CN103614458A - 生物分子检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents
生物分子检测试剂盒及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103614458A CN103614458A CN201310485815.9A CN201310485815A CN103614458A CN 103614458 A CN103614458 A CN 103614458A CN 201310485815 A CN201310485815 A CN 201310485815A CN 103614458 A CN103614458 A CN 103614458A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- biomolecule
- trithioadamantane
- detection kit
- substrate
- biomolecule detection
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 33
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 9
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 34
- 239000010931 gold Substances 0.000 claims abstract description 34
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 claims abstract description 34
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 22
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims abstract description 14
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims abstract description 14
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 20
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 19
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 13
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 claims description 9
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 claims description 9
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 8
- 239000010409 thin film Substances 0.000 claims description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 6
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 5
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 5
- 239000002082 metal nanoparticle Substances 0.000 claims description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 2
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 claims description 2
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 claims description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 claims 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 abstract description 18
- ORILYTVJVMAKLC-UHFFFAOYSA-N adamantane Chemical class C1C(C2)CC3CC1CC2C3 ORILYTVJVMAKLC-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 4
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 abstract description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 abstract description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 abstract description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 abstract 2
- 229940052761 dopaminergic adamantane derivative Drugs 0.000 abstract 2
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 abstract 1
- 125000004434 sulfur atom Chemical group 0.000 abstract 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 28
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 22
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 20
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 17
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 14
- QMMFVYPAHWMCMS-UHFFFAOYSA-N Dimethyl sulfide Chemical compound CSC QMMFVYPAHWMCMS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- WMFOQBRAJBCJND-UHFFFAOYSA-M Lithium hydroxide Chemical compound [Li+].[OH-] WMFOQBRAJBCJND-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 9
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 9
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 9
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 8
- BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L potassium carbonate Chemical compound [K+].[K+].[O-]C([O-])=O BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 8
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 8
- 0 O*(C1(CC2S3)CC3S22SC2C1)=O Chemical compound O*(C1(CC2S3)CC3S22SC2C1)=O 0.000 description 7
- CBENFWSGALASAD-UHFFFAOYSA-N Ozone Chemical compound [O-][O+]=O CBENFWSGALASAD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 7
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 6
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- -1 (2-oxoethyl) ethyl Chemical group 0.000 description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 5
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 5
- FCMCSZXRVWDVAW-UHFFFAOYSA-N 6-bromo-1-hexanol Chemical compound OCCCCCCBr FCMCSZXRVWDVAW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 4
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 4
- ZSIAUFGUXNUGDI-UHFFFAOYSA-N hexan-1-ol Chemical compound CCCCCCO ZSIAUFGUXNUGDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 4
- CYQAYERJWZKYML-UHFFFAOYSA-N phosphorus pentasulfide Chemical compound S1P(S2)(=S)SP3(=S)SP1(=S)SP2(=S)S3 CYQAYERJWZKYML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910000027 potassium carbonate Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- PEJYBCGKOCTZCS-UHFFFAOYSA-N CC(C)N(C(C)C)P(O)OCCC#N.Cl Chemical compound CC(C)N(C(C)C)P(O)OCCC#N.Cl PEJYBCGKOCTZCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 238000002330 electrospray ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 3
- 238000003818 flash chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000001644 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy Methods 0.000 description 2
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N aluminium oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000007810 chemical reaction solvent Substances 0.000 description 2
- 229940125782 compound 2 Drugs 0.000 description 2
- 229940126214 compound 3 Drugs 0.000 description 2
- 229940125898 compound 5 Drugs 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 2
- TWNQGVIAIRXVLR-UHFFFAOYSA-N oxo(oxoalumanyloxy)alumane Chemical compound O=[Al]O[Al]=O TWNQGVIAIRXVLR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 235000012736 patent blue V Nutrition 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 2
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 2
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 2
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 2
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 2
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- UUXPDMITYLHMRQ-UHFFFAOYSA-N BrC(Br)=CC1(CC2S3)CC3S3C2SC3C1 Chemical compound BrC(Br)=CC1(CC2S3)CC3S3C2SC3C1 UUXPDMITYLHMRQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UGVGCFCJWDAERA-UHFFFAOYSA-N BrC1(CC2S3)CC3S3C2SC3C1 Chemical compound BrC1(CC2S3)CC3S3C2SC3C1 UGVGCFCJWDAERA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MLUDLMCNMLEPBZ-UHFFFAOYSA-N CC(C(C1)(C2)CC3SC2SC1S3)=O Chemical compound CC(C(C1)(C2)CC3SC2SC1S3)=O MLUDLMCNMLEPBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XJISIJXDWQYHTF-UHFFFAOYSA-N CC(C)N(C(C)(C)CCC#N)P(O)O.Cl Chemical compound CC(C)N(C(C)(C)CCC#N)P(O)O.Cl XJISIJXDWQYHTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- BFLFPFYBXZLBNS-UHFFFAOYSA-N NC(C1(CC2S3)CC3S22SC2C1)=O Chemical compound NC(C1(CC2S3)CC3S22SC2C1)=O BFLFPFYBXZLBNS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KZFAWCICHHADIT-UHFFFAOYSA-N SC1(CC2S3)CC3S3C2SC3C1 Chemical compound SC1(CC2S3)CC3S3C2SC3C1 KZFAWCICHHADIT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004847 absorption spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- OBNCKNCVKJNDBV-UHFFFAOYSA-N butanoic acid ethyl ester Natural products CCCC(=O)OCC OBNCKNCVKJNDBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000001460 carbon-13 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 1
- 150000001793 charged compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- QKIUAMUSENSFQQ-UHFFFAOYSA-N dimethylazanide Chemical compound C[N-]C QKIUAMUSENSFQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 230000005518 electrochemistry Effects 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 1
- 238000002329 infrared spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000005040 ion trap Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000004973 liquid crystal related substance Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000007769 metal material Substances 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- AIDQCFHFXWPAFG-UHFFFAOYSA-N n-formylformamide Chemical compound O=CNC=O AIDQCFHFXWPAFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002120 nanofilm Substances 0.000 description 1
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012299 nitrogen atmosphere Substances 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- AICOOMRHRUFYCM-ZRRPKQBOSA-N oxazine, 1 Chemical compound C([C@@H]1[C@H](C(C[C@]2(C)[C@@H]([C@H](C)N(C)C)[C@H](O)C[C@]21C)=O)CC1=CC2)C[C@H]1[C@@]1(C)[C@H]2N=C(C(C)C)OC1 AICOOMRHRUFYCM-ZRRPKQBOSA-N 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 238000006213 oxygenation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 238000002371 ultraviolet--visible spectrum Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54353—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals with ligand attached to the carrier via a chemical coupling agent
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种生物分子检测试剂盒及其制备方法。所述试剂盒包括：对选定靶标物具有特异性识别功能的生物分子基体，以及，连接在生物分子基体上的至少一个有机分子，其中至少一个有机分子选自三硫代金刚烷衍生物。进一步的，所述生物分子基体经所述三硫代金刚烷衍生物连接在选定基底，特别是金基底上。本发明通过将生物分子探针与三硫代金刚烷衍生物结合，从而使生物分子可通过三个硫对金属表面进行螯合，进而获得极高的金属表面包被的稳定性(如化学、光学、温度、生物稳定性，电化学和电学稳定性)，从而利于相关检测试验的顺利进行，并提升相关试验结果的精确度，且还能提升所述生物分子检测试剂盒的货架储存时间。
Description
技术领域
本发明具体涉及一种生物分子检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
目前业界已经发展出多种通过将生物分子连接于金纳米粒子，铂表面的金纳米粒子，金电极、金纳米薄膜等材料的表面，继而构建生物检测试剂盒、传感器或者三维纳米结构材料的技术。在现有的这些技术中，生物分子与金材料的连接通常是通过连接在生物分子上的单个或多个巯基对金表面的强吸附实现的，但因巯基化学稳定性差，极易受氧气、光照作用而降解，并产生副产物，继而干扰后续反应的进行或影响试验的精密度。
例如，对于现有的基因检测试剂盒，其中很多是通过将寡聚核苷酸探针连接于金纳米粒子、金薄膜等基体上，再通过观测该等寡聚核苷酸探针与目标DNA的结合情况(如，结合稳定性)而实现的，但由于前述的缺陷，往往导致检测结果不甚理想。
发明内容
鉴于现有技术中的不足，本发明的主要目的在于提供一种新型的生物检测试剂盒及其制备方法。
为实现上述发明目的，本发明采用了如下技术方案：
一种生物分子检测试剂盒，包括：
对选定靶标物具有特异性识别功能的生物分子基体，以及
连接在生物分子基体上的至少一个有机分子，其中至少一个有机分子选自三硫代金刚烷衍生物。
作为优选的实施方案之一，所述生物分子基体经所述三硫代金刚烷衍生物 连接在选定基底上。
进一步的，所述选定基底至少选自金属纳米粒子、金属薄膜芯片中的任一种，所述金属包括金，但不限于此。
所述生物分子基体可选自但不限于核酸，多肽和蛋白质中的任一种。
一种生物分子检测试剂盒的制备方法，包括：
提供对选定靶标物具有特异性识别功能的生物分子基体，以及
在所述生物分子基体上连接至少一个有机分子，并且其中至少一个有机分子选自三硫代金刚烷衍生物。
进一步的，该方法包括：将所述生物分子基体经所述三硫代金刚烷衍生物连接在选定基底上，
所述选定基底至少选自金属纳米粒子、金属薄膜芯片中的任一种，所述金属包括金。
一种生物分子检测试剂盒的制备方法，包括：
提供一种以上寡核苷酸探针，该一种以上寡核苷酸探针至少具有与靶标DNA分子的局部区域互补的序列；以及
将其中至少一种寡核苷酸探针通过三硫代金刚烷衍生物连接至金基体表面。
前述三硫代金刚烷衍生物具有如下结构式：
其中，R包括任意基团。
所述三硫代金刚烷衍生物至少选自如下化合物中的任一种：
其中，
为分子间连接间隔，Y包括药物、氨基酸、多肽、代谢中间体、纳米构建物中的任意一种或两种以上的杂交体。
例如，所述三硫代金刚烷衍生物可选自下列化合物中的任一种：
作为较为优选的实施方案之一，该三硫代金刚烷衍生物的制法工艺路线可以参阅图8，包括：
其中，a步骤的工艺条件包括：在温度为-78℃以下的条件下，在含有甲基-2,2-二烯丙基戊-2-酸甲酯的有机溶剂中通入臭氧至反应完全，其后加入二甲基硫醚至完全反应；
b步骤的工艺条件包括：将甲基-4-氧代-2，2-双(2-氧代乙基)丁酸乙酯与五硫化二磷和三氧化二铝在有机溶剂中充分反应，再依次进行过滤、洗涤和纯化处理；
c步骤的工作条件包括：将7-甲氧基羰基-2,4,9-三硫代金刚烷与强碱在选定反应溶剂中充分反应，其后将反应混合物酸化，再依次进行过滤、洗涤、纯化处理，所述选定反应溶剂包括体积比为3：3：1的四氢呋喃，甲醇和水的混合物；
d步骤的工作条件包括：将7-羟基羰基-2,4,9-三硫代金刚烷和无水碳酸钾于无水二甲酰胺中混合反应，再缓慢加入6-溴己醇，室温搅拌至反应完成后，除去溶剂，再进行纯化处理；
e步骤的工作条件包括：将7-(6’-羟基-己烷基)-羰基-2,4,9-三硫代金刚烷与二异丙基乙基胺在有机溶剂中充分反应后，再加入2-氰乙基二异丙基氯化亚磷酰胺，之后进行浓缩、纯化处理；
所述有机溶剂包括无水二氯甲烷。
进一步的，作为较为典型的应用实例，该制法可以包括如下步骤：
(1)在温度为-78℃的条件下，向无水二氯甲烷中加入甲基-2,2-二烯丙基戊-2-酸甲酯，并通入臭氧进行反应至溶液颜色变为天蓝色，而后除去过量的臭氧，至溶液变成无色，再将二甲基硫醚逐滴加入到反应混合物中，在室温下搅拌过夜，然后除去溶剂得到黄色粘稠固体，其后将所获黄色粘稠固体溶解于乙腈中，在搅拌下，缓慢加入五硫化二磷和碱性氧化铝的混合物，生产的浆液的混合物 回流25h以上，然后将反应混合物过滤，用乙酸乙酯冲洗后过滤，收集滤液，经色谱分离，获得2,4,9-三硫代金刚烷-7-羧酸甲酯；
(2)将2,4,9-三硫代金刚烷-7-羧酸甲酯与无水氢氧化锂混合。溶解该混合物在搅拌下用十二烷基硫酸钠，甲醇，水的比为3时03分01秒中的溶液，并回流过夜。然后将混合物酸化，用浓盐酸调节pH值为2，并使其冷却，在4℃的冰箱中过夜后，将溶液过滤，并用水洗涤，得到2,4,9-三硫代金刚烷-7-羧酸；
(3)将2,4,9-三硫代金刚烷-7-羧酸与无水碳酸钾溶解在无水二甲基甲酰胺中，之后取6-溴己醇逐滴加入到反应混合物中，在室温下搅拌至反应完成后，除去溶剂，再经纯化后，获得2,4,9-三硫代金刚烷-7-羧酸酸己-1-醇；
(4)将2,4,9-三硫代金刚烷-7-羧酸酸己-1-醇溶解在无水二氯甲烷中，并加入二异丙基乙基胺，在氮气氛下搅拌，然后将混合物冷却到0-2℃下，再加入2-氰乙基二异丙基氯化亚磷酰胺，待充分反应后，向反应混合物中加入碳酸氢钠溶液充分振荡，收集有机相，并还原，得到的粗产物经闪式柱色谱法纯化，
得到2,4,9-三硫代金刚烷-7-羧酸己烷亚磷酰胺。
前述三硫代金刚烷衍生物在连接生物分子与金属材料中的应用，所述生物分子包括核酸，多肽或蛋白质，所述金属材料包括金。
一种非标记SNP检测方法，包括：
将两种以上寡核苷酸经权利要求1所述三硫代金刚烷衍生物连接到金纳米粒子表面，该两种以上寡核苷酸分别包含与目标DNA中两个以上不同区域内的序列互补的序列；
而后，将复数个表面连接有该两种以上寡核苷酸的金纳米粒子置于适于进行寡核苷酸杂交反应的环境中，并加入目标DNA进行杂交反应，而后在室温下静置至发生粒子凝集，再通过测量吸收光谱对温度的变化并获得由杂交反应形成的体系的“熔点”，继而实现SNP的检测。
与现有技术相比，本发明至少具有如下优点：通过将生物分子探针与三硫代金刚烷衍生物结合，从而使生物分子可通过三个硫对金属表面进行螯合，进而获得极高的金属表面包被的稳定性(包括但不限于化学稳定性，光学稳定性，温度稳定性，生物稳定性，电化学和电学稳定性)，从而利于相关检测试验的顺利进行，并提升相关试验结果的精确度，且还能提升所述生物分子检测试剂盒 的货架储存时间。
附图说明
图1是本发明典型实施实施方式之一的原理图；
图2a是本发明典型实施实施方式之二的原理图；
图2b是本发明典型实施实施方式之三的原理图；
图2b是本发明典型实施实施方式之四的原理图；
图3是本发明典型实施实施方式之五的原理图；
图4a是本发明一典型实施例的原理图；
图4b是本发明一典型实施例的吸收光谱图；
图5a是本发明一实施例中利用三硫代金刚烷寡核苷酸稳定的金纳米粒子探针探测目标DNA(完全互补)的温度-吸收度图谱；
图5b是本发明一实施例中利用三硫代金刚烷寡核苷酸稳定的金纳米粒子探针探测目标DNA(1个碱基非匹配)的温度-吸收度图谱；
图6a是本发明一实施例中利用三硫代金刚烷寡核苷酸稳定的金纳米粒子探针探测目标DNA(完全互补)的温度-吸收度图谱；
图6b是本发明一实施例中利用三硫代金刚烷寡核苷酸稳定的金纳米粒子探针探测目标DNA(1个碱基非匹配)在不同温度下的吸收光谱图；
图7a是本发明典型实施实施方式之六的原理图；
图7b是本发明典型实施实施方式之六中不同反应时间的光谱图。
图8是本发明一典型实施例的工艺流程图。
具体实施方式
如前所述，本发明系提供了一种2,4,9-三硫代杂-[3.3.1.13,7]三环癸烷-7-羧酸酯(亦可命名为“三硫代金刚烷衍生物”)，利用其所含有的三个硫对金属表面进行螯合，获得极高的金属表面包被的稳定性，而通过将其应用于生物、化学分子或基团与金材料的连接，可以有效提升基于该连接而实现的各类反应的效果，如，反应的效率、结果的准确性等等。
作为其中的应用方案之一，本发明可以应用于基因测序，通过分析DNA双螺旋的热稳定性，在一个20-30碱基DNA序列中检测出单个基因基因序列变异 的方法。该方法(如，SNP检测)已被广泛运用于在遗传性疾病的诊断，法医检验，和病源微生物的鉴定等方面。
参阅图1及图2a-2b，前述的该典型实施方式可以包括：利用三硫代金刚烷作为寡核苷酸检测的金表面上附着的寡核苷酸分子表面锚，而通过紫外-可见吸收光谱(UV-Vis)和表面等离子体共振光谱(SPR)可以证明该法的可靠性和使用上的简便性。
以下结合若干实施例及附图对本发明的技术方案作进一步的说明。
需要指出的是，如下实施例中所采用的常用试剂均购自Sigma Aldrich公司和Themo Fisher,并直接使用。柠檬酸稳定的13纳米的黄金纳米粒子的制备按照以前的文献。寡核苷酸是从Integrated DNA Technologies购买。使用的所有溶剂均为试剂级，并在使用前进行蒸馏。用于所有的实验中的Nanopure超净水(Milli-Q系统)的电阻高于18MΩ。所有空气和湿气敏感的反应，在干燥氮气下进行。在Varian Gemini300光谱仪上记录1H NMR(300兆赫)和13C NMR谱(75兆赫)。红外光谱在Nicolet NEXUS870FT-IR光谱仪收集。ATP-IR是在上述设备上配备一个Thunderdom ATR附件。一台配有TCC240A温控系统的日本岛津UV1800分光光度计被用于UV-Vis紫外可见光谱和DNA熔解曲线。电喷雾质谱分析(ESI-MS)是在一台Bruker Esquire液相层析-离子阱质谱联动仪上获得。SPR测量进行自定义内置四通道流通池，SPR传感器，基于波长解调(1波长移对应～150pg／mm2表面覆盖生物分子吸附)。透射电子显微镜图像是用JEOL JEM1230透射电子显微镜拍摄的。
当然，依据本说明书的内容，本领域技术人员亦可很容易的想到采用其它市售或自制途径所获的各类试剂或试验设备等替代前述试剂或设备，因此其不应构成对本发明所要求保护范围的任何限制。
本实施例的合成路线可以参阅图8，其中步骤a-e所示的反应条件如下：(a)：臭氧，二氯甲烷，-78℃，二甲基硫醚；(b)：五硫化二磷和三氧化二铝在乙腈中加热回流；(c)；氢氧化锂在四氢呋喃，甲醇和水的混合物(THF：MeOH：H2O＝3：3：1)，加热回流，然后加6当量盐酸中和；(d)6-溴己醇，无水碳酸钾，二甲酰胺；(e)2-腈乙基-N，N-二异丙基氯化亚磷酰胺，二异丙基乙胺，二氯甲烷。
进一步的，前述合成路线可通过如下更为具体的实施例而实现：
2,4,9-三硫代金刚烷-7-羧酸甲酯(化合物2)的合成：
干冰和丙酮(-78℃)15分钟，在干冰浴中搅拌过的溶液(3.00克，15.4毫摩尔)甲基-2,2-二烯丙基戊-2-酸甲酯在无水二氯甲烷(150mL)中加化合物1。进行臭氧反应，臭氧气体鼓泡通入澄清的黄色溶液，直到颜色改变为天蓝色，标记反应完成。通氮气除去过量的臭氧，直到它变成无色。再将二甲基硫醚(4毫升，61.6毫摩尔)逐滴加入到反应混合物中，然后将容器从除去冰浴，在室温下搅拌过夜。然后将溶剂在减压下除去，得到黄色粘稠固体，然后将其重新溶解于乙腈(100mL)中。在搅拌下，缓慢加入五硫化二磷(7.53克，16.9毫摩尔)和碱性氧化铝(16.0克)的混合物生产的浆液的混合物回流25小时。然后将反应混合物过滤，用温热的乙酸乙酯冲洗并减压过滤液得到粗产物，将其用快速色谱柱分离法，使用乙酸乙酯和己烷的5％-25％的梯度。进而获得2,4,9-三硫代金刚烷-7-羧酸甲酯(1.15克，产率30％)。相应表征数据如下：1H NMRδ：2.90(6H，d，CH2)，3.74(s，3H，OCH)，4.32(w，3H，)PPM；FTIR(ATR)：1723(C=O)，2941(脂肪CH)，2900(脂族CH)em-1处。
2,4,9-三硫代金刚烷-7-羧酸(化合物3)的合成。在圆底烧瓶中加入化合物2(0.575克，2.31毫摩尔)与无水氢氧化锂(0.506克，21.1毫摩尔)，并加入二烷基硫酸钠和由体积比为3：3：1的四氢呋喃，甲醇和水组成的溶液，并回流过夜。然后将混合物酸化(用浓盐酸至pH为2)，并使其冷却，在4℃的冰箱中过夜，将溶液过滤，并用冰冷的水洗涤，得到浅黄色的产物2,4,9-三硫代金刚烷-7-羧酸(0.48克，89％)。相应表征数据如下：1H NMRδ：2.93(6H，D，CH2)，4.38((宽)，3H？)PPM；红外(ATR)：1710(C=O)，2920(脂肪族CH)，2933(脂肪族CH)2700-3200(宽，OH)em-1处。
3、2,4,9-三硫代金刚烷-7-羧酸酸己-1-醇(化合物4)的合成。化合物3(0.30克，1.2毫摩尔)和无水碳酸钾(0.53克，3.8毫摩尔)溶解在无水二甲基甲酰胺(6mL)中，在氮气氛下将溶液搅拌30分钟，然后将6-溴己醇(0.184毫升，1.41毫摩尔)逐滴加入到反应混合物中，然后在室温下搅拌过夜。通过TLC监测反应完成。反应完成后，在减少溶剂在真空下蒸干，粗产物用前述快速色谱柱分离法(乙酸乙酯／己烷，1：3)纯化，得到油状的或液晶状的产品(0.28克，产率68％)。其表征数据如下：1H NMRδ：2.90(q，6H，CH2)，4.33((宽峰))，3H，CH)，3.66(t，2H，OCH2)，4.14(t，2H，OCH2)，1.68(2H m，CH2)，1.59(m，2H，CH2)，1.41(m，4H，CH2)PPM。13C NMRδ：175.20，65.37，62.87，41.36，40.07，38.63，32.73，28.69，25.91，25.59。红外：1725(C=O)，2934(脂肪族CH)2859(脂肪CH)，3323-3500(宽，OH)cm-1处。
2,4,9-三硫代金刚烷-7-羧酸己烷亚磷酰胺(化合物5)的合成。将化合物4(0.23克，0.667毫摩尔)溶解在无水二氯甲烷(10mL)中，并加入二异丙基乙基胺(0.2毫升，1.16毫摩尔)，在在氮气氛下搅拌。然后将混合物放置在冰浴上冷却到0-2℃下，持续搅拌，且同时通过注射器逐滴加入2-氰乙基二异丙基氯化亚磷酰胺(0.152毫升，0.84毫摩尔)，加完后，将反应混合物从冰浴中去除，并在室温下搅拌3小时。通过TLC监测反应进程。反应完成后，将产物用碳酸氢钠溶液(0.5M，2×10毫升)，收集有机相，并还原，得到的粗产物，用乙酸乙酯和1％三乙胺的己烷5％-25％梯度，经前述快速色谱柱分离纯化。得到油状产物(0.186克，52％)，其表征数据如下：1H NMRδ：4.33((宽峰))，3H，CH)，4.13(吨，2H，OCH2)，3.81(米，2H，NCH)，3.61(米，4H，OCH2)， 2.90(四，6H CH2)，2.65(I，2H，CH2CN)1.64(M，4H，CH2)，1.40(M，4H，CH2)，1.18(D，12H，CH3)PPM。13C NMRδ：175.05，119.5，65.17，63.27，45.95，45.88，41.36，39.98，38.55，30.51，28.57，25.66，25.47，23.69，22.48PPM。红外：1719(C=O)，2253(CN)，2950(脂肪族CH，2929(脂肪族CH)，cm-1。ESI-MS：计算值(M+)557.75发现557.5。
合成三硫代金刚烷寡核苷酸：
本实施例中系使用亚磷酰胺固相寡核苷酸合成方法获得所需的寡核苷酸链，参阅图1，其以三硫代金刚烷亚磷酰胺(化合物5)作为最后的一个碱基。然后按标准的去保护和纯化方法得到末端为三硫代金刚烷的所需寡核苷酸单链，该方法可以用在DNA和RNA的单链合成上。
而基于该三硫代金刚烷寡核苷酸，可设计出分子探针检验试剂盒，例如，在一更为具体的应用例中，可采用夹心法，即：将选定的目标序列(30个碱基)分为两段，分别合成两个单链(甲和乙)的互补序列的单链去氧核糖核酸，每个由15碱基组成。
三硫代金刚烷寡核苷酸包被纳米金粒子的制备：
将上述三硫代金刚烷寡核苷酸与平均直径为在13纳米的以柠檬酸稳定的金纳米粒子(约17nmol)在室温下孵育16小时，其中三硫代金刚烷寡核苷酸的浓度为3.5微摩尔，获得寡核苷酸的金纳米探针的水溶液，然后使该溶液中含有0.1M NaCl，并加入pH7.4的10mM磷酸盐缓冲液，静置48小时。将溶液在20000g离心30分钟，分离出的纳米颗粒在离心管的底部，呈油状的红色沉淀，而过剩的寡核苷酸则滞留于滤液中。将分离出的纳米颗粒再悬浮于含0.1M NaCl，10mM磷酸盐的缓冲液中(pH7.4)，重复离心和再分散(最多两次)，最后再悬浮于含0.3M NaCl、10mM磷酸盐和0.01％叠氮化钠的缓冲液(pH7.4)中。在SNP检验方法中，检测对象为非标记的ssDNA序列，在此为30个碱基。探针的设计是将该30个碱基对分成两半，从而设计出三硫代金刚烷寡核苷酸探针甲，其末端带有15个碱基的scDNA和检测对象的一半ssDNA互补。三硫代金刚烷寡核苷酸探针乙的末端带有另外15个碱基，和另一半的ssDNA互补。探针甲和探针乙包被的纳米粒子，其特征的可见吸收峰在530纳米。
基于纳米金粒子的DNA探针和目标寡核苷酸杂交和熔点分析：
非标记的SNP检测的方法是将两个互补序列的单链去氧核糖核酸包被的金纳米粒子(甲和乙)和目标序列在溶液里混合，在55-60℃的水浴中加热5分钟，并在室温下静置，直到发生了粒子凝集(约2～3小时)。通过测量吸收光谱对温度的变化并获得该凝聚系统的“熔点”，该方法可准确测量出单个碱基对的变异(SNP)。
参阅图5a-图6b，其中所使用三硫代金刚烷寡核苷酸稳定的金纳米粒子探针来探测一个由30个碱基的目标序列：A图是甲乙探针和目标序列完全互补，B图是甲乙探针和目标序列完全非互补，和C是甲乙探针和目标序列有一个碱基不互补的目标序列进行杂交的试验。
由于这两种探针的寡核苷酸链的5′端有三脚架锚，目标对准，并与头，尾的方式(图1)中的探针进行杂交。一个扩展的三维网络，官能化的多个寡核苷酸，在红色(524纳米)，带蓝色的粉红色(569纳米)。
通过测量在650nm处的吸光度，作为温度的函数，绘制的熔化温度曲线的纳米粒子的聚集体，上面的熔融温度(Tm)(图4)示出了特征性的尖锐的过渡。这种熔化温度，对应到61℃，是由于从互补的DNA功能化金纳米粒子探针杂交的目标DNA的热解离。
在1个碱基对的不匹配的目标序列检测中，熔化温度下降了约20℃。另外1个碱基对不匹配的目标形成的纳米粒子聚集TM观察到41℃(图5)。这种减少在熔融温度可以解释的基础上的不匹配的基础上，不能形成氢键纳米粒子探针与相应的碱，造成不稳定的影响，形成不完整的双螺旋。这种不完整的双螺旋形成在需要较少的热能聚集形成从互补的目标相比寡核苷酸链接聚合变性。
表面等离子体激元共振(SPR)光谱单碱基非标记SNP检测
参阅图7a，上述的核糖核酸序列检测也可以通过表面等离子体激元共振(SPR)光谱实现，寡核苷酸探针的甲、乙和寡核苷酸的目标包括完全互补的，单个碱基不配的和非互补的单链DNA分子。
三硫代金刚烷寡核苷酸包被的金薄膜芯片的制备如下：将金薄膜芯片浸泡在三硫代金刚烷寡核苷酸溶液(10毫摩尔磷酸缓冲溶液，0.3当量氯化钠，pH7.4)中12小时。取出后用超净水洗涤，然后装入SPR仪。
杂交检验是通过注射5微升的寡核苷酸溶液，参阅图7b可以看到该方法具 有非常高的特异性。
以上仅是本发明的具体应用范例，对本发明的保护范围不构成任何限制。凡采用等同变换或者等效替换而形成的技术方案，均落在本发明权利保护范围之内。
Claims (9)
1.一种生物分子检测试剂盒，其特征在于，包括：
对选定靶标物具有特异性识别功能的生物分子基体，以及
连接在生物分子基体上的至少一个有机分子，其中至少一个有机分子选自三硫代金刚烷衍生物。
2.根据权利要求1所述的生物分子检测试剂盒，其特征在于，所述生物分子基体经所述三硫代金刚烷衍生物连接在选定基底上。
3.根据权利要求2所述的生物分子检测试剂盒，其特征在于，所述选定基底至少选自金属纳米粒子、金属薄膜芯片中的任一种，所述金属包括金。
4.根据权利要求1所述的生物分子检测试剂盒，其特征在于，所述生物分子基体至少选自核酸，多肽和蛋白质中的任一种。
5.根据权利要求1所述的生物分子检测试剂盒，其特征在于，所述三硫代金刚烷衍生物具有如下结构式：
其中，R包括任意基团。
6.根据权利要求5所述的生物分子检测试剂盒，其特征在于，所述三硫代金刚烷衍生物至少选自如下化合物中的任一种：
其中，
为分子间连接间隔，Y包括药物、氨基酸、多肽、代谢中间体、纳米构建物中的任意一种或两种以上的杂交体。
7.一种生物分子检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括：
提供对选定靶标物具有特异性识别功能的生物分子基体，以及
在所述生物分子基体上连接至少一个有机分子，并且其中至少一个有机分子选自三硫代金刚烷衍生物。
8.根据权利要求7所述生物分子检测试剂盒的制备方法，其特征在于，该方法包括：将所述生物分子基体经所述三硫代金刚烷衍生物连接在选定基底上，
所述选定基底至少选自金属纳米粒子、金属薄膜芯片中的任一种，所述金属包括金。
9.一种生物分子检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括：
提供一种以上寡核苷酸探针，该一种以上寡核苷酸探针至少具有与靶标DNA分子的局部区域互补的序列；以及
将其中至少一种寡核苷酸探针通过三硫代金刚烷衍生物连接至金基体表面。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310485815.9A CN103614458A (zh) | 2013-10-17 | 2013-10-17 | 生物分子检测试剂盒及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310485815.9A CN103614458A (zh) | 2013-10-17 | 2013-10-17 | 生物分子检测试剂盒及其制备方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103614458A true CN103614458A (zh) | 2014-03-05 |
Family
ID=50165173
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201310485815.9A Pending CN103614458A (zh) | 2013-10-17 | 2013-10-17 | 生物分子检测试剂盒及其制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103614458A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104391119A (zh) * | 2014-11-19 | 2015-03-04 | 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司 | 基于DNA分子构型变化的pH敏感元件的制备方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005003089A2 (en) * | 2003-07-01 | 2005-01-13 | The University Of Akron | 7-ethynyl-2,4,9-trithiaadamantane and related methods |
| WO2005120186A2 (en) * | 2003-07-01 | 2005-12-22 | The University Of Akron | Methyl 2,4,9-trithiaadamantane-7-carboxylate |
-
2013
- 2013-10-17 CN CN201310485815.9A patent/CN103614458A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005003089A2 (en) * | 2003-07-01 | 2005-01-13 | The University Of Akron | 7-ethynyl-2,4,9-trithiaadamantane and related methods |
| WO2005120186A2 (en) * | 2003-07-01 | 2005-12-22 | The University Of Akron | Methyl 2,4,9-trithiaadamantane-7-carboxylate |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| CHALERMCHAI KHEMTONG: "SYNTHESIS AND SUPRAMOLECULAR CHEMISTRY OF 2,4,9-TRITHIAADAMANTANE DERIVATIVES", 《DISSERTATION ABSTRACTS INTERNATIONAL》 * |
| DEODHAR, TEJAL J.,ET AL: "Tridentate sulfur ligand as a stable molecular surface anchor for preparation of DNA-functionalized gold nanoparticles: An approach toward a rapid and affordable diagnostic tool for detection of oligonucleotides", 《ABSTRACTS OF PAPERS OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104391119A (zh) * | 2014-11-19 | 2015-03-04 | 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司 | 基于DNA分子构型变化的pH敏感元件的制备方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU2013279049B2 (en) | 1,1 '-[[(substituted alkyl)imino]bis(alkylene)]bis-ferrocenes and their use in I electrochemical assays by labelling substrates of interest | |
| CN104910316A (zh) | 一种高分子比色纳米薄膜材料及其制备方法以及用于Fe3+和焦磷酸根检测方面的应用 | |
| CN103614459A (zh) | 非标记snp检测方法 | |
| CN103613603B (zh) | 三硫代金刚烷衍生物、其制备方法及应用 | |
| CN104726603A (zh) | 一种基于石墨烯量子点的分子信标传感器及其制备与应用 | |
| CN103614458A (zh) | 生物分子检测试剂盒及其制备方法 | |
| CN110627737B (zh) | 一种检测锌离子的水溶性苯并恶唑类荧光探针及制备方法和应用 | |
| CN104610366A (zh) | 一种十核锰配合物及其制备方法和应用 | |
| Yin et al. | Tridentate tripodal sulfur ligand as a stable molecular surface anchor for the fabrication of oligonucleotide-gold based label-free biosensors | |
| CN107417598B (zh) | 可用于G-四链体DNAs检测的荧光探针及其制备方法 | |
| US20240174792A1 (en) | Polymer | |
| CN112159381B (zh) | 一种aie型香豆素衍生物荧光探针及其制备方法和应用 | |
| EP1221466A2 (en) | Detecting reagent for double-stranded nucleic acid and double-stranded nucleic acid detecting method | |
| CN104478984A (zh) | 两亲性Tb(III)配合物及其制备方法以及螺旋状荧光纳米纤维的制备方法和应用 | |
| CN111138373B (zh) | 一种用于检测一氧化氮浓度的荧光探针及其合成方法和应用 | |
| CN109651336B (zh) | 一种基于药物分子的检测硫化氢荧光探针及其制备方法 | |
| Kim et al. | Bio-functionalized gold nanoparticles for surface-plasmon-absorption-based protein detection | |
| JP2004269532A (ja) | 導電性化合物、これを含む電極及びセンサー、並びに前記センサーを利用した標的分子の検出方法 | |
| CN106496281B (zh) | 一种多吡啶钌金属配合物及其制备方法和用途 | |
| EP4105295B1 (en) | Amphoteric fluorescent substance capable of being attached to biomaterials | |
| JP4309037B2 (ja) | 酸化還元活性を有する縫い込み型インターカレータ | |
| CN116178353B (zh) | 一种悬臂大环双核镍金属配合物、其制法和应用 | |
| KR101446316B1 (ko) | 화학적으로 표지된 핵산의 고효율 분리정제법 | |
| CN115745888B (zh) | 用于检测硫氮酸的萘酰亚胺衍生物荧光探针分子及其制备方法和应用 | |
| WO2009023287A1 (en) | Polymerized nile blue derivatives for plasticizer-free fluorescent ion optode microsphere sensors |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20140305 |