[4]的上下文内可使用能够溶解或分散于水不可混的液体中的任何POI。在一个具体的实施方案中，所述POI为油性溶液或悬液形式或者水不可混的溶剂中的溶液或分散体形式的药物或化妆品。
PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的详细情况以及PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的醇溶液的详细情况(例如，醇、浓度等)已经在关于本发明的方法[1]中提及。在一个特定的实施方案中，存在于所述PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的醇溶液中的醇为乙醇，待与POI和与所述PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的醇溶液混合的醇为多元醇，优选PG。
根据本发明的方法[4]，包含POI和PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的水不可混的溶液或悬液(例如，油性溶液或悬液)与水性介质(即，包含水的介质，非溶剂)任选地在表面活性剂的存在下接触，以形成装载有所述POI的核-壳型囊状纳米胶囊(“装载POI的核-壳型囊状纳米胶囊”)。在一个特定的实施方案中，水性介质包含水，优选蒸馏水或双蒸水。(包含POI和共聚物的醇溶液或悬液)：水相的体积比可在广泛范围内变化，例如1：500至1：1000(v/v)，优选1：5至1：10。
尽管使用表面活性剂以用于生产由本发明所提供核壳纳米胶囊的不是必需的，但是实际上使用表面活性剂(例如，亲水性、疏水性或其混合物)以获得合适HLB是有意义的。可在本发明的上下文内使用的表面活性剂的举例说明的非限制性实例包括非离子表面活性剂，例如聚山梨酯(即，衍生自采用脂肪酸(例如，月桂酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸等)酯化的peg化脱水山梨糖醇的油性液体；简单(非PEG化)脱水山梨糖醇与脂肪酸的酯通常被称为名称“Span”)、脱水山梨糖醇单月桂酸酯的聚氧乙烯衍生物(
Figure BPA0000181600080000281
20)、脱水山梨糖醇油酸酯的聚氧乙烯衍生物(80)等，阴离子表面活性剂例如十二烷基硫酸钠(SDS)等，由BASF以
Figure BPA0000181600080000283
销售的基于环氧乙烷和环氧丙烷的嵌段共聚物，聚乙烯醇，等。在一个特定的实施方案中，表面活性剂为TPGS(与PEG1000酯化的α-生育酚琥珀酸酯)。表面活性剂的量可在广泛范围内变化；然而，在一个特定的实施方案中，表面活性剂的浓度为0.001％至50％(w/v)、优选0.01％至10％(w/v)、更优选0.05％至5％(w/v)。
另外，(包含POI和共聚物的醇溶液或悬液)：水相的体积比可在广泛范围内变化，例如1：500至1：1000(v/v)，优选1：5至1：10。
该步骤在合适的温度下进行，通常为1℃至100℃，优选15℃至50℃。
如果期望，本发明的纳米颗粒(装载有POI的那些(装载POI的纳米颗粒)和没有装载的那些(“空的”纳米颗粒)二者)可以掺入抗氧化剂(例如，抗坏血酸(维生素C)等)至其制剂中以用于增加其与温度和氧化相关的稳定性。在这种情况中，所述抗氧化剂可以与POI(在适当情况下)共包封或在本发明的纳米颗粒的涂层中；为此，所述本发明的方法[1]至[4]将合适地适合于在纳米颗粒的制剂中合并抗氧化剂，例如，通过将抗氧化剂添加至用于生产纳米颗粒的水性介质中。
另外，如果期望，所述本发明的方法[1]、[2]、[3]和[4]可包括干燥步骤，用于干燥包含如此形成的纳米颗粒的悬液，以获得本发明的纳米颗粒，即，粉末形式的装载POI的纳米颗粒和“空的”纳米颗粒二者。所述纳米颗粒呈现的该形式有助于其稳定性并且还特别地用于其在固体食品(例如面粉、面包、糕点产品、谷物、奶粉等)中以及在化妆品和/或药物组合物和产品中的最终应用。
实际上任何适合用于干燥包含纳米颗粒的悬液的常规技术或方法可用于进行该干燥步骤；然而，在一个特定的实施方案中，通过喷雾干燥或通过冷冻干燥来进行包含纳米颗粒的悬液的干燥。通常通过将所述纳米颗粒的合适保护剂如糖(例如，乳糖、海藻糖、甘露醇、蔗糖、麦芽糊精、葡萄糖、山梨醇、麦芽糖等，及其混合物)添加至纳米颗粒的悬液中来进行该处理。所述保护剂保护本发明的纳米颗粒在干燥过程期间免受热降解和氧化。
“PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯：糖”重量比可在广泛范围内变化；然而，在一个特定的实施方案中，按重量计“PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯：糖”为1至1000，优选约1：1～5。
同样地，在一个特定的实施方案中，包含糖的溶液可还包含抗氧化剂，例如抗坏血酸(维生素C)等；在该情况中，按重量计“PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯：糖：抗氧化剂”比率可以是1：0.01～1000：0.001～100，优选约1：5：0.2。
如上所述，本领域技术人员应理解，本发明的经装载的纳米颗粒可在相同纳米颗粒中合并一种或更多种POI，前提是所述POI彼此不相容。为此，方法[1]、[2]、[3]和[4]将被适当地修改以在包含PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的相同醇(或油性)溶液中或者在包含PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的相同水醇溶液或悬液中或者可替换地在不同制备物中合并POI。
根据本发明的方法[1]、[2]、[3]和[4]获得的本发明的纳米颗粒构成了本发明的另一方面。
应用
本发明的纳米颗粒具有许多特性，使得它们作为用于将目的产品递送至不同表面(例如，颊、胃肠道、毛发、鼻、口、直肠、皮肤、阴道等)的系统潜在地用于许多工业，例如，在制药、化妆品、农业或食品工业中。
本发明的纳米颗粒的所述特性的举例说明的非限制性实例包括高黏膜生物黏附、水性介质中高长期稳定性、目的产品(例如小的或大的，亲水性、疏水性或两亲性的化合物)的高封装效率、油的高封装效率、和/或在疏水性化合物的水中溶解度的增强。
在一个特定的实施方案中，本发明的纳米颗粒使得能够在农业、化妆品、食品或药物组合物中合并POI。
本发明的纳米颗粒可以以悬液(优选地在水性介质中)形式存在，或者可替换地，它们可以以干燥粉末形式存在，从而在稳定条件下维持POI并且使得其能够长期保存(特别地，对于其在固体食品制备物中的合并而言)。
因此，在另一个方面中，本发明涉及一种包含至少一种本发明的纳米颗粒和可农业用、可化妆品用或可药用载体或者适合用于食品的载体的组合物，下文称为“本发明的组合物”。
在一个特定的实施方案中，本发明的纳米颗粒为本发明的“空的”纳米颗粒，即没有POI的本发明的纳米颗粒，例如(i)包含基质的基质纳米球，所述基质包含PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯，(ii)包含核和壳的核-壳型囊状纳米胶囊，所述壳包含PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯，或者(iii)(i)和(ii)的组合。
在另一个特定的实施方案中，本发明的纳米颗粒为本发明的“经装载的”纳米颗粒，即装载有POI的本发明的纳米颗粒，例如(i)包含POI和基质的基质纳米球，所述基质包含PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯，(ii)包含核中的POI和壳的核-壳型囊状纳米胶囊，所述壳包含PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯，或者(iii)(i)和(ii)的组合。在一个特定的实施方案中，所述POI为具有农业、化妆品、营养和/或治疗活性的POI。所述POI的详细情况在“定义”部分中已经提及。
在另一个特定的实施方案中，本发明的组合物为农业组合物；为此，所述组合物包含本发明的“经装载的”纳米颗粒，所述纳米颗粒含有易用于农业领域的POI和可农业用载体，所述POI在最宽泛的含义中例如有用于控制害虫和病原体的植物检疫产品、植物生长促进剂等，例如除草剂(草甘膦等)、杀虫剂(例如，λ-氯氟氰菊酯等)、杀真菌剂(例如，代森锰锌)等，所述载体包含一种或更多种适合用于其应用的赋形剂；农业组合物可以通过使用本领域技术人员已知的载体以凝胶、悬液等形式配制。
在另一个特定的实施方案中，本发明的组合物是化妆品组合物；为此，所述组合物包含本发明的“空的”纳米颗粒，例如，用于毛发造型产品如毛发固定剂、定型等的空纳米颗粒，或者包含POI或其混合物和可美容用载体的本发明的“经装载的”纳米颗粒，所述POI具有美容活性或易于用于美容目的，所述载体包含一种或更多种适合用于其通过合适途径(例如通过表面途径)施用的赋形剂；化妆品组合物可以以以下形式配制：皮肤护理霜、洗剂、粉、香水、唇膏、指甲油和趾甲油、眼妆和面妆、药巾、烫发、着色隐形眼镜、毛发颜色、发胶、除臭剂、洗手液、婴儿产品、浴油、泡沫浴、浴盐、混悬剂、黄油和许多其他类型产品。适合用于配制化妆品组合物的赋形剂以及生产所述化妆品组合物的信息可见于OctavioDíez Sales的书籍“Manual de Cosmetología”第1版，1998，EditorialVideocinco，S.A.中。在化妆品工业中所用POI的举例说明的非限制性实例包括已经在“定义”部分提及的产品。
在另一个特定的实施方案中，本发明的组合物为食品组合物，例如固体、液体或半固体食品制备物；为此，所述组合物包含含有具有营养活性的POI和用于食品的载体的本发明的“经装载的”纳米颗粒。或者，本发明的组合物可掺入食品中；因此，在另一个方面中，本发明涉及包含本发明组合物的食品，即，包含本发明的“经装载的”纳米颗粒的组合物，所述纳米颗粒包含具有营养活性的POI和用于食品的载体。食品可以以液体、半固体或固体形式存在。可用本发明的组合物富集或加强的食品的举例说明性实例包括牛奶及其衍生物(酸奶、奶酪、凝乳等)、果汁、果酱、烘烤和糕点产品、发酵肉、调味酱等。类似地，本发明的组合物可掺入动物食品产品(例如饲料)中。
在另一个特定实施方案中，本发明的组合物为药物组合物；为此，所述组合物包含本发明的“经装载的”纳米颗粒，其含有POI和可药用载体，所述POI具有治疗活性或易以治疗目使用，所述载体包含一种或更多种赋形剂或媒介物。
存在于本发明的“经装载的”纳米颗粒中的POI可被捕获或包封于纳米颗粒(即，纳米球或纳米胶囊)内，或者可替换地，目的产品可被吸附于纳米颗粒的表面上。
药物组合物的实例包括液体、固体或半固体组合物。
药物组合物将包含用于每种制剂的合适赋形剂并且将由本领域技术人员已知的方法常规制备。将根据经选择的药物剂型来选择赋形剂。药物或其制备物的不同药物剂型的综述见于C.Faulí i Trillo的书籍“Tratadode Farmacia Galénica”第10版，1993，Luzán5，S.A.de Ediciones中。
掺入本发明的“经装载的”纳米颗粒中POI的比例可在广泛范围内变化；然而，在一个特定的实施方案中，聚合物：POI的重量/重量比率为1：10-6至1：106，优选1：10-3至1：103，更优选1：0.03至1：0.5。然而，合适的比例将取决于所掺入POI的各个情况。
待向有经POI治疗需要的对象施用本发明的“经装载的”纳米颗粒的剂量可在广泛范围内变化，除了其他特性以外将取决于POI的性质、其活性或效能、每纳米颗粒的POI的量，等；仅通过举例说明性目的，待向对象施用的“经装载的”纳米颗粒的剂量可以为例如每kg体重约0.01至约10mg，优选每kg体重0.1至2mg。
在一个特定的实施方案中，所述药物组合物配制为适合用于通过任何合适途径(例如，通过颊、齿、鼻、眼、口、肠胃外、直肠、表面或阴道途径)施用其的药物剂型。所述药物剂型的举例说明的非限制性实例包括固体(例如，软或硬明胶和非明胶胶囊、黏附膜、牙黏合剂parches、栓剂、片剂、胶囊剂、微米颗粒等)、半固体(例如，霜、凝胶、洗液、膏等)、液体(例如，溶液、悬液等)。在一个优选的实施方案中，由于本发明的纳米颗粒的生物黏附特性，所以以用于其通过进入黏膜的途径施用的组合物形式来配制药物组合物。
在一个具体的实施方案中，药物组合物配制为适合用于其通过直肠途径(栓剂)或通过阴道途径(卵状小体)施用的药物形式；如果期望，在该实施方案中，当包含聚合物的溶液或悬液与体液(例如，阴道液)接触时可生产纳米颗粒。
在另一个特定的实施方案中，以干燥粉末的形式制备药物组合物，例如其作为冷冻干燥产物与冷冻保护剂一起在使用之前通过与重构剂混合进行重构。
在一个特定的实施方案中，本发明提供了药物组合物，其包含：
Figure BPA0000181600080000321
本发明的“经装载的”纳米颗粒(特别地，装载有POI的那些纳米颗粒，其中所述POI为药物)可用于治疗疾病。将在待治疗的疾病的功能方面选择药物。因此，在另一个方面中，本发明涉及本发明的装载有POI的纳米颗粒(其中所述POI为药物)在制备用于治疗疾病的药物中的用途，或者可替换地，本发明涉及用作药物或用于治疗疾病的本发明的装载有POI的纳米颗粒(其中所述POI为药物)。
在一个特定的实施方案中，药物为米诺地尔，因此，本发明涉及本发明的装载有米诺地尔的纳米颗粒在制备用于治疗脱发(秃头症)的药物中的用途，或者可替换地，换句话说，用于治疗脱发(秃头症)的本发明的装载有米诺地尔的纳米颗粒。
在一个特定的实施方案中，药物为三氯生或酮康唑，因此，本发明涉及本发明的装载有三氯生或酮康唑的纳米颗粒在制备用于治疗颊感染的药物中的用途，或者可替换地，换句话说，用于治疗颊感染的本发明的装载有三氯生或酮康唑的纳米颗粒。
因为本发明的纳米颗粒可原位形成，所以本发明的另一个方面为一种组合物，其包含：
i.在介质中包含聚(甲基乙烯基醚-共-马来酸酐)(PVM/MA)共聚物的半(C1-C4)烷基酯和目的产品的溶液或悬液，所述介质包含挥发性水可混溶的醇和水性介质，其中水性介质的量低于形成纳米颗粒所需水性介质的量；以及
ii.载体。
以下通过一些实施例来描述本发明，所述实施例为非限制性的，而只对本发明进行举例说明。
实施例
以下实施例描述了基于PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的纳米颗粒(基质纳米球和壳纳米胶囊)的生产，所述纳米颗粒可合并目的产品，例如，油(例如，柠檬精油)、蛋白质(例如，牛血清白蛋白)或药物(例如，酮康唑、米诺地尔或三氯生)。所述实施例显示出所述纳米颗粒具有高黏膜生物黏附、水性介质中高长期稳定性、目的产品(例如小的或大的，亲水性、疏水性或两亲性的化合物)的高封装效率、油的高封装效率，并且纳米颗粒在疏水性化合物的水中的溶解度的增强。
以下描述了用于生产所述纳米颗粒的材料。
材料
作为PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯，使用市售
Figure BPA0000181600080000341
ES乙醇溶液；即聚甲基醚-共-马来酸酐共聚物(PVM/MA)的单乙酯(
Figure BPA0000181600080000342
ES225)和单丁酯(
Figure BPA0000181600080000343
425)的ES乙醇溶液(50％w/v)以及
Figure BPA0000181600080000345
AN119[分子量(Mw)：200,000(g/mol)]由InternationalSpecialty Products(ISP，Spain)提供。
超纯水溶解的壳聚糖(PROTASAN UP CL113，Mw：50,000～150,000g/mol)由Novamatrix(Norway)提供。
荧光素异硫氰酸标记的牛血清白蛋白(FITC-BSA)、亲脂性荧光探针1，1’-二(十八烷基)-3，3，3’，3’-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐和TPGS(与聚乙二醇1000[PEG1000]酯化的α-生育酚琥珀酸酯)由Sigma(Spain)提供。
欧洲药典级三氯生、米诺地尔、酮康唑和柠檬精油由Fagron(Spain)提供。
透明质酸钠和中链甘油三酯(812)由Fagron(Spain)提供。
包括赋形剂的所有其他化学试剂均为分析级并且由Sigma(Spain)提供。
实施例1
Figure BPA0000181600080000347
ES纳米颗粒的制备和表征
1.1通过纳米沉淀-溶剂置换法制备
Figure BPA0000181600080000348
ES纳米颗粒
为了获得
Figure BPA0000181600080000349
ES纳米颗粒，用纯乙醇将聚甲基醚-共-马来酸酐共聚物(PVM/MA)的单乙酯(
Figure BPA00001816000800003410
ES225)和单丁酯(
Figure BPA00001816000800003411
ES425)的聚合物乙醇溶液(50％w/v)稀释至5％(w/v)的浓度。然后，通过使5mL聚合物溶液与10mL作为聚合物可混的非溶剂的双蒸水混合来形成纳米颗粒。在减压下使用旋转蒸发仪(Büchi R-144，Switzerland)蒸发所得纳米颗粒悬液以除去乙醇。
另一方面，获得在不需要蒸发的情况下具有低最终含量乙醇的原位自组装
Figure BPA00001816000800003412
ES纳米颗粒(SANP)。为此，通过以下来制备包含
Figure BPA00001816000800003413
ES4255％(w/v)的非挥发性多元醇(丙二醇)聚合物溶液：在100mL丙二醇中溶解10g
Figure BPA0000181600080000351
ES425醇溶液(50％w/v乙醇溶液)，然后使1mL丙二醇-
Figure BPA0000181600080000352
ES425(5％w/v)溶液与10mL双蒸水混合以获得纳米颗粒。最后，收集空的阴离子
Figure BPA0000181600080000353
ES纳米颗粒的水性悬液用于进一步表征。
为了获得阳离子
Figure BPA0000181600080000354
ES纳米颗粒，15mL
Figure BPA0000181600080000355
ES纳米颗粒的水醇悬液(5mL
Figure BPA0000181600080000356
ES225(或
Figure BPA0000181600080000357
ES425)醇溶液(5％w/v)和10mL双蒸水的混合物)或者由原位技术获得的10mL
Figure BPA0000181600080000358
ES425纳米颗粒与包含不同壳聚糖浓度(1.25、2.5和5mg/mL)的超纯水溶解的壳聚糖(PROTASAN UP CL113)的15mL水溶液一起孵育。然后，在室温下将混合物磁力搅拌5分钟。在减压下蒸发所得纳米颗粒悬液，收集涂覆壳聚糖的ES纳米颗粒用于进一步表征。
1.2空ES纳米颗粒的表征
1.2.1纳米颗粒的尺寸、ζ电势、产率和形态
使用Zetamaster分析仪系统(Malvern Instruments，UK)分别通过光子相关光谱法和电泳激光多普勒测速法来测定纳米颗粒的尺寸和ζ电势。用双蒸水稀释样品并且在25℃下采用90°散射角进行测量。
通过前述冷冻干燥样品的重量测定来确定纳米颗粒制备方法的产率(转化成纳米颗粒的聚合物的百分比)[12]。对于这个目的而言，使纳米颗粒水性悬液以27,000×g离心20分钟两次(Sigma lab centrifuge，Rotor3336，Biofuge Heraeus，Germany)，收集，在Genesis12EL装置(Virtis，USA)中冷冻干燥。纳米颗粒的百分比产率(转化成纳米颗粒的聚合物的百分比)计算为经冷冻干燥的纳米颗粒样品与用于制备制剂的聚合物的初始量之间的比率。
通过Zeiss DSM940数字扫描电子显微镜(Oberkochen，Germany)的扫描电子显微法(SEM)和电子显微镜Zeiss
Figure BPA00001816000800003511
120(Oberkochen，Germany)的透射电子显微法(TEM)使纳米颗粒的形态特征可视化。
1.2.2结果
表1示出了
Figure BPA00001816000800003512
ES纳米颗粒的主要物理化学特征。通常，由
Figure BPA00001816000800003513
ES225(GES-NP1)和
Figure BPA00001816000800003514
ES425(GES-NP2)制备的空阴离子
Figure BPA00001816000800003515
ES纳米颗粒展现出约140nm的均匀尺寸(GES-NP1、GES-NP2和自组装GES-NP)和约-60mV的负表面电荷。纳米颗粒的百分比产率对于所有制剂而言非常高(约98％)。另一方面，用壳聚糖涂覆
Figure BPA0000181600080000361
ES纳米颗粒与非涂覆的相比显著地使颗粒尺寸增加至约200nm(P＜0.05)。涂覆壳聚糖的纳米颗粒(GES-NP-Q1.25、GES-NP-Q2.5和GES-NP-Q5)具有均匀的尺寸和带正表面电荷。应注意，通过增加附于纳米颗粒表面的壳聚糖的量，显著地增加了颗粒尺寸和正表面电荷(P＜0.05)。
表1
Figure BPA0000181600080000362
ES纳米颗粒的物理化学特征。
数据表示为平均值±SD(n＝6)
Figure BPA0000181600080000363
GES-NP1：从聚合物
Figure BPA0000181600080000364
ES225获得的ES纳米颗粒
GES-NP2：从聚合物
Figure BPA0000181600080000366
ES425获得的
Figure BPA0000181600080000367
ES纳米颗粒
GES-NP-Q：涂覆有不同量壳聚糖的
Figure BPA0000181600080000368
ES225纳米颗粒
a通过光子相关光谱法测定纳米颗粒尺寸(nm)。
b多分散指数。
c通过电泳激光多普勒测速法测定ζ电势。
d由所用初始量聚合物形成的纳米颗粒的百分比。
＊P＜0.05；涂覆壳聚糖的纳米颗粒相对于对照纳米颗粒(GES-NP)(Student t检验)。
当通过SEM和TEM检查时，发现
Figure BPA0000181600080000369
ES纳米颗粒为球形并且是均匀的[图1A和1B(GES-NP1)]。
1.3纳米颗粒稳定性研究
1.3.1短期和长期稳定性研究
为了研究
Figure BPA0000181600080000371
ES纳米颗粒在不同条件的降解速率，根据之前公开的研究[13]通过比浊测定在405nm下监测稳定性。对于该目的而言，在室温下在不同浓度ES225纳米颗粒水性悬液(10和20mg纳米颗粒/mL)和
Figure BPA0000181600080000373
AN119纳米颗粒水性悬液之间进行对比短期稳定性研究。在该研究中，因为AN119(ISP，Spain)被认为是水不溶性聚合物，所以使用非交联
Figure BPA0000181600080000375
AN119纳米颗粒[8]作为参照。
另一方面，在不同温度(4℃、室温(18～22℃)和37℃)下进行
Figure BPA0000181600080000376
ES225和
Figure BPA0000181600080000377
AN纳米颗粒的水性悬液(10mg/mL)的长期稳定性研究(约3个月)。
一式三份地测定所有样品并且数据表示为平均值和SD。在研究期间监测纳米颗粒的尺寸，最后进行扫描电子显微法(SEM)以研究在短期稳定性研究中纳米颗粒制剂的形态变化。
1.3.2结果
图2示出了在室温(25℃)下24小时内
Figure BPA0000181600080000378
ES225和
Figure BPA0000181600080000379
AN纳米颗粒以两种不同浓度(10和20mg/mL)的降解速率以及相应的扫描电子显微法(SEM)以研究纳米颗粒的形态变化。通常，独立于聚合物浓度，ES225纳米颗粒与
Figure BPA00001816000800003711
AN纳米颗粒相比在水性介质中表现更高的稳定性和更低的降解速率。在最初5小时内，两种类型的纳米颗粒表现出类似的稳定性。然而，5小时后
Figure BPA00001816000800003712
AN纳米颗粒开始显示出显著的降解速率曲线，它们在孵育后6至8小时内完全降解。
Figure BPA00001816000800003713
AN纳米颗粒的滞后时间(即，浊度开始降低时的时间)计算为约5小时。图2中的SEM图像表明
Figure BPA00001816000800003714
AN纳米颗粒完全降解，在图像C中观察到仅聚合膜。另一方面，
Figure BPA00001816000800003715
AN纳米颗粒的尺寸在孵育最初5小时内从200nm显著地增加至400nm(图3)。其后，由于AN纳米颗粒水解以形成
Figure BPA00001816000800003717
S的游离聚合溶液(
Figure BPA00001816000800003718
AN的水溶性形式)而没有检测纳米颗粒的尺寸。
在长期稳定性研究(图4)的情况中，观察到在不同的温度
Figure BPA00001816000800003719
ES纳米颗粒与
Figure BPA00001816000800003720
AN纳米颗粒相比展现出更高稳定性。
Figure BPA00001816000800003721
AN纳米颗粒的降解速率随着温度的增加而增加，降解滞后时间为孵育后2至24小时。在ES纳米颗粒的情况中，在4℃或室温下没有观察到降解。然而，在37℃下
Figure BPA0000181600080000381
ES纳米颗粒的由降解滞后时间表示的稳定性比
Figure BPA0000181600080000382
AN纳米颗粒的长约350～400倍。
实施例2
包含油的
Figure BPA0000181600080000383
ES纳米胶囊的制备和表征
2.1包含油的
Figure BPA0000181600080000384
ES纳米胶囊的制备
为了制备装载有液体油的
Figure BPA0000181600080000385
ES纳米胶囊，通过溶剂置换法使柠檬精油掺入
Figure BPA0000181600080000386
ES聚合壳中。为此，将0.5mL柠檬精油(采用亲脂性荧光探针1，1′-二(十八烷基)-3，3，3′，3′-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐荧光标记)和0.5mL丙二醇与聚合物浓度为25mg/mL的10mL
Figure BPA0000181600080000387
ES425乙醇溶液混合。其后，将油性聚合物溶液倾入包含1％(w/v)表面活性剂(即，TPGS(d-琥珀酸α-生育酚聚乙二醇1000酯))的30mL水相(介质)中。通过添加无
Figure BPA0000181600080000388
ES425聚合物的柠檬精油乙醇溶液来制备对照制剂。然后，在减压下使用旋转蒸发仪(BüchiR-144，Switzerland)来蒸发所得纳米胶囊悬液以除去乙醇。收集装载柠檬精油的
Figure BPA0000181600080000389
ES425纳米胶囊的最终水性悬液用于进一步表征。
2.2
Figure BPA00001816000800003810
ES纳米胶囊的表征
如实施例1所述测量纳米胶囊制备方法的尺寸、ζ电势和产率。为了计算经荧光标记柠檬精油的封装效率，将2mL水不可混的油(
Figure BPA00001816000800003811
812)添加至0.5mL
Figure BPA00001816000800003812
ES425纳米胶囊以通过在室温下摇动10分钟来提取游离油。通过荧光光谱测定法在540nm的激发波长和580nm的发射波长(GENios，TECAN，Groedig，Austria)下测定游离油的量。对于该目的而言，采用浓度为0.05至2.5μg/mL的装载有亲脂性荧光探针1，1′-二(十八烷基)-3，3，3′，3′-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐的柠檬精油标准溶液完成校正曲线(r＝0.996)。最后，通过荧光显微法(Olympus CH40Model，Olympus，Spain)使制剂可视化。
2.3结果
表2描述了装载有液体油(柠檬油)的
Figure BPA00001816000800003813
ES425纳米胶囊的主要物理化学特征。观察到，挥发性柠檬精油被有效地包封在
Figure BPA00001816000800003814
ES425纳米胶囊中，经包封油的百分比为约82％。
Figure BPA00001816000800003815
ES纳米胶囊的尺寸为均匀的(约212nm)并且具有负电荷ζ电势。另一方面，无
Figure BPA00001816000800003816
ES聚合物制备的对照制剂显示出低稳定性，从而油相分离，在该对照制剂中油滴的尺寸不均匀，为5至15μm。通过两种制剂的荧光显微法观察该特性(图5)。
表2
装载柠檬精油的
Figure BPA0000181600080000391
ES425纳米胶囊和对照制剂的物理化学特征。数据表示为平均值±SD(n＝6)
Figure BPA0000181600080000392
GES-NC：经荧光标记的装载有柠檬精油的
Figure BPA0000181600080000393
ES425纳米胶囊。
油乳剂：没有使用
Figure BPA0000181600080000394
ES425聚合物的制剂(阴性对照)。
a通过光子相关光谱法测定纳米颗粒尺寸(nm)。
b多分散指数。
c通过电泳激光多普勒测速法测定ζ电势。
d由所用初始量聚合物形成的纳米颗粒的百分比。
e封装效率％：
Figure BPA0000181600080000395
ES425纳米颗粒中经包封柠檬油的量相对于所用柠檬油初始量的百分比。
＊P＜0.05；装载
Figure BPA0000181600080000396
ES的纳米颗粒相对于对照制剂(油乳剂)(Student t-检验)
实施例3
通过喷雾干燥的
Figure BPA0000181600080000397
ES纳米颗粒的制备和表征
对于该目的而言，使50mLES425乙醇溶液(50mg/mL)与100mL蒸馏水混合以形成ES纳米颗粒。将不同的表面活性剂添加至纳米颗粒水醇悬液中，所述表面活性剂例如十二烷基硫酸钠(SDS)(100mg)、
Figure BPA00001816000800003910
F68[环氧乙烷/环氧丙烷嵌段共聚物](100mg)或
Figure BPA00001816000800003911
80[聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯](7.5mg)。最后，添加7.5g甘露醇作为赋形剂。为了获得
Figure BPA00001816000800003912
ES纳米颗粒的干燥粉末，在Mini Spray-dryer Büchi B191(Büchi Labortechnik AG，Switzerland)中在以下条件下干燥悬液：
入口温度：90℃，
出口温度：60℃，
喷雾流速：600L/小时，和
吸气器以最大能力的90％。
在该方法期间，纳米颗粒悬液保持在温和搅拌下。在室温下将回收粉末储存在封闭玻璃管瓶中用于如实施例1的进一步表征。
表3描述了在喷雾干燥具有不同赋形剂的
Figure BPA0000181600080000401
ES425纳米颗粒悬液后获得的
Figure BPA0000181600080000402
ES425纳米颗粒的主要物理化学特性。喷雾干燥方法的产率计算为从喷雾干燥器所获得干燥粉末的重量与所添加组分的初始理论重量之间的差异。从喷雾干燥器所获得纳米颗粒的干燥粉末容易分散于水中，所获得的尺寸均匀并且具有可接受多分散指数(0.2～0.3)。在样品悬浮于双蒸水中后所获得纳米颗粒的尺寸为约230nm并且具有表面负电荷。喷雾干燥方法的产率为所用初始理论干燥固体的80％。
表3
通过喷干燥所获得的
Figure BPA0000181600080000403
ES425纳米颗粒的物理化学特征。
数据表示为平均值±SD(n＝6)
Figure BPA0000181600080000404
GES-NP：从
Figure BPA0000181600080000405
ES425获得的
Figure BPA0000181600080000406
ES纳米颗粒。
GES-NP-SDS：包含SDS的ES425纳米颗粒。
GES-NP-T：包含80的
Figure BPA0000181600080000409
ES425纳米颗粒。
GES-NP-P：包含
Figure BPA00001816000800004010
F68的ES425纳米颗粒。
a通过光子相关光谱法测定纳米颗粒尺寸(nm)。
b多分散指数。
c通过电泳激光多普勒测速法测定ζ电势。
d由所用初始量聚合物形成的纳米颗粒的百分比。
＊P＜0.05；具有赋形剂的喷雾干燥纳米颗粒(GES-NP-SDS、GES-NP-T和GES-NP-P)相对于对照纳米颗粒(GES-NP)(Student t-检验)
实施例4
牛血清白蛋白作为大分子模型在
Figure BPA0000181600080000411
ES纳米颗粒中的封装
4.1BSA在
Figure BPA0000181600080000412
ES纳米颗粒中的封装
荧光标记蛋白用作大分子药物模型渗入
Figure BPA0000181600080000413
ES纳米颗粒中。对于该目的而言，使用不同量的经荧光素异硫氰酸标记的牛血清白蛋白(FITC-BSA)(0.5、1和2.5mg/250mg
Figure BPA0000181600080000414
ES425)。使蛋白质溶解于1mL蒸馏水中，然后将其添加至5mL
Figure BPA0000181600080000415
ES425乙醇溶液(50mg/mL)中。在室温下使溶液磁力搅拌5分钟，然后添加9mL蒸馏水以形成纳米颗粒。在减压下使用旋转蒸发仪(Büchi R-144，Switzerland)来蒸发所得纳米胶囊悬液以除去乙醇。收集装载FITC-BSA的
Figure BPA0000181600080000416
ES纳米颗粒的最终水性悬液用于进一步表征。
4.2装载FITC-BSA的ES纳米颗粒的表征
如实施例1所述测定纳米颗粒制备方法的尺寸、ζ电势和产率。为了计算FITC-BSA在
Figure BPA0000181600080000418
ES纳米颗粒中的封装效率，使纳米颗粒悬液以27,000×g离心20分钟。然后，在上清液中测定游离FITC-BSA的量，从所用蛋白质的初始量中估算包封蛋白质的量。对于该目的而言，用浓度为1至50μg/mL的FITC-BSA标准溶液制备校正曲线(r＝0.996)。通过荧光光谱测定法(GENios，TECAN，Austria)在485nm(激发波长)和535nm(发射波长)下进行测定。在预涂覆聚-L-赖氨酸的载玻片(Sigma，Spain)上沉积新鲜制备的包含FITC-BSA的纳米颗粒，通过荧光显微法(Olympus CH40Model，Olympus，Spain)进行可视化。
4.3结果
表4描述了装载FITC-BSA的ES纳米颗粒的主要物理化学特征。观察到，FITC-BSA在
Figure BPA00001816000800004110
ES纳米颗粒中的封装引起纳米颗粒尺寸的显著增加，但没有影响纳米颗粒的表面电荷。封装效率为约96％，这表明
Figure BPA00001816000800004111
ES纳米颗粒对合并大分子(例如蛋白质)的高能力。FITC-BSA
Figure BPA00001816000800004112
ES纳米颗粒的荧光显微法证实了FITC-BSA在纳米颗粒聚合物基质内的高合并(图6)。
表4
装载FITC-BSA的
Figure BPA0000181600080000421
ES425纳米颗粒的物理化学特征。
数据表示为平均值±SD(n＝6)
Figure BPA0000181600080000422
GES-NP：从ES425获得的
Figure BPA0000181600080000424
ES纳米颗粒。
NP-BSA-0.5、NP-BSA-1和NP-BSA-2.5：具有不同量FITC-BSA的装载
FITC-BSA的
Figure BPA0000181600080000425
ES425纳米颗粒
a通过光子相关光谱法测定纳米颗粒尺寸(nm)。
b多分散指数。
c通过电泳激光多普勒测速法测定ζ电势。
d由所用初始量聚合物形成的纳米颗粒的百分比。
e封装效率％：经封装蛋白质在
Figure BPA0000181600080000426
ES425纳米颗粒中的量相对于所用初始量的百分比。
＊P＜0.05
装载FITC-BSA的纳米颗粒相对于对照纳米颗粒(GES-NP)(Student t-检验)
该实施例示出了实现了大亲水性化合物(BSA)的高封装效率(约97％)。
实施例5
罗丹明B作为小亲水性药物模型在
Figure BPA0000181600080000427
ES纳米颗粒中的封装
通过将预溶解在1mL双蒸水中的荧光亲水分子(1mg)添加至5mL
Figure BPA0000181600080000428
ES425乙醇溶液(50mg/mL)中来制备装载罗丹明B的
Figure BPA0000181600080000429
ES纳米颗粒。在室温下使溶液磁力搅拌5分钟，然后添加9mL蒸馏水以形成纳米颗粒。在减压下使用旋转蒸发仪(Büchi R-144，Switzerland)来蒸发所得纳米颗粒悬液以除去乙醇。通过比色法(Labsystems iEMS Reader MF，Finland)在540nm下测定装载至纳米颗粒中的RBITC[罗丹明B异硫氰酸酯]的量。装载的RBITC的量估算为其所添加初始浓度与在离心步骤后上清液中所测量浓度之间的差异。根据别处描述的改进方案[18]来研究RBITC自纳米颗粒的体外释放。对于该目的而言，使1mL纳米颗粒悬液与3mL磷酸盐缓冲盐水(PBS)pH7.4混合，在37±1℃下进行搅拌。在不同时间间隔，通过使用透析管
Figure BPA0000181600080000431
100,000MWCO(VIVASPIN，Germany)收集纳米颗粒。测定透析液以通过比色法在540nm下定量所释放罗丹明B的量。
Figure BPA0000181600080000432
ES纳米颗粒示出了对联合小亲水性分子(例如罗丹明B)的高能力(图5)。封装效率为所添加罗丹明B的初始量的99％。另一方面，罗丹明B的包封显著地增加了纳米颗粒尺寸(表5)而对纳米颗粒的表面电荷没有任何影响。
表5
装载罗丹明B的
Figure BPA0000181600080000433
ES425纳米颗粒的物理化学特征。
数据表示为平均值±SD(n＝6).
Figure BPA0000181600080000434
GES-NP：从
Figure BPA0000181600080000435
ES425获得的
Figure BPA0000181600080000436
ES425纳米颗粒。
GESNP-RB：装载罗丹明B的
Figure BPA0000181600080000437
ES425纳米颗粒。
a通过光子相关光谱法测定纳米颗粒尺寸(nm)。
b多分散指数。
c通过电泳激光多普勒测速法测定ζ电势。
d由所用初始量聚合物形成的纳米颗粒的百分比。
e封装效率％：经封装罗丹明B在
Figure BPA0000181600080000438
ES425纳米颗粒中的量相对于所用初始量的百分比。
＊P＜0.05；装载罗丹明B的纳米颗粒相对于对照纳米颗粒(GES-NP)(Student t-检验)
实施例6
酮康唑作为疏水性抗真菌药物模型在
Figure BPA0000181600080000441
ES纳米颗粒中的封装以 用于黏膜和表面递送应用
6.1装载酮康唑(KTZ)的
Figure BPA0000181600080000442
ES纳米颗粒的生产
为了研究
Figure BPA0000181600080000443
ES纳米颗粒对捕获疏水性分子的能力，选择酮康唑作为水不溶性疏水性分子。酮康唑是咪唑类抗真菌剂，在一般溶剂(例如水和醇)中具有非常低的溶解特征。首先对选择适当酮康唑：聚合物比率(w/w)进行优化，需要其用于溶解药物晶体并且获得没有药物晶体的均匀纳米颗粒。对于该目的而言，使200mg KTZ重悬于不同体积的纯乙醇(10、15和20mL)(作为对照溶液)和相同体积的
Figure BPA0000181600080000444
ES425乙醇溶液(50mg/mL)二者中。通过将相应体积的双蒸水(2：1(v/v)水/聚合物溶液)添加至包含KTZ的
Figure BPA0000181600080000445
ES醇溶液中来生产
Figure BPA0000181600080000446
ES纳米颗粒。平行地，将类似体积的双蒸水添加至KTZ乙醇溶液中(没有聚合物的阴性对照，以研究
Figure BPA0000181600080000447
ES的溶解效果)。在减压下使用旋转蒸发仪(Büchi R-144，Switzerland)来蒸发所得的包含KTZ的纳米颗粒悬液或水醇溶液以除去乙醇。最后，收集装载KTZ的
Figure BPA0000181600080000448
ES纳米颗粒的水性悬液和没有聚合物的KTZ水性悬液以用于进一步表征。
6.2KTZ纳米颗粒的表征
如实施例1所述测定纳米颗粒制备方法的尺寸、ζ电势和产率。荧光和光学显微法用于研究晶体在所得装载KTZ的
Figure BPA0000181600080000449
ES纳米颗粒悬液中的存在。对于该目的而言，通过扫描电子显微法(SEM)使装载KTZ的纳米颗粒和由相同方式处理的游离药物可视化。另外，在室温下将装载KTZ的
Figure BPA00001816000800004410
ES纳米颗粒放置2个月，然后通过SEM使纳米颗粒形态可视化。通过UV分光光度法(Shimadzu1203UV-VIS)在257nm下测定经包封药物在纳米颗粒中的量。为了使KTZ在纳米颗粒悬液中的量或在无聚合物
Figure BPA00001816000800004411
ES的游离KTZ悬液中的量进行定量，在减压下蒸发新鲜制备制剂的所有样品以除去乙醇，然后以20,000rpm使1mL一式三份的样品离心25分钟。其后，用甲醇稀释0.5mL上清液并且通过分光光度法在257nm下进行测定[14]。平行地，在37℃下使纳米颗粒沉淀放置2天以蒸发残余的水，然后使包含KTZ的制剂溶解于1mL甲醇中，在257nm下测定。通过使25mg KTZ溶解于100mL甲醇中来完成校正曲线。从该标准溶液中制备校正曲线点(5～30μg/mL)。
6.3结果
从表6所示结果可以推断，ES纳米颗粒显示出对包封水不溶性药物分子(例如酮康唑)的高能力。封装效率为所添加KTZ的初始量的约97％。在从醇溶液沉淀KTZ后对所获得的包含晶状沉淀的水性悬液获得的定量结果表明，KTZ的水溶性为约11μg/mL，这与之前公开的数据[15]类似。在该阴性对照样品中沉淀的外观为完全晶状的。
另一方面，KTZ与
Figure BPA0000181600080000452
ES纳米颗粒(NPGES-KTZ1、NPGES-KTZ2和NPGES-KTZ3)的关联与对照的(GES-NP)相比降低了表面负电荷。不同聚合物浓度的包含KTZ的纳米颗粒的尺寸为均匀的(约200nm)，这表明没有约2～10μm的药物晶体。仅在通过与用于形成纳米颗粒的包含KTZ的
Figure BPA0000181600080000453
ES醇溶液相同方式处理KTZ醇溶液后观察到这些药物晶体。在通过SEM使KTZ晶体和装载KTZ的
Figure BPA0000181600080000454
ES纳米颗粒可视化后观察该事实(图7)。对于在室温下将纳米颗粒放置至少2个月，获得了来自SEM的类似结果，其中没有观察晶体生长和形成(图7C)。这些结果表明，
Figure BPA0000181600080000455
ES纳米颗粒增强了疏水性药物(例如KTZ)的水溶性。
表6
装载酮康唑的
Figure BPA0000181600080000456
ES425纳米颗粒的物理化学特征。
数据表示为平均值±SD(n＝6)
Figure BPA0000181600080000457
Figure BPA0000181600080000458
GES-NP：从
Figure BPA0000181600080000459
ES425获得的
Figure BPA00001816000800004510
ES425纳米颗粒。
NPGES-KTZ1：装载酮康唑的
Figure BPA00001816000800004511
ES425纳米颗粒(200mg KTZ和500mgES425)
NPGES-KTZ2：装载酮康唑的
Figure BPA00001816000800004513
ES425纳米颗粒(200mg KTZ和750mg
Figure BPA00001816000800004514
ES425)
NPGES-KTZ3：装载酮康唑的
Figure BPA0000181600080000461
ES425纳米颗粒(200mg KTZ和1000mg
Figure BPA0000181600080000462
ES425)
a通过光子相关光谱法测定纳米颗粒尺寸(nm)。
b多分散指数。
c通过电泳激光多普勒测速法测定ζ电势。
d由所用初始量聚合物形成的纳米颗粒的百分比。
e封装效率％：经封装KTZ在
Figure BPA0000181600080000463
ES425纳米颗粒中的量相对于所用初始量的百分比。
＊P＜0.05；装载酮康唑的
Figure BPA0000181600080000464
ES纳米颗粒相对于对照纳米颗粒(GES-NP)(Student t-检验)
实施例7
三氯生(TRI)作为疏水性抗微生物药物模型在
Figure BPA0000181600080000465
ES纳米颗粒中 的封装以用于黏膜和表面递送应用
7.1装载三氯生的
Figure BPA0000181600080000466
ES纳米颗粒的生产
为了获得装载三氯生(TRI)的
Figure BPA0000181600080000467
ES纳米颗粒，使用不同量的三氯生(TRI)。对于该目的而言，使12和20mg TRI溶解于5mL的40mg/mL
Figure BPA0000181600080000468
ES425乙醇溶液中。通过添加10mL双蒸水来生产
Figure BPA0000181600080000469
ES425纳米颗粒。其后，在减压下使用旋转蒸发仪(Büchi R-144，Switzerland)来蒸发有机溶剂(乙醇)，TRI在纳米颗粒中的最终总浓度为0.12％或2％(w/v)。收集包含TRI的
Figure BPA00001816000800004610
ES425纳米颗粒的水性悬液以用于进一步表征和药物含量定量。
另一方面，施用原位自组装技术以获得装载有TRI的
Figure BPA00001816000800004611
ES425纳米颗粒，以便避免乙醇的蒸发步骤并且得到具有低乙醇含量的最终纳米颗粒悬液。对于该目的而言，在丙二醇(PG)中以5％(w/v)的浓度制备聚合物(
Figure BPA00001816000800004612
ES425)的溶液(GES-PG溶液)。然后，通过使相应量的TRI溶解于丙二醇聚合物溶液(TRI-PG)中来制备TRI溶液。将GES-PG溶液和TRI-PG溶液混合在一起(GES-TRI-PG溶液)。其后，通过将GES-TRI-PG溶液添加至水(10mL)中来形成包含TRI的纳米颗粒。
平行地，在两种技术(溶剂置换和原位自组装技术)中使用相同浓度的TRI而不使用
Figure BPA0000181600080000471
ES425，用作对照以检查Gantrez
Figure BPA0000181600080000472
425纳米颗粒对TRI的溶解性的辅助作用。
7.2装载三氯生的
Figure BPA0000181600080000473
ES纳米颗粒的表征
如实施例1所述测定纳米颗粒制备方法的尺寸、ζ电势和产率。扫描电子显微法(SEM)和荧光显微法用于研究晶体在所得的装载TRI的
Figure BPA0000181600080000474
ES425纳米颗粒的悬液中和在阴性对照制剂(即，没有
Figure BPA0000181600080000475
ES425)中的存在。通过UV分光光度法在280nm下测定包封药物在纳米颗粒中的量[9](Shimadzu1203UV-VIS)。为了对TRI在纳米颗粒悬液中的量进行定量，在减压下蒸发ES425纳米颗粒的所有样品以除去乙醇或者在TRI-PG制剂的情况下直接测定。对于该目的而言，使1mL样品(一式三份)以20000rpm离心20分钟。其后，用甲醇稀释0.5mL上清液并且通过UV分光光度法在280nm下测定。从该标准溶液中制备校正曲线点(10～40μg/mL)。
7.3结果
结果示于表7中。鉴于所述结果可以推断，
Figure BPA0000181600080000477
ES425纳米颗粒显示出对包封水不溶性药物分子(例如三氯生(TRI))的高能力。在根据溶剂置换法所获得纳米颗粒的情况中，封装效率为所添加TRI的初始量的约97％。然而，在通过自组装技术所获得纳米颗粒的情况中，封装效率显著降低(82％)。不同浓度的包含TRI的纳米颗粒的尺寸是均匀的(约140nm)，这表明没有约50～200μm的药物晶体(图8A)。在通过SEM使TRI晶体(异型对照制剂)和装载TRI的
Figure BPA0000181600080000478
ES425纳米颗粒二者可视化后观察到该特性(图8B)。这些结果表明，
Figure BPA0000181600080000479
ES425纳米颗粒增强了疏水性药物如TRI的水溶解性，因为在纳米颗粒制剂中没有药物晶体。令人惊讶地是，将确定量的水(高于获得纳米颗粒所需的量)添加至没有
Figure BPA00001816000800004710
ES425的TRI的醇溶液中后，TRI沉淀为非晶状油相并且形成具有大尺寸油性颗粒的乳剂。可通过SEM(图8C)和通过用于采用亲脂性荧光探针1，1′-二(十八烷基)-3，3，3′，3′-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐(图8D)染色的TRI乳剂的荧光显微法(图8D)二者使该油可视化。TRI的油相在水中具有高密度并且在油滴聚结后沉淀为油层。
表7
装载TRI的
Figure BPA0000181600080000481
ES425纳米颗粒的物理化学特征。
数据表示为平均值±SD(n＝6)
GES-NP：从
Figure BPA0000181600080000483
ES425获得的
Figure BPA0000181600080000484
ES425纳米颗粒。
NPGES-TRI0.12：装载三氯生的ES425纳米颗粒(纳米颗粒悬液中0.12％最终药物浓度w/v)。
NPGES-TRI0.2：装载三氯生的
Figure BPA0000181600080000486
ES425纳米颗粒(纳米颗粒悬液中0.2％最终药物浓度w/v)。
NPGES-TRI-PG：自组装的装载三氯生的
Figure BPA0000181600080000487
ES425纳米颗粒。
a通过光子相关光谱法测定纳米颗粒尺寸(nm)。
b多分散指数。
c通过电泳激光多普勒测速法测定ζ电势。
d由所用初始量聚合物形成的纳米颗粒的百分比。
e封装效率％：在
Figure BPA0000181600080000488
ES425纳米颗粒中所封装TRI的量相对于所用初始量的百分比。
＊P＜0.05；装载三氯生的ES纳米颗粒相对于对照纳米颗粒(GES-NP)(Student t-检验)。
+P＜0.05；NPGES-TRI-PG纳米颗粒相对于NPGES-TRI(Student t-检验)。
实施例8
米诺地尔(MXD)作为疏水性药物模型在 ES纳米颗粒中的封 装以用于脱发应用
8.1装载MXD的
Figure BPA00001816000800004811
ES纳米颗粒的生产
如先前对装载有KTZ的Gantrez纳米颗粒(实施例6)所描述的来制备装载有MXD的Gantrez
Figure BPA0000181600080000492
纳米颗粒。对于该目的而言，使200mg和250mg MXD溶解于5mL乙醇溶液中或5mLES425乙醇溶液(50mg/mL)中。然后通过在磁力搅拌下将10mL双蒸水添加至5mL
Figure BPA0000181600080000494
ES425醇溶液中来生产装载有MXD的
Figure BPA0000181600080000495
ES425纳米颗粒。在减压下使用旋转蒸发仪(Büchi R-144，Switzerland)来蒸发包含MXD的所得纳米颗粒悬液或所得水醇溶液以除去乙醇。最后，收集包含MXD的
Figure BPA0000181600080000496
ES425纳米颗粒的水性悬液以用于进一步表征和药物含量定量。最后，作为相容增塑剂的不同赋形剂与聚合物(
Figure BPA0000181600080000497
ES)一起添加，包括丙二醇、PEG400(分子量(Mw)为400Da的聚乙二醇)和甘油(10％(v/v))。
8.2MXD纳米颗粒的表征
如实施例1所述测定纳米颗粒生产方法的尺寸、ζ电势和产率。为了研究制剂的物理稳定性，在攻击性(aggresive)和高温条件(37℃下1个月)下放置装载有MXD的
Figure BPA0000181600080000498
ES425纳米颗粒，以在聚丙烯或玻璃容器二者中监测晶体生长或沉淀现象。每天检查制剂的尺寸和总体外观。另外，宏观和微观特征(光学和扫描电子显微法)用于研究包含MXD的纳米粒子聚合物干燥膜或市售制剂的表观和物理特性。对于该目的而言，在塑料表面上施用200μL样品[2％(w/v)MXD]，然后在37℃下干燥样品以模仿其在头皮上施用后发生的现象。所用制剂为具有不同赋形剂(丙二醇、PEG400和甘油)的包含MXD的
Figure BPA0000181600080000499
ES425纳米颗粒，包含乙醇、丙二醇、EDTA(乙二胺四乙酸)和水的MDX的市售制剂(
Figure BPA00001816000800004910
2％)，包含γ-环糊精、丙二醇、乙醇和水的市售制剂(
Figure BPA00001816000800004911
2％)。在干燥表面上施用这些制剂并且宏观地和微观地监测其整体外观。最后，通过UV分光光度法在286nm下(Shimadzu1203UV-VIS)测定包封药物在纳米颗粒中的量。对于该目的而言，使1mL
Figure BPA00001816000800004912
ES425纳米颗粒样品(一式三份)以20000rpm离心25分钟。其后，采用乙醇稀释0.5mL上清液并且在286nm下通过UV分光光度法测定[16]。
8.3结果
通常，在具有赋形剂或没有赋形剂的情况下装载有MXD的
Figure BPA00001816000800004913
ES425纳米颗粒展现出约130nm的均匀小尺寸(PDI0.1)和负电荷ζ电势(-54mV)。在两种制剂(装载有200mg MXD的制剂和装载有250mgMXD的制剂)中封装效率相当高，其为所添加MXD初始量的约70％(表8)。在制剂的物理稳定性研究中，在进攻性物理条件下30天期间每天的尺寸监测和宏观可视化没有表明尺寸的任何变化(图9)或在聚丙烯或玻璃容器中沉淀。这些结果确证，仍剩余的非包封MXD溶解于纳米颗粒的水性悬液中。
表8
装载MXD的
Figure BPA0000181600080000501
ES425纳米颗粒的物理化学特征。
数据表示为平均值±SD(n＝6)
Figure BPA0000181600080000502
Figure BPA0000181600080000503
NPGES-MXD200：具有200mg MXD的装载米诺地尔的
Figure BPA0000181600080000504
ES425纳米颗粒。
NPGES-MXD250：具有250mg MXD的装载米诺地尔的
Figure BPA0000181600080000505
ES425纳米颗粒。
PG、G和PEG：将赋形剂添加至纳米颗粒制剂中，即丙二醇(PG)、甘油(G)或聚乙二醇400(PEG)。
a通过光子相关光谱法测定纳米颗粒尺寸(nm)。
b多分散指数。
c通过电泳激光多普勒测速法测定ζ电势。
d由所用初始量聚合物形成的纳米颗粒的百分比。
e封装效率％：经包封MXD在
Figure BPA0000181600080000506
ES425纳米颗粒中的量相对于所用初始量的百分比。
＊P＜0.05；GES-MXD200相对于GES-MXD200对照纳米颗粒[从ES获得的ES纳米颗粒(GES-NP)](Student t-检验)。
另一方面，对具有不同赋形剂的包含MXD(2％)的
Figure BPA0000181600080000511
ES425纳米颗粒，包含乙醇、丙二醇和水的MXD的市售制剂(
Figure BPA0000181600080000512
2％)以及包含γ-环糊精、丙二醇、乙醇和水的市售制剂(
Figure BPA0000181600080000513
2％)进行宏观和微观可视化测定。图10描述了所施用制剂的宏观和微观二者外观。在该图中，纳米颗粒制剂的干燥前样品的外观是乳白色而市售产品的是透明的。然而，2小时干燥后，对于市售产品而言观察到结晶膜具有可视的大的白色晶体层。另一方面，包含PEG400或丙二醇的ES425纳米颗粒的样品显示出透明的黏附膜而没有观察到任何大的结晶沉淀。包含具有甘油的ES425纳米颗粒的样品具有轻微乳白色精美观外表并且没有任何结晶沉淀。另外，无赋形剂的装载MXD的
Figure BPA0000181600080000516
ES425纳米颗粒显示出干燥破裂薄膜的外观但是没有任何可视晶体(图10)。另外，具有不同赋形剂的装载MXD的
Figure BPA0000181600080000517
ES425纳米颗粒(NPGES-MXD G、NPGES-MXD PEG和NPGES-MXD PG)在12小时后没有形成干膜。然而，对于市售产品而言在2小时内而对于没有赋形剂的装载MXD的ES425而言4小时内观察到干燥沉淀。微观检查确证，对于市售产品
Figure BPA0000181600080000519
和
Figure BPA00001816000800005110
而言在2小时内观察到宏观结果(即，大晶体)。对于MXD纳米颗粒制剂而言在残余膜的外观之间有显著差异。在该情况中，无赋形剂的装载MXD的
Figure BPA00001816000800005111
ES425纳米颗粒显示出有条纹的容易破裂的膜(NPGES-MXD)。对于包含赋形剂(例如丙二醇、甘油或PEG)的MXD纳米颗粒的干膜而言，没有观察到该现象。另外，对于包含MXD纳米颗粒制剂的任何干膜而言，没有观察到大晶体。
图11示出了对于装载MXD的
Figure BPA00001816000800005112
ES425纳米颗粒制剂和MXD市售制剂而言进行的SEM。从该图获得的数据正确关联并确证图10所示结果。对于市售产品(
Figure BPA00001816000800005113
和
Figure BPA00001816000800005114
)，观察到大晶体沉淀。另一方面，对于MXD纳米颗粒制剂(NPGES/MXD、NPGES/MXDG、NPGES/MXD PG和NPGES/MXD PEG)，没有观察到大晶体。无赋形剂的MXD纳米颗粒制剂(NPGES/MXD)和具有甘油的MXD纳米颗粒(NPGES/MXD G)二者显示出存在包含具有均匀粒径分布的纳米颗粒的均匀膜。令人惊讶地是，在干燥的包含具有PG或PEG的装载MXD的
Figure BPA00001816000800005115
ES425纳米颗粒的膜中没有检测到纳米颗粒，这可能是因为水蒸发后聚合物在这些赋形剂中溶解。重要地是，应注意，对于包含PEG400的制剂，观察到一些大沉淀(聚合膜层)，这可能与聚合物的一些羧基与PEG的相互作用有关。需要另一些研究以鉴定该沉淀的类型和性质。最后，所有膜具有美观外表和浅色黏附黏性质地。
实施例9
ES纳米颗粒与毛发的生物黏附亲和力
该研究的目的是研究ES纳米颗粒与毛发的黏附能力。对于该目的而言，使用经荧光标记的具有罗丹明B的
Figure BPA0000181600080000523
ES425纳米颗粒。通过将预溶解在200μL双蒸水中的荧光亲水性分子(200μg)添加至5mL
Figure BPA0000181600080000524
ES425乙醇溶液(50mg/mL)中来制备装载罗丹明B的
Figure BPA0000181600080000525
ES425纳米颗粒。在室温下使溶液磁力搅拌5分钟，然后添加9.3mL蒸馏水以形成纳米颗粒。在减压下使用旋转蒸发仪(BüchiR-144，Switzerland)蒸发所得纳米颗粒悬液以除去乙醇并且如实施例5所述测定经在ES425纳米颗粒中包封的罗丹明B的量。Wood之后，将500μL甘油添加至纳米颗粒的水性悬液中以实现10mL最终体积的具有5％(v/v)甘油浓度的纳米颗粒悬液。对于黏附测定，用肥皂和热水(70℃)经5分钟洗涤正常黑色女性毛发(100cm长)。之后，将毛发切成5cm长部分并分成两组(M1和M2)。通过来源于毛发干燥器的热空气经5分钟干燥毛发样品。其后，将干燥毛发浸入经荧光标记的
Figure BPA0000181600080000527
ES425纳米颗粒30秒，然后在室温下使其干燥。干燥后，通过荧光和扫描电子显微法(SEM)使M1组的毛发可视化。再用肥皂和热水(70℃)经5分钟洗涤M2组的毛发样品，然后如M1组所述通过荧光和SEM进行可视化。为了定量与两组(M1和M2)中毛发相黏附的纳米颗粒的量，在NaOH3M中消化毛发以溶解与毛发相黏附的聚合纳米颗粒并提取罗丹明B。通过荧光光谱法(GENios，TECAN，Groedig，Austria)在540nm(激发波长)和580nm(发射波长)下测定与毛发相黏附的纳米颗粒的级份的量，以评估与毛发相黏附的纳米颗粒的级份。数据表示为1mg毛发或cm2毛发表面面积的黏附级份。
已经发现，毛发样品上黏附级份的量对于M1组而言为约9.5μg纳米颗粒/cm2毛发表面面积。在毛发样品的另一个组(M2)中，虽然纳米颗粒的黏附级份的量通过毛发洗涤而降低，但是发现纳米颗粒仍与毛发表面(3.5μg纳米颗粒/cm2毛发表面面积)黏附。荧光和SEM(图12和13)确证了ES425纳米颗粒与毛发表面的初始强黏附亲和力。另外，M1组中在毛发表面上所黏附纳米颗粒的干膜抵抗洗涤和高温条件并且保持与毛发表面黏附，如M2组所示。另外，包含ES纳米颗粒膜的毛发的外观美观、透明、有光泽并且在干燥后没有显示出任何黑色残余物。
实施例10
Figure BPA0000181600080000532
ES纳米颗粒在猪颊黏膜中的离体黏膜亲和力研究
10.1定量的生物黏附测定
为了研究
Figure BPA0000181600080000533
ES纳米颗粒的生物黏附能力(生物黏附性)和黏膜亲和性，使用新鲜获得的猪颊黏膜和舌背面。对于该目的，从当地屠宰场获得猪头并且手术分离颊黏膜和舌背黏膜。使用手术剪从下方结缔组织清除上皮并切成2cm2圆形区域。然后，在4℃下将组织样品储存在PBS中并在2小时内使用。使组织夹在Franz池室的牵引平板法兰之间并且在供体室内布置纳米颗粒制剂的不同样品。在该情况中，纳米颗粒制剂为500μL的：
(i)如实施例9中公开的经荧光标记的具有罗丹明B的
Figure BPA0000181600080000534
ES225纳米颗粒的水性悬液(没有使用甘油)，
(ii)经荧光标记的具有罗丹明B的
Figure BPA0000181600080000535
AN纳米颗粒的水性悬液，
(iii)重悬于透明质酸钠凝胶(0.75％w/v)中的经荧光标记的
Figure BPA0000181600080000536
ES225纳米颗粒，和
(iv)重悬于透明质酸钠凝胶(0.75％w/v)中的经荧光标记的
Figure BPA0000181600080000537
AN纳米颗粒。
对于黏膜表面的样品施用，采用湍流搅拌使供体室的一侧(1cm2组织)暴露于500μL水性纳米颗粒悬液仅30秒，以模拟颊的漱口条件。然后，从室中退出样品并且在37℃下使制剂暴露于75mL模拟唾液[19]～[20]6小时。在透明质酸钠凝胶应用的情况中，使掺入透明质酸盐凝胶中的等量纳米颗粒留在室中。在不同的时间间隔移出组织样品，然后切割1cm2区域(在实验期间暴露于样品)并分离。如前所述测定黏附纳米颗粒的量[12]。简要地，使每个黏膜区段用2mL NaOH3M消化24小时。通过添加NaOH3M使样品稀释至3mL，涡旋10分钟，然后以2,000×g离心30分钟。最后，通过荧光光谱法(GENios，TECAN，Groedig，Austria)在540nm(激发波长)和580nm(发射波长)下测定罗丹明B的量，以评估纳米颗粒黏附至黏膜的级份。通过将罗丹明B溶液添加至NaOH3M(0.05～1μg/mL)中用对照组织制备生物黏附研究的标准曲线(r＞0.996)。
10.2荧光显微法组织可视化
通过荧光显微法使装载罗丹明B的
Figure BPA0000181600080000541
ES225纳米颗粒制剂在颊和舌黏膜中的分布可视化。对于该目的而言，移出暴露于不同制剂的黏膜表面样品，暴露后2.5小时用PBS洗涤。然后，通过手术剪将黏膜切成小块，用组织进行介质OCT(最佳切割温度)进行处理(Sakura，Netherlands)，然后在液氮中冷冻。在低温恒温器(2800Frigocut E，Reichert-Jung，Germany)中将组织样品切成5μm长度部分，附于预先涂覆聚-L-赖氨酸的载玻片(Sigma，Spain)，然后在荧光微观可视化前储存在-20℃。
10.3结果
图14表示在猪颊黏膜和舌背黏膜二者中对于
Figure BPA0000181600080000542
ES225和
Figure BPA0000181600080000543
AN共聚物而言每cm2组织的纳米颗粒(NP)制剂(μgNP/cm2组织)的黏附级份的累计数量。通常，ES225纳米颗粒(NPGESR)显示出比AN纳米颗粒(NP GANR)更高的黏附能力。然而，两种类型的纳米颗粒在0(0小时)展现出类似的初始黏附力。在1、2.5、4和6小时，在两种类型的猪黏膜中，
Figure BPA0000181600080000546
ES225纳米颗粒的累计黏附级份比
Figure BPA0000181600080000547
AN纳米颗粒的累计黏附级份高出约2～3倍(P＜0.05)。在包含纳米颗粒的凝胶制剂的情况中，观察到透明质酸盐凝胶在0小时使
Figure BPA0000181600080000548
ES225纳米颗粒(GEL NPGESR)的初始黏附能力比
Figure BPA0000181600080000549
ES纳米颗粒悬液的增强了约2倍。另外，在1、2.5、4和6小时，对于包含
Figure BPA00001816000800005410
ES225纳米颗粒的凝胶，观察到生物黏附能力显著增强。令人惊讶地是，在AN凝胶制剂(GELNPGANR)的情况中没有观察到该现象，其中水性悬液(NP GANR)和包含AN纳米颗粒的凝胶(GEL NPGANR)之间没有观察到显著差异。
图15显示出在施用经荧光标记纳米颗粒制剂0.5和2.5小时后两种颊黏膜组织的荧光显微图像。对照组织(没有纳米颗粒制剂)在组织中显示出低荧光密度(图15B)。装载罗丹明B的
Figure BPA00001816000800005413
ES纳米颗粒在颊黏膜的黏膜层在组织与唾液孵育0.5小时后展现出高荧光密度(图15C)，这在2.5小时时类似(图15E)。另一方面，
Figure BPA0000181600080000551
AN纳米颗粒的组织荧光强度在孵育后从0.5至2.5小时降低，大约类似于在施用后2.5小时的对照样品(图15D和15F)。这些数据确证，在颊黏膜中ES225比AN纳米颗粒具有更高亲和力和更长停留时间。另外，观察到，在所有情况中，纳米颗粒没有穿透进入亚黏膜组织。
图16显示出在施用经荧光标记纳米颗粒制剂2.5小时时舌背黏膜表面的荧光显微图像。在类似于颊黏膜组织的组织(猪舌的背黏膜)中，
Figure BPA0000181600080000554
ES225纳米颗粒(图16C和16D)示出了比
Figure BPA0000181600080000555
AN纳米颗粒(图16B)更高的亲和力和更长的停留时间。
实施例1～10的整体讨论
发明人优化了溶剂蒸发方法和原位自组装技术，以用于生产用PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯制备的生物黏附纳米颗粒(基质纳米球或壳纳米胶囊)。
在该上下文中，令人惊讶地发现，使包含所述PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的可药用或可美容用溶剂如乙醇或多元醇(例如，丙二醇)与水溶液(任选地包含一种或更多种赋形剂)混合，使得自发形成具有非常均匀小尺寸的纳米颗粒。在溶剂蒸发方法的情况中，如此获得的纳米颗粒的平均尺寸为约125～145nm、通常为约130～135nm，具有高制备产率(约98％)。
另外，可获得基于所述PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的原位自组装纳米颗粒(SANP)。该原位自组装技术使得原位形成纳米颗粒并且在PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯与水性介质(例如，水或体液如胃肠道液)接触时在所述纳米颗粒中包封目的产品(POI)。
生产本发明的纳米颗粒(基于使用PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯)的生产方法的简单性降低了工业规模成本，因为简单获得所述纳米系统而不使用基于其他PVM/MA衍生物(例如，聚(甲基乙烯基醚-共-马来酸酐)(PVM/MA)共聚物(
Figure BPA0000181600080000556
AN))的纳米系统所描述的任何特定装置。
本发明的纳米颗粒的一个重要优点在于在本发明的所述纳米颗粒的水性介质中的长期稳定性(降解速率)比
Figure BPA0000181600080000557
AN纳米系统的更高(图2)，即，本发明的纳米颗粒在水性介质中在长期稳定性方面显示出比AN纳米系统的更低的降解速率。
施用乳剂技术以获得
Figure BPA0000181600080000562
AN纳米系统，在所述纳米系统在水性介质中的短期稳定性研究中显示出稳定性，因为
Figure BPA0000181600080000563
AN水解成
Figure BPA0000181600080000564
S。类似地，在水性介质中，这些纳米颗粒可十分快速地溶解。
Figure BPA0000181600080000565
AN纳米系统在水性介质中的稳定需要用多胺化合物、有毒交联剂如1，3-二氨基丙烷(DP)或者免疫原性分子如牛血清白蛋白(BSA)的化学改性。添加DP仅微弱地增强了
Figure BPA0000181600080000566
AN纳米颗粒在PBS中的稳定性，以实现在2小时内20％的水解速率，相对于非交联
Figure BPA0000181600080000567
AN纳米颗粒的40％。PVM/MA纳米颗粒的交联的其他缺点包括显著增加纳米颗粒平均尺寸和显著降低纳米系统的生物黏附能力。然而，本发明的纳米颗粒不需要交联，因此所述纳米颗粒可以以水性悬液形式商品化而不需要使用有毒交联剂分子、冻干或其他干燥技术。另外，它们可容易地掺入广泛用于化妆品和制药工业中的许多剂型(例如，液体、半固体或固体)中。
本发明的纳米颗粒对包封不同类型分子如大亲水性化合物(例如，BSA)(实施例4)和小亲水性化合物(例如，罗丹明B)(实施例5)显示出高能力。然而，报道了一些与在聚合物的有机相(
Figure BPA0000181600080000568
AN在丙酮中的溶液)中
Figure BPA0000181600080000569
AN纳米颗粒用于合并水溶性药物的能力有关的困难。已知，水溶性药物在丙酮中是不溶的并且可形成大尺寸晶体，一旦添加水醇溶液以沉淀纳米系统形式的
Figure BPA00001816000800005610
AN，这些大尺寸晶体可妨碍纳米颗粒形成。因此，只有通过使药物与之前所形成的纳米颗粒孵育来使可溶性药物(5-氟尿苷(FURD))装载至
Figure BPA00001816000800005611
AN纳米颗粒中，因此获得了非常低封装效率(13％)。
另一方面，通过本发明优化了包含油的核-壳型囊状纳米胶囊的生产。柠檬精油有效地包封在本发明的纳米颗粒中(封装效率为约82％)并且由本发明提供的纳米胶囊(基于PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯)的平均尺寸是均匀的(约212nm)[实施例2]。
关于不良水溶性化合物，需要络合剂(例如环糊精(CD))或增溶剂(包括聚乙二醇和氨基酸(甘氨酸))以用于包封疏水性药物(例如，基于
Figure BPA00001816000800005612
AN的纳米颗粒中的紫杉醇)。事实上，如果没有使用络合剂或增溶剂，那么疏水性(亲脂性)化合物的封装效率低于所添加初始量的1％。通过双乳化技术制备的其他类型PVM/MA衍生物共聚物(例如，基于MS的微球)显示出疏水性化合物的低封装效率(对于三氯生而言约30％)。
然而，根据本发明，可以以高封装效率在基于PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的纳米颗粒(本发明)中包封在水中低溶解或几乎不溶解的化合物(例如，疏水性或亲脂性化合物)。实施例6、7和8举例说明了疏水性药物(例如，酮康唑(KTZ)、三氯生(TRI)和米诺地尔(MXD))在基于PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的纳米颗粒(本发明)中的合并。如所述实施例6～8所示，KTZ在所述纳米颗粒中的封装效率为所添加初始量的约97％(表6)，TRI的封装效率为约97％(表7)，以及MXD的封装效率为约72％(表8)。另外，施用用于生产原位自组装纳米颗粒(SANP)的原位自组装技术以包封三氯生；获得了三氯生在基于PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的SANP(本发明)中的高封装效率(约82％-表7)。所述药物(KTZ、TRI和MXD)与基于PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的纳米颗粒(本发明)的关系没有影响由所用初始量聚合物所形成纳米颗粒的百分比，其维持在95％或更高的范围内(表6～8)。另一方面，观察到使用基于PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的纳米颗粒(本发明)增加几乎没有水溶性或不良水溶性化合物溶解性，从而导致有效抑制相应药物在水性介质中的晶体形成。
实施例6公开了装载酮康唑的基于PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的纳米颗粒(本发明)的生产，所述纳米系统可施用为药物递送系统以用于几乎没有水溶性或不良水溶性抗真菌剂的控制释放。通过热高压均质技术获得携带酮康唑(KTZ)的固体脂质纳米颗粒(SLN)和纳米结构脂质载体(NLC)，但是KTZ的脂质制剂显示出一些物理和化学不稳定性。然而，由本发明提供的装载KTZ的基于PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的纳米颗粒(包含不同聚合物浓度的KTZ)是均匀的(平均尺寸为约200～235nm)，这表明无尺寸为约2～10μm的药物晶体。仅在通过与用于形成纳米颗粒的包含KTZ的PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯醇溶液相同方式处理KTZ醇溶液后观察到这些药物晶体。在通过扫描电子显微法(SEM)使KTZ晶体和装载KTZ的基于PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的纳米颗粒二者可视化时观察到该事实(图7)。使纳米颗粒在室温下放置至少2个月获得了SEM的类似结果，其中没有观察晶体生长或生产(图7C)。这些结果表明，装载KTZ的基于PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的纳米颗粒增强了疏水性药物(例如KTZ)的水溶解性并且抑制KTZ在所述纳米颗粒的最终水性悬液中结晶或沉淀。
类似地，三氯生(TRI)的封装效率为在根据溶剂置换法获得的装载TRI的基于PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的纳米颗粒(本发明)中所添加初始量的约97％以及对于由自组装技术获得的本发明的装载TRI的纳米颗粒而言为约80％。包含不同浓度(0.12％和0.2％(w/v))的TRI的由本发明所提供装载TRI的纳米颗粒在装载TRI的基于PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的纳米颗粒的水性悬液中的尺寸是均匀的(约140nm)，这表明无尺寸为约50～200μm的药物晶体(图8A)。仅在通过与用于形成纳米颗粒的包含TRI的PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的醇溶液相同方式处理TRI醇溶液后观察到这些药物晶体。在通过SEM使TRI晶体和装载TRI的基于PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的纳米颗粒二者可视化后观察到该事实(图8B)。这些结果表明，装载TRI的基于PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的纳米颗粒增强了疏水性药物如TRI的水溶解性，因为在纳米颗粒制剂中没有药物晶体。另外，在由本发明提供的所述纳米颗粒中的TRI的包含抑制TRI在所述纳米颗粒的最终水性悬液中的晶体形成(结晶)和沉淀。
不同研究描述了通过使用复杂的乳化技术和有毒有机溶剂在聚合微米颗粒和纳米颗粒中的TRI的包含。在该情况中，使用
Figure BPA0000181600080000581
E100作为聚合物通过溶剂置换法的乳化-分散来制备用于治疗痤疮的装载TRI的
Figure BPA0000181600080000582
纳米颗粒。虽然获得了高封装效率(95.5％)，但是纳米颗粒的生产需要复杂的技术，包括使用有毒有机溶剂(甲基乙基酮)的乳化方法[17]。类似地，通过使用聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)、聚(D，L-丙交酯)(PLA)和邻苯二甲酸乙酸纤维素(CAP)以及聚(乙烯醇)(PVA)作为稳定剂来制备装载TRI的纳米颗粒。基于非生物黏附聚合物如PLGA，设计这些装载TRI的纳米颗粒用于牙周治疗。封装效率为约63％并且施用复杂乳化-分散方法以获得纳米颗粒。另外，通过喷雾干燥方法制备包含TRI的壳聚糖/明胶微胶囊。通过双乳化溶剂蒸发技术来制备用于施用至口腔的装载TRI的聚合物微球，其中TRI掺入由MS-955、
Figure BPA0000181600080000584
974P、聚卡波非或壳聚糖制备的微球。通常，对于所用的所有聚合物而言TRI的药物装载效率为约30％，除了壳聚糖(约70％)；然而，报道了采用该技术包封TRI的一些困难，这是因为亲脂性TRI倾向迁移至外部油相中。
米诺地尔(MXD)通常用于治疗雄性秃。米诺地尔一般掺入溶剂的混合物，主要为丙二醇：乙醇：水。该表面治疗的典型副作用包括刺激性皮炎，伴随瘙痒、红斑、刮治和干燥，这尤其在治疗开始时发生。在一些情况中，已经报道了变应性接触性皮炎或脂溢性皮炎恶化。丙二醇(PG)可引起一些患者头皮瘙痒和刮治，这可能是包括刺激性接触性皮炎、变应性接触性皮炎或脂溢性皮炎恶化在内的这些症状的一般原因。
另一方面，发表的工作描述了与来自PG：乙醇：水(20：60：20，v/v)混合物之溶剂的蒸发有关的实验。包含该溶剂混合物之制剂的一个主要问题是在头皮上施用后的蒸发。施用后乙醇的蒸发可形成浓缩的PG，从而以实现过饱和，导致药物沉淀。所施用制剂的量影响浓度的比率和由此MXD沉淀的时间。沉淀限制了可被吸收的MXD的量并且导致药物的不良透皮吸收。类似地，其他研究讨论了蒸发时间及其与MXD浓度的关系，其中可在首次半小时后和2小时后蒸发乙醇，仅剩余的媒介物组分为PG。对于3％MXD溶液，对于整个2小时蒸发期间而言MXD留在媒介物中，但是晶种立即生产丰富的沉淀，确证了存在过饱和溶液。对于一些程度，MXD在头皮上的晶体形成可引起头皮屑等对毛发外观不美观的方面形成。
根据结果，这些结果在本发明中获得，其中进行宏观和微观总体测定以用于(i)具有不同赋形剂的包含MXD(2％)的装载MXD的基于PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的纳米颗粒(本发明)，(ii)包含乙醇、PG和水的MXD的市售制剂(
Figure BPA0000181600080000591
2％)，以及(iii)包含γ-环糊精、PG、乙醇和水的市售制剂(2％)。在该上下文中，从图10获得的数据表明对于纳米颗粒制剂(i)而言干燥前样品的外观是乳白色的并且对于市售产品(ii)和(iii)而言是透明的。然而，2小时干燥后，开始观察结晶膜，对于市售产品而言具有可视的大白色晶体层。包含具有甘油的由本发明提供的装载MXD的纳米颗粒的样品具有轻微乳白色美观外表，而没有任何结晶沉淀。另外，具有不同赋形剂(NPGES-MXDG、NPGES-MXD PEG和NPGES-MXD PG)的由本发明提供的装载MXD的纳米颗粒在12小时后没有形成干膜。然而，对于市售产品而言在2小时内和对于没有赋形剂的本发明的装载MXD的纳米颗粒而言在4小时内观察到了干燥沉淀。微观检查确证了宏观结果，其中，对于市售产品
Figure BPA0000181600080000593
2％和
Figure BPA0000181600080000594
2％而言在2小时内观察到了大晶体。对于装载MXD的纳米颗粒制剂的残余膜的外观之间有显著差异。在该情况中，没有赋形剂的本发明的装载MXD的纳米颗粒显示出有条纹的容易破裂的膜(NPGES-MXD)。对于包含赋形剂(例如丙二醇(PG)、甘油(G)或聚乙二醇400(PEG))的本发明的装载MXD的纳米颗粒的干膜而言没有观察到该现象。另外，对于包含本发明制剂的装载MXD的纳米颗粒的所有干膜而言没有检测到大晶体。以类似的方式，图11示出了对于本发明的装载MXD的纳米颗粒的制剂和对于市售产品进行SEM。从所述图11获得的数据正确地关联和确证图10中所获得的结果。对于市售产品(
Figure BPA0000181600080000601
2％和
Figure BPA0000181600080000602
2％)，观察到大晶体沉淀。另一方面，对于本发明的装载MXD的纳米颗粒的制剂(NPGES/MXD、NPGES/MXD G、NPGES/MXD PG和NPGES/MXD PEG)而言没有观察到大晶体[实施例8]。没有赋形剂的本发明的装载MXD的纳米颗粒(NPGES/MXD)和具有甘油的本发明的装载MXD的纳米颗粒(NPGES/MXD G)二者示出了存在包含纳米颗粒的均匀膜和均匀的平均粒径分布。令人惊讶地是，在包含具有PG或PEG的本发明的装载MXD的纳米颗粒的干膜中没有检测到纳米颗粒，这可能是因为水蒸发后聚合物在所述赋形剂中溶解。重要的是，应注意，对于包含PEG400的制剂，观察到一些大沉淀(聚合膜层)，这可能与聚合物的一些羧基与PEG的相互作用有关。所有膜是美观的和浅色黏附黏性质地。
另一方面，环糊精(CD)用于制备具有MXD的包含复合物，以研究MXD溶解性和皮肤透过性[21]。捕获羟丙基β-环糊精(HPβCD)/米诺地尔(MXD)的单油精(MO)立方相由熔融MO与复合物溶液水合来制备。通过使用
Figure BPA0000181600080000603
F127作为分散剂的浴式声处理来制备立方相的纳米颗粒。立方相中所装载MXD的体外皮肤透过比在PG/水/乙醇(20/30/50，v/v/v)中所溶解MXD的透过更高，但是采用MXD溶液的皮肤内所保持MXD的量比采用装载MXD纳米颗粒的更高。这些数据表明，虽然施用CD-MXD复合物，但是以比MXD溶液更少程度去掉具有结晶外观的头皮的剩余残余物。
总之，根据本发明，为了开发用于治疗雄性秃的药物递送系统，设计装载MXD的基于PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的纳米颗粒。与所测定一般市售制剂相比，装载MXD的基于PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的纳米颗粒(本发明)作为药物递送系统的最重要优点涉及便于制备、避免PG作为变应性媒介物以及头皮上没有晶体形成现象。
本发明的另一个目的涉及开发基于PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的生物黏附纳米颗粒，其能够在不同条件下长时间维持与毛发的黏附。所述纳米系统在化妆品中的应用可有益于递送分子至发干或者针对外部攻击性因素提供保护并且可增强毛发体积。结果表明，对于组1(M1)而言，所黏附级份在毛发样品上的量为9.5μg纳米颗粒/cm2毛发表面面积。在毛发样品的另一个组(M2)中，虽然纳米颗粒的所黏附级份的量通过毛发洗涤而降低，但是发现纳米颗粒仍黏附至毛发表面(3.5μg纳米颗粒/cm2毛发表面面积)。荧光和SEM(图12和13)确证了由本发明所提供装载MXD的纳米颗粒的悬液的初始强黏附亲和力。另外，M1组中在毛发表面上所黏附纳米颗粒的干膜抵抗洗涤和高温条件并且纳米颗粒维持黏附至毛发表面，如M2组所示。另外，包含本发明的装载MXD的纳米颗粒膜的毛发的外观美观、透明、有光泽并且在干燥后没有显示出任何黑色残余物(实施例9)。
最后，在猪动物模型的颊和舌黏膜中进行对装载MXD的基于PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的纳米颗粒(本发明)的立体生物黏附研究(实施例10)。该工作的目的集中于与参照
Figure BPA0000181600080000611
AN纳米颗粒相比测量纳米颗粒对黏膜表面的黏附级份和这些黏附系统的保持时间。图14表示在猪颊黏膜和舌背黏膜二者中对于PVM/MA共聚物的(C1-C4)半烷基酯(本发明)而言和对于
Figure BPA0000181600080000612
AN共聚物而言纳米颗粒制剂的黏附级份的累计数量(μgNP/cm2组织)。通常，装载MXD的基于PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的纳米颗粒(NP GESR)(本发明)比装载MXD的基于
Figure BPA0000181600080000613
AN的纳米颗粒(NP GANR)显示出更高的黏附能力。然而，两种类型的纳米颗粒在0小时时展现出类似的初始黏附力。然而，在1、2.5、4和6小时，在两种类型的猪黏膜中装载MXD的基于PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的纳米颗粒(本发明)的累计黏附级份比装载MXD的基于
Figure BPA0000181600080000614
AN的纳米颗粒的累计黏附级份高出约2～3倍。在包含纳米颗粒的凝胶制剂的情况中，观察到透明质酸盐凝胶使装载MXD的基于PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的纳米颗粒(GELNPGESR)的初始黏附能力比纳米颗粒悬液的增强了约2倍。另外，在1、2.5、4和6小时，对于包含装载MXD的基于PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的纳米颗粒的凝胶，观察到生物黏附能力显著增强。令人惊讶地是，在
Figure BPA0000181600080000615
AN凝胶制剂(GEL NPGANR)的情况中没有观察到该现象，其中水性悬液(NP GANR)和包含
Figure BPA0000181600080000616
AN纳米颗粒的凝胶(GELNP GAN)之间没有观察到显著差异。
图15显示出在施用一些经荧光标记纳米颗粒制剂0.5和2.5小时后两种颊黏膜组织的荧光显微图像。对照组织(没有纳米颗粒制剂)在组织中显示出低荧光强度(图15B)。装载罗丹明B的基于PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的纳米颗粒在颊黏膜的黏膜层在组织与唾液孵育0.5小时后展现出高荧光密度(图15C)，这在2.5小时时类似(图15E)。另一方面，
Figure BPA0000181600080000621
AN纳米颗粒的组织荧光强度在孵育后从0.5至2.5小时降低，大约类似于在施用后2.5小时的对照样品(图15D和15F)。这些数据确证，在颊黏膜中本发明的基于PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的纳米颗粒比基于
Figure BPA0000181600080000622
AN的纳米颗粒具有更高亲和力和更长停留时间。另外，观察到，在所有情况中，纳米颗粒没有穿透进入亚黏膜组织。
图16显示出在施用经荧光标记纳米颗粒制剂2.5小时时舌背黏膜表面的荧光显微图像。在类似于颊黏膜组织的组织中，基于PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的纳米颗粒在猪舌的背黏膜中(图16C和16D)比基于
Figure BPA0000181600080000623
AN的纳米颗粒(图16B)示出了更高的亲和力和更长的停留时间。
根据聚合物的表征，基于PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的纳米颗粒(例如，
Figure BPA0000181600080000624
ES)比基于其他聚合物的纳米颗粒对猪颊和舌黏膜模型表面展现出更高的黏附亲和力，这确保有效增强许多化合物的控制释放。令人惊讶地是，PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯以及基于所述聚合物的纳米颗粒对几乎没有水溶性或不良水溶性化合物具有共溶剂作用，导致疏水性药物(例如，KTZ、TRI或MXD)的封装效率的增加。因此，所述PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯表现出对合并亲水性和特别是疏水性化合物确保了高封装效率，而不需要使用共溶剂或络合剂。在其它特性当中，基于PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的纳米颗粒的黏附特性和水溶性使得所述纳米颗粒能够潜在地施用于许多工业，例如制药、化妆品、农业或食品工业，如控制释放目的产品递送系统至不同表面(包括毛发、皮肤、颊、口、鼻、阴道和直肠途径等)。
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Claims (21)

1.一种选自以下的纳米颗粒：
a)基质纳米球，其中所述基质纳米球包含基质，所述基质包含聚(甲基乙烯基醚-共-马来酸酐)(PVM/MA)共聚物的半(C1-C4)烷基酯；以及
b)核-壳型囊状纳米胶囊，其中所述核-壳型囊状纳米胶囊包含核和壳，所述壳包含PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯。
2.根据权利要求1所述的纳米颗粒，其中(C1-C4)烷基为乙基、异丙基或正丁基。
3.根据权利要求1所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒的平均尺寸为50nm至300nm，优选100nm至200nm，更优选120nm至160nm，仍更优选约130nm至140nm。
4.根据权利要求1所述的纳米颗粒，其还包含目的产品。
5.一种组合物，其包含至少一种根据权利要求1至4中任一项所述的纳米颗粒以及载体。
6.根据权利要求5所述的组合物，其中所述载体为在农业、化妆品、食品或药学上可接受的载体。
7.根据权利要求6所述的组合物，其中所述纳米颗粒包含目的产品。
8.根据权利要求7所述的组合物，其中所述目的产品为除草剂，杀虫剂，杀真菌剂，抗衰老产品，抗痤疮产品，面部护理产品，色素性化妆品，美容品，个人护理产品，遮光/防晒产品，牙清洁、牙膏或漂洗产品，洗发产品，香水，毛发用产品，叶酸，4-氨基苯甲酸，烟酸或维生素B3，泛酸或维生素B5，单磷酸硫胺，焦磷酸硫胺，三磷酸硫胺，抗坏血酸，蝶酰聚谷氨酸，亚叶酸，尼克酸，透明质酸，硫辛酸，对香豆酸，咖啡酸，A、D、E、K族的维生素及其衍生物，磷脂，类胡萝卜素，脂肪酸，Ω-3脂肪酸，氨基酸，植物甾烷醇，植物甾醇，多酚，镇痛剂，抗脱发剂，抗心绞痛剂，抗细菌剂，抗抑郁剂，抗真菌剂，抗高血压剂，抗炎剂，抗肿瘤剂，解热剂，抗精神病剂，抗焦虑剂，支气管扩张剂，糖皮质激素，免疫抑制剂，或其任意组合。
9.一种组合物，其包含：
a)选自以下的组分：
i.至少一种根据权利要求1至4中任一项所述的纳米颗粒；及
ii.在介质中包含聚(甲基乙烯基醚-共-马来酸酐)(PVM/MA)共聚物的半(C1-C4)烷基酯和目的产品的溶液或悬液，所述介质包含挥发性水可混溶的醇和水性介质，其中所述水性介质的量低于形成纳米颗粒所需水性介质的量；以及
b)载体，
其中所述目的产品选自乙酰水杨酸、α-心房利钠肽、精氨酸血管升压素、阿托品、奥格莫森、阿托伐他汀、(贝伐单抗)、降钙素、绒毛膜促性腺激素、促肾上腺皮质激素、去氨加压素、地棘蛙素、
Figure FPA0000181600070000022
(西妥昔单抗)、艾塞那肽、(曲妥珠单抗)、
Figure FPA0000181600070000024
(阿达木单抗)、酮康唑、兰乐肽、促黄体素α、美托洛尔、米诺地尔、奈西立肽、奥曲肽、紫杉醇、对乙酰氨基酚、哌加他尼、重组促卵泡激素、重组生长因子、
Figure FPA0000181600070000026
(英夫利昔单抗)、
Figure FPA0000181600070000027
(利妥昔单抗)、舍莫瑞林、促生长素、紫杉烷衍生物、泰素、醋酸特立帕肽、促甲状腺素、三氯生、尿促卵泡素、
Figure FPA0000181600070000028
(奥马珠单抗)、放线菌素D、阿苯达唑、醛固酮、阿普唑伦、胺碘酮、阿米替林、安普那韦、阿西马朵林、阿托伐他汀、布尼洛尔、丁螺环酮、喜树碱、卡马西平、卡维地洛、塞利洛尔、环孢素A、西米替丁、克霉唑、秋水仙碱、可的松、柔红霉素、异喹胍、地塞米松、地西泮、洋地黄毒苷、地高辛、地尔硫卓、多西他赛、多潘立酮、多柔比星、依法韦仑、表柔比星、红霉素、麦角胺、雌二醇、葡萄糖醛酸雌二醇、厄洛替尼、依托泊苷、苯妥英、芬太尼、非洛地平、吩噻嗪类、非索非那定、氟喹诺酮类、氟尿嘧啶、FK-506、庆大霉素、灰黄霉素、氢化可的松、伊马替尼、茚地那韦、伊曲康唑、伊维菌素、酮康唑、山奈酚、左氧氟沙星、利多卡因、洛哌丁胺、氯沙坦、洛伐他汀、甲苯达唑、甲泼尼龙、甲氨蝶呤、咪拉地尔、咪达唑仑、尼索地平、吗啡、那非那韦、尼卡地平、尼群地平、硝苯地平、昂丹司琼、紫杉醇、喷他佐辛、吡喹酮、泼尼松龙、泼尼松、槲皮素、奎尼丁、雷尼替丁、雷帕霉素、利福布汀、利福平、利托那韦、沙奎那韦、西罗莫司、磺胺甲二唑、他克莫司、他莫昔芬、他林洛尔、替尼泊苷、特非那丁、四环素、拓扑替康、曲安西龙、伐司朴达、维拉帕米、长春碱、长春新碱、长春地辛、佐匹克隆及其混合物。
10.根据权利要求5至9中任一项所述的组合物，其中所述组合物为干燥粉末形式。
11.根据权利要求5所述的组合物，其中所述载体包括用于通过颊、齿、鼻、眼、口、肠胃外、直肠、表面或阴道途径施用的可药用赋形剂或者用于通过表面途径施用的可美容用赋形剂。
12.一种包含根据权利要求1至4中任一项所述纳米颗粒的食品。
13.根据权利要求4所述的纳米颗粒，其用于治疗脱发，其中所述目的产品为米诺地尔。
14.根据权利要求4所述的纳米颗粒，其用于治疗颊感染，其中所述目的产品为三氯生或酮康唑。
15.一种根据权利要求4所述纳米颗粒在用于制造治疗脱发的药物中的用途，其中所述目的产品为米诺地尔。
16.一种根据权利要求4所述纳米颗粒在用于制造治疗颊感染的药物中的用途，其中所述目的产品为三氯生或酮康唑。
17.一种在对象中治疗脱发的方法，其包括向所述对象施用装载有米诺地尔的根据权利要求4所述的纳米颗粒。
18.一种在对象中治疗颊感染的方法，其包括向所述对象施用装载有三氯生或酮康唑的根据权利要求4所述的纳米颗粒。
19.一种用于生产包含基质的基质纳米球的方法，所述基质包含聚(甲基乙烯基醚-共-马来酸酐)(PVM/MA)共聚物的半(C1-C4)烷基酯，所述方法包括使包含PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的有机溶液或悬液与水性介质相接触以形成所述基质纳米球。
20.一种用于生产包含目的产品的基质纳米球的方法，其中所述基质纳米球包含基质，所述基质包含聚(甲基乙烯基醚-共-马来酸酐)(PVM/MA)共聚物的半(C1-C4)烷基酯，所述方法包括：
a)使包含所述目的产品和所述PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的醇或水醇、溶液或悬液与水性介质相接触；或者，可替换地，
b)使包含所述目的产品和所述PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的醇溶液或悬液与水性介质相接触；或者，可替换地，
c)使包含所述目的产品和所述PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的有机溶液或悬液与水性介质相接触，其中所述有机溶液或悬液包含非挥发性水可混溶的溶剂。
21.一种用于生产包含目的产品的核-壳型囊状纳米胶囊的方法，其中所述核-壳型囊状纳米胶囊包含核和壳，所述壳包含PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯，所述方法包括使包含所述目的产品和所述PVM/MA共聚物的半(C1-C4)烷基酯的溶液或悬液与水性介质相接触。
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